CN109781703A - 一种表面增强拉曼散射活性纳米光纤及其检测水中亚硝酸盐含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射活性纳米光纤(SERS)及其检测水中亚硝酸盐含量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)空心光纤的SERS活性修饰；(2)基于分子内共价组装的拉曼探针分子设计(3)空心光纤分别注入不同浓度NO₂ ^‑的衍生物中；(4)采用背向接受的方式接受拉曼信号，并对所得拉曼光谱进行图谱解析，以获得偶氮染料的拉曼光谱特征峰位置和拉曼峰的强度；(5)利用偏最小二乘回归法对获得的偶氮染料的拉曼光谱信息进行定量分析，间接检测NO₂ ^‑的浓度。本发明提供的水产养殖水体亚硝酸盐的检测方法的样品制备简单，检测速度快，实现了水产养殖水体亚硝酸盐的定量检测。

Description

一种表面增强拉曼散射活性纳米光纤及其检测水中亚硝酸盐 含量的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地说，涉及一种基于表面增强拉曼散射活性纳米光纤及其检测水中亚硝酸盐含量的方法。

背景技术

亚硝酸盐的含量是判断水体污染程度的重要标志。亚硝酸盐是水体中氮的一种存在形态，是蛋白质合成必不可少的来源。由于水产养殖水体中鱼饵和排泄物的存在，亚硝酸盐的含量会变化特别大，过量的亚硝酸盐也会引起水体的营养化，破坏水体生态平衡，还会对养殖水体对象直接产生毒性，影响其生长、发育，甚至造成大批死亡，严重影响水产养殖业产量，对人体也有不同程度的危害，并造成严重的经济损失。因此亚硝酸盐指标是水产养殖水体环境监测中必要的检测项目。我国人口众多，并且是世界上水产养殖大国，随着我国水产养殖集约化、自动化、标准化的快速发展，对水产养殖水体亚硝酸盐浓度进行在线检测，进而防范水体恶化、病害风险，确保水产品安全迫在眉睫。

传统的水产养殖水体亚硝酸盐的检测方法主要有滴定法、分光光度法、离子选择电极法等。在实际工作中，滴定法与分光光度法等多数方法易受水产养殖水体其他离子和悬浮物的的干扰，不适合用于连续监测水样，需要进行预处理，还需要用到有毒的化学药剂等；离子选择电极法，其电极易受污染，需频繁更换，并且抗干扰性差。综上所述，这些方法存在样品预处理困难、过程繁琐、检测时间长、不便于现场检测等不足，因此寻找一种快速、有效的水产养殖水体亚硝酸盐在线检测方法一直是一个世界难题，研究一种新型的水产养殖水体亚硝酸盐的检测方法具有重要的现实意义。

液芯光纤作为一种新型的光传输元件，没有固定的纤芯结构，用于拉曼检测时，只需要待测溶液，即为液芯光纤。原理是当液体折射率大于光纤折射率时，激发光射入液芯光纤后能在光纤内够形成全反射，使得激发光通过液体的有效光程远大于光纤的几何长度，所以与普通光纤相比，对拉曼光谱有增强作用。表面增强拉曼光谱已经被证明是一种非常强有力的痕量检测物质工具，其拉曼光谱强度可提高10³～10⁶倍。分子探针是指一类可以对某个化学信息给出特异性响应信号的功能分子，传感思路是其核心设计思想。共价组装类反应型分子探针的核心特点是待测底物能引发两个分子片段之间的反应,进而在检测体系原位组装出染料的推拉电子共轭链,并产生一个高灵敏的信号，从而可以间接的检测NO₂ ^-。将液芯光纤技术和表面增强拉曼光谱联合，可大幅提高拉曼光谱强度，因此可以作为检测水产养殖水体低浓度亚硝酸盐一种快速、有效的工具。

发明内容

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种表面增强拉曼散射活性纳米光纤(SERS)，由包括如下步骤的方法制备得到：将空心光纤的表面进行羟基化处理，然后置于邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液中，使其表面修饰有正电荷；再置于胶体金溶液中，形成表面增强拉曼散射活性修饰层。

