CN109776494A - 一种多靶点抗肿瘤活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种多靶点抗肿瘤活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其制备与应用。本发明提供了一种基于NAMPT/DNA两个靶点抑制的化合物,其结构通式如下式(I)所示。本发明所述的化合物,对NAMPT酶表现出了优秀的抑制活性,而且具有较强的体外抗肿瘤活性和优秀的体内抑瘤效果,且毒性小,表现出高效低毒的特点,是一种优越的抗肿瘤药物。本发明还提供了上述衍生物的制备方法,以及在制备NAMPT抑制剂、DNA抑制剂、NAMPT/DNA双靶点抑制剂和抗肿瘤药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种多靶点抗肿瘤活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其制备与应用。
背景技术
当前,癌症已经成为一种严重威胁人类健康和生命的疾病。目前临床上治疗恶性肿瘤主要采用联合用药的方法,但是这种方法存在很多缺陷,比如需要确证药物配伍合理性、可能发生的药物-药物相互作用和复杂的药代动力学性质等。
目前,靶向治疗已成为癌症治疗的重要方向,多采用一药一靶点的治疗模式。但是,肿瘤异于一般疾病,他的生长和存活不仅依赖于一种受体或一种信号通路的传导,这就使得单纯作用于一个靶点的策略并不能彻底杀死肿瘤细胞,并容易产生抗药性。于是,多种药物联合用药成为癌症临床治疗的主要手段,虽然在一定程度上能达到预期的治疗效果,但由于多种药物彼此间容易发生相互作用,如对药物的吸收和代谢产生影响,即使没有相互作用,这些药物通常也不能以它们单独应用时的剂量联用,为此,药物研究者借鉴多种药物联合用药的原理,采用药效团拼合的方法,将两种或两种以上的药效团拼合成一个分子,使这个分子本身或其代谢产物作用于两个或更多的靶点,从而产生协同作用以提高疗效。
烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,NAMPT)是一类重要的与代谢相关的抗肿瘤靶点,引起了研究者的广泛关注。NAD是肿瘤相关蛋白如PARPs、 sirtuins的底物,因此作为NAD合成的限速酶,NAMPT在哺乳动物中NAD补救路线中起着至关重要的作用。肿瘤细胞由于其快速的增殖生长需要消耗大量的NAD,这使得肿瘤细胞对NAMPT的抑制比正常细胞更为敏感。此外,正常细胞能够在烟酸磷酸核糖转移酶(nicotinic acidphosphoribosyl transferase,NAPRT)的催化下利用烟酸(nicotinicacid,NA) 作为底物合成NAD。但是肿瘤细胞中NAPRT活性缺失,造成NAD供应不足。研究表明,在前列腺癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤组织中发现NAMPT高表达,与肿瘤的发生发展紧密联系。因此,NAMPT已经成为肿瘤治疗的新机遇。
氮芥类药物目前仍是临床应用的一类重要的抗肿瘤药物,如苯丁酸氮芥(Chlorambucil) 和美法仑(Melphalan)。这类抗肿瘤药物的作用机制是其在体内能形成缺电子的乙撑亚胺离子,进而与生物大分子(如DNA、RNA或某些重要的酶类)中含有丰富电子的基团发生共价结合,使其丧失活性或使DNA分子发生断裂,从而达到抗肿瘤效果的。氮芥类药物具有抗瘤谱广、对肿瘤细胞杀伤力强等优点,但亦存在治疗效率低、选择性差、毒副作用大等缺点。
代表性NAMPT抑制剂有FK866和CH828。其中FK866作为第一代NAMPT小分子抑制剂,对NAMPT显示出较高的结合力(Ki=0.3nM),目前已经进入临床研究。此外,由于FK866存在毒副作用和耐药性,对实体瘤的治疗效果未见报道,单独用药时对肿瘤抑制作用较差。因此,临床上常采用联合用药的方式克服NAMPT抑制剂的这些缺陷。例如, NAMPT抑制剂能与多种药物(如PARP抑制剂、LDHA抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂等)产生协同作用,提高其抗肿瘤疗效。DNA损伤剂能够激活PARP,增加NAD的消耗,在肿瘤治疗中发挥着重要作用;NAMPT抑制剂可以阻断NAD的生成,两者联合用药发挥协同作用导致NAD大量缺失,未修复的DNA片段积累,最终导致肿瘤细胞死亡。将 FK866与氮芥类化合物相连接后,有望得到一类能够靶向NAMPT并能直接杀伤癌细胞的抗肿瘤药物。而且目前基于NAMPT/DNA多靶点抑制剂的研究几乎没有报道,这也使得这一发明具有较高的创新性。
发明内容
本发明的第一个目的是,针对现有技术中的不足,提供一种多靶点抗肿瘤活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐。
本发明的第二个目的是,提供如上所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂的应用。
本发明的第三个目的是,提供如上所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂的制备方法。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