其中，所选空心光纤的材料为无定型含氟树脂(Teflon-AF)、石英或玻璃光纤；

优选的，选择折射率低、透气性强、导热性弱的Teflon-AF材料，更优选Teflon-AF2400型号，其折射率为1.29。

其中，所述羟基化处理具体为：将所述空心光纤放入质量百分比为98％的H₂SO₄溶液和质量百分比为25～35％的H₂O₂溶液按2.5～3.5:1的体积比混合的混合液中煮沸40～60min。

优选地，将所述空心光纤放入质量百分比为98％的H₂SO₄溶液和质量百分比为30％的H₂O₂溶液按3:1的体积比混合的混合液中煮50min。

其中，所述邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液中邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯的质量百分比为4％～6％，优选为5％。

得到表面修饰有正电荷的空心光纤需要浸泡不少于50min。

优选地，所述胶体金溶液中金纳米颗粒的粒径为115～125nm。

优选的，所述胶体金溶液由如下方法制备得到：

1)将浓度为0.009～0.011％的氯金酸水溶液加热至沸腾，然后边搅拌边迅速加入浓度为0.8～1.2％的柠檬三钠水溶液，微沸20～40min，冷却后添加蒸馏水恢复到原体积，得40～50nm的金纳米颗粒的溶液；所述氯金酸水溶液与所述柠檬三钠水溶液的体积比为95～105:1；

2)采用种子生长法，采用抗坏血酸为还原剂、柠檬酸钠为保护剂，将所述40～50nm金纳米颗粒增长到115～125nm，得胶体金溶液。

本发明选择的120nm大尺寸纳米粒子能够很好地匹配785纳米激光的激发波长，并且容易引起共振增强，实现偶氮染料的SERS增强。该金纳米粒子的增强因子超过10⁸EF。

进一步优选的，所述胶体金溶液由如下方法制备得到：

将0.01％氯金酸水溶液置于250ml圆底烧瓶中加热至沸腾，然后搅拌迅速加入0.1％柠檬三钠水溶液，微沸30min，冷却以蒸馏水恢复到原体积，即得40～50nm的金纳米颗粒的胶体溶液；采用种子生长法，将40～50nm金纳米增长到115～125nm，得所述胶体金溶液；

本发明的另一目的是保护本发明所述的表面增强拉曼散射活性纳米光纤通过液芯光纤技术检测水中亚硝酸盐含量中的应用。

本发明所述的NO₂ ^-的拉曼分子探针由如下方法制备得到：对氨基苯硫酚与NO₂ ^-在酸性条件下生成重氮盐，所述重氮盐与萘胺发生偶合反应生成稳定的偶氮化合物，即为所述的NO₂ ^-的拉曼分子探针。

其反应方程式为：

这种拉曼分子探针具有较好的特异性识别能力，该探针分子上的氨基和巯基能够同时吸附到金纳米颗粒上，从而实现拉曼信号的显著增强。

本发明还保护本发明的光纤检测水体中NO₂ ^-的方法，包括以下步骤：

S1、配制NO₂ ^-标准溶液，按照本发明所述方法制备成拉曼分子探针，并将所述的拉曼分子探针注入本发明上述任一项所述的表面增强拉曼散射活性纳米光纤中，制作液芯光纤；

S2、将液芯光纤的一端放入盛有与步骤S1相同浓度的NO₂ ^-拉曼分子探针的烧杯中，另一端用拉曼光纤探头对液芯光纤进行检测，接受拉曼信号，获取光谱图；

S3、对于不同浓度的NO₂ ^-标准溶液重复步骤S1和S2，对采集的拉曼光谱数据进行预处理，利用偏最小二乘回归法对获得的不同浓度的拉曼分子探针的拉曼光谱信息进行定量分析，建立NO₂ ^-浓度和拉曼光谱强度的回归曲线；

S4、采用步骤S1和步骤S2的方式处理待测实际水样，根据步骤S2的回归曲线计算待测水样中NO₂ ^-含量。

其中，所述步骤2)和3)中采用背向接受的方式接受拉曼信号，即激发光的入射方向和拉曼光谱采集方向在液芯光纤的同一侧，其优势在于可以抑制部分噪声，减少噪声干扰。

研究表明，当激发光和拉曼光在液芯光纤中传输时，如果它们的强度均按单一指数形式衰减，那么输出拉曼光谱强度与液芯光纤的有效长度成正比。假设激发光和拉曼散射光在液芯光纤中呈E指数衰减，并且它们的损耗系数相同，则在背向散射几何中，拉曼光谱强度对液芯光纤长度变化遵循方程：

其中，I_R是拉曼散射光强度，I_L为激发光强度，K是与芯部液体的散射截面和光纤数值孔径相关的常数，e是自然常数。

此外，液芯光纤对光的损耗一般是由两部分组成的。一部分是空心光纤自身的物理、化学性质导致的，具体包括Teflon-AF光纤外表面的清洁程度、内表面粗糙度等因素有关；另一部分是芯部待检测的液体，不同的液体对激发光和散射光的吸收系数不同，对光的损耗也不同，而且还和待测溶液的浓度有一定关系。

所以用液芯光纤检测溶液时，光纤存在着一个最佳长度，研究表明，光纤最佳长度为：

本发明采用Teflon-AF材料为空心光纤，制得的液芯光纤，其选用的长度为1.8～2.2m，内径为240～260μm。

其中，利用液芯光纤使其强度显著增大。在液芯光纤中传播的拉曼散射光同时存在着增益和损耗，对于一种溶液，采用不同波长的激发光源会获得不同的最佳长度，以获取最佳的光谱数据。

其中，步骤2中所述检测采用的波长优选为波长785nm，功率为4mW，测试时间为5s。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明首先提出了一种表面增强拉曼散射活性纳米光纤，这种光纤可增强亚硝酸根拉曼光谱强度，适用于体中亚硝酸根的检测；

2)本方法在表面增强拉曼光谱基础上结合液芯光纤技术，提出了一种新的检测方法，这种方法可进一步提高了拉曼光谱强度，操作简单，样品无需前处理，检测灵敏度高，速度快，检测结果准确可靠。是一种快速检测水产养殖水体亚硝酸盐的新方法。

3)本发明的检测方法准确性高，不易受外界的影响，当水体中K⁺、Ca²⁺、Na⁺、NO₃ ^-、CO₃ ^2-、CH₃COO^-和PO₄ ^3-的浓度小于10^-4mol/L时，不会对NaNO₂生成的偶氮染料拉曼特征峰强度有较大影响。

附图说明

图1为本发明基于SERS和液芯光纤技术检测水中亚硝酸盐含量方法的流程图。

图2为本发明实施例中利用拉曼光纤探头对液芯光纤进行实际检测时的示意图。

图3为实施例2检测方法中测得的6种不同浓度NaNO₂生成偶氮染料的拉曼光谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1SERS活性纳米光纤及其制备方法

1.空心光纤材料的准备

液芯光纤只能检测折射率比光纤高的液体，并且液体的折射率和液体浓度呈一定的线性关系的。由于石英光纤只能用于测量折射率大于1.463(石英光纤折射率)，因此本实施例中空心光纤选择折射率低、透气性强、导热性弱的Teflon-AF材料。具体型号选用Teflon-AF 2400(折射率＝1.29)光纤，其内径为250μm。

本发明采用的Teflon-AF 2400的损耗系数是5×10^-3cm^-1，通过计算得出液芯光纤的最佳长度为2m左右。为了保证本发明的合理性，分别尝试过选择1m、2m、3m等不同长度的光纤，最终选择长度为2m的光纤。

2.拉曼光谱仪的选择

本发明中采用英国Renishaw公司RM-1000型显微激光拉曼光谱仪。其激光源为氩离子激光器(美国光谱物理公司)，激光波长785nm，聚焦在样品上的激光功率2～4mW，设定测试时间3s，叠加3次记录，测定分辨率0.5cm^-1，测定拉曼位移波数范围800～4000cm^-1；拉曼光纤探头是由美国InPhotonics公司生产的Y型光纤探头，与拉曼光谱仪结合使用。