一种多靶点抗肿瘤活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐,该化合物的结构通式如式(I)所示:
其中,R为酯基或酰胺基;
X为邻位、间位或对位的氧、氮、硫原子;
N为1到4个饱和烷烃链。
优选地,所述的药学上可接受的盐是其有机酸盐或无机酸盐;所述无机酸盐为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸;所述的有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸、鞣酸、枸橼酸、三氟醋酸、苹果酸或苯磺酸盐。
优选地,所述的药学上可接受的盐不含结晶水,或含一个或一个以上结晶水。
优选地,所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂选自:
化合物9c:(E)-N-(4-(1-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基)-3-(吡啶-3-基) 丙烯酰胺;
化合物7a:(E)-4-(1-(2-(二(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基3-(吡啶-3-基)丙烯酸酯;
化合物7b:(E)-4-(1-(3-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基3-(吡啶-3-基)丙烯酸乙酯;
化合物7c:(E)-4-(1-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基3-(吡啶-3-基)丙烯酸乙酯;
化合物9a:(E)-N-(4-(1-(2-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基)-3-(吡啶-3-基) 丙烯酰胺;
化合物9b:(E)-N-(4-(1-(3-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基)-3-(吡啶-3-基) 丙烯酰胺;
化合物12:4-(1-苯甲酰哌啶-4-基)丁基4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酸甲酯;
化合物14:N-(4-(1-苯甲酰哌啶-4-基)丁基)-4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺。
其结构式和核磁质谱数据如下表1所示:
表1.本发明优选化合物的结构式和核磁质谱数据
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
本发明提供如上所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐在制备抑制剂中的应用,所述的抑制剂为:NAMPT抑制剂、DNA抑制剂或NAMPT/DNA双靶点抑制剂。
另一方面,本发明提供一种如上所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤、抗癌药物方面的应用。
优选地,所述肿瘤或癌症为肺癌、骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌或胰腺癌。
优选地,所述药物为多靶点抗肿瘤药物,所述靶点为NAMPT/DNA双靶点。
优选地,所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐作为NAMPT 抑制剂、DNA抑制剂或NAMPT/DNA双靶点抑制剂。
优选地,所述药物还包括药学上常规的辅料,如乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂等。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
如上所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂7a~c、9a~c、12、14的制备方法,反应流程如下:
(1)化合物7a~c和9a~c的合成
Scheme1
Reagents and conditions:(a)CH3OH,SOCl2,2h;(b)nitrobenzoyl chloride,NaHCO3, CH2Cl2,4h,57%,over two steps;(c)Pd/C,H2,8h,82%;(d)ethylene oxide,alcohol,24h,51%; (e)SOCl2,CH2Cl2,reflux,6h,90%;(f)LiAlH4,THF,1h,43%;(g)EDC,DMAP,4h,65%;(h) MsCl,TEA,CH2Cl2,4h;(i)NaN3,DMF,24h;(j)Pd/C,H2,8h,54%,overthree steps;(g)EDC, DMAP,4h,53%.
以哌啶丁酸盐酸盐(化合物1)为起始原料,酯化后与不同取代位置的硝基苯甲酰氯反应得到中间体2a-c,化合物2a-c经过还原得到中间体3a-c,化合物3a-c在甲醇中与环氧乙