3.空心光纤进行SERS修饰

(1)对空心光纤表面进行羟基化处理：将一定长度的空心光纤放入H₂SO₄和H₂O₂的混合液中煮50min(没有气泡)，得到表面羟基化的空心光纤。其中，所述H₂SO₄和H₂O₂的混合液是将浓度98％的H₂SO₄溶液和浓度30％的H₂O₂溶液按3:1的体积比混合得到的混合液。

(2)将表面羟基化处理后的空心光纤置于浓度5％的PDDA溶液中50min，使其表面修饰有正电荷。

(3)将表面修饰有正电荷的空心光纤置于胶体金溶液中24h，形成SERS活性修饰层。

其中，所述胶体的制备方法如下：将0.01％氯金酸水溶液200ml置于250ml圆底烧瓶中加热至沸腾，然后搅拌迅速加入1％柠檬三钠水溶液2ml，微沸30min，冷却以蒸馏水恢复到原体积，即得45nm的金纳米颗粒；采用种子生长法，采用抗坏血酸为还原剂、柠檬酸钠为保护剂，将45nm金种子增长到120nm。

(4)将光纤洗净，干燥后，即得SERS活性纳米光纤。

实施例2基于SERS和液芯光纤技术检测水中亚硝酸盐的含量

1、配制六种不同浓度的NO₂ ^-标准溶液。配制一定浓度的NO₂ ^-水溶液，并稀释成为1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、8μmol/L等六种不同浓度的水溶液，，并存放在6个离心管中，密封保存。选取海水水产养殖水体中的待测样品，使用国标法分光光度法检测出待测样品中亚硝酸盐的浓度，然后保存。

2、SERS液芯光纤的准备。如图2所示，先选取4μmol/L的NO₂ ^-经过重氮偶合反应后放入烧杯中，将制备好的光纤放入烧杯浸没到溶液中，然后用注射器将该溶液注入到制备好的光纤中，这样就制作好了实验所用的液芯光纤。

3、对SERS液芯光纤中溶液进行检测。调节液体温度，使其维持在20～30℃之间，使用与拉曼光谱仪配套的拉曼光纤探头，采用背向接受的方式接受拉曼信号，得到的拉曼光谱效果更好。如图2所示，在烧杯底部放置平面镜，从液芯光纤的上端进行检测，光谱采集方向和入射光方向在同一端。通过检测，获得偶氮化合物的拉曼光谱，并对所述拉曼光谱进行图谱解析，以获得在SERS液芯光纤中生成物的拉曼光谱特征峰的位置和拉曼光谱的强度。

4、然后依次选取其他浓度NO₂ ^-生成的偶氮染料，重复2、3步骤，得到SERS液芯光纤在检测该溶液低浓度或高浓度的拉曼光谱特性，如图3所示，从下往上分别是1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、8μmol/L的NaNO₂生成偶氮染料拉曼光谱图。对采集的拉曼光谱数据进行预处理，利用偏最小二乘回归法对获得的不同浓度的NO₂ ^-拉曼光谱信息进行定量分析，建立NO₂ ^-浓度和拉曼光谱强度的线性回归曲线。线性回归方程为：y＝213.5x+42.607，相关系数平方R²＝0.986。(其流程图见图1)

实施例3水体中其它干扰离子的影响

为了进一步证明本方法的实用性，本实施例测定多种常见阳离子和阴离子对实验结果的影响，本实验干扰离子为K⁺、Ca²⁺、Na⁺、NO₃ ^-、Cl^-、CO₃ ^2-、CH₃COO^-、PO₄ ^3-和SO₄ ^2-等。在实施例2步骤1中，选取浓度为1μmol/L NO₂ ^-标准溶液，分别加入10^-4mol/L的干扰离子，重复步骤2和3，获取拉曼光谱图。分析加入干扰离子后的偶氮化合物的拉曼特征峰位置和拉曼光谱强度的变化，实验结果表明10^-4mol/L K⁺、Ca²⁺、Na⁺、NO₃ ^-、CO₃ ^2-、CH₃COO^-和PO₄ ^3-不会对NaNO₂生成的偶氮染料拉曼特征峰强度有较大影响；当Cl^-浓度≥10^-4mol/L，会影响到偶氮染料的特征峰强度。检测结果如表1：

表1

实施例4水产养殖水体中亚硝酸盐含量的检测

选取待测海水养殖水体和工厂化养殖水体样品，重复实施例2步骤2、3，获得待测偶氮染料的拉曼光谱，对数据进行预处理，然后参照实施例2的线性回归方程，得到待测鱼塘样品中亚硝酸盐的浓度，并与国标法法检测得到的结果进行比较，结果表明，本方法检测水产养殖水体中亚硝酸盐的相对标准误差在3.0～5.0％之间，最低检测限0.15μmol/L，从而验证了本发明方法的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种表面增强拉曼散射活性纳米光纤，其特征在于，由包括如下步骤的方法制备得到：将空心光纤的表面进行羟基化处理；然后浸泡于邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液中，使其表面修饰有正电荷；再置于胶体金溶液中，形成表面增强拉曼散射的活性修饰层。

2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼散射活性纳米光纤，其特征在于，所述空心光纤的材料为无定型含氟树脂、石英或玻璃光纤。

3.根据权利要求1或2所述的表面增强拉曼散射活性纳米光纤，其特征在于，所述羟基化处理具体为：将所述空心光纤放入质量百分比为98％的H₂SO₄溶液和质量百分比为25％～35％的H₂O₂溶液按2.5～3.5:1的体积比混合的混合液中煮40～60min。

4.根据权利要求1～3任一所述的表面增强拉曼散射活性纳米光纤，其特征在于，所述邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液中邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯的质量百分比为4％～6％。

5.根据权利要求1-4任一项所述的表面增强拉曼散射活性纳米光纤，其特征在于，所述胶体金溶液中金纳米颗粒的粒径为115～125nm；

优选的，所述胶体金溶液由如下方法制备得到：

1)将浓度为0.009～0.011％的氯金酸水溶液加热至沸腾，然后边搅拌边迅速加入浓度为0.8～1.2％的柠檬三钠水溶液，微沸20～40min，冷却后添加蒸馏水恢复到原体积，得金纳米颗粒为40～50nm的胶体金溶液；所述氯金酸水溶液与所述柠檬三钠水溶液的体积比为95～105:1；

2)采用种子生长法，采用抗坏血酸为还原剂、柠檬酸钠为保护剂，将所述40～50nm金纳米颗粒增长到115～125nm，得所述胶体金溶液。

6.权利要求1-5任一项所述表面增强拉曼散射活性纳米光纤在通过液芯光纤技术检测水中亚硝酸盐含量中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，NO₂ ^-的拉曼分子探针由如下方法制备得到：对氨基苯硫酚与NO₂ ^-在酸性条件下生成重氮盐，所述重氮盐与萘胺发生偶合反应生成稳定的偶氮化合物。

8.一种基于表面增强拉曼散射活性纳米光纤检测水中亚硝酸盐含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配制NO₂ ^-标准溶液，按照权利要求7所述的方法分别制备成拉曼分子探针，并将所述的拉曼分子探针注入权利要求1-5任一项所述的表面增强拉曼散射活性纳米光纤中，制作液芯光纤；

S2、将液芯光纤的一端放入盛有与步骤S1相同浓度的NO₂ ^-拉曼分子探针的烧杯中，另一端用拉曼光纤探头对液芯光纤进行检测，接受拉曼信号，获取光谱图；

S3、对于不同浓度的NO₂ ^-标准溶液重复步骤S1和S2，对采集的拉曼光谱数据进行预处理，利用偏最小二乘回归法对获得的不同浓度的拉曼分子探针的拉曼光谱信息进行定量分析，建立NO₂ ^-浓度和拉曼光谱强度的回归曲线；

S4、采用步骤S1和步骤S2的方式处理待测实际水样，根据步骤S2的回归曲线计算待测水样中NO₂ ^-含量。

9.根据权利要求8所述的亚硝酸盐含量的方法，其特征在于，采用背向接受的方式接受拉曼信号；

所用显微激光拉曼光谱仪的可选激光波长785nm，633nm或532nm，功率2～4mW，测试时间4.5～5.5s；

优选为波长785nm。

10.根据权利要求8或9所述的亚硝酸盐含量的方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射活性纳米光纤的材料为Teflon-AF，其长度为1.8～2.2m，内径为240～260μm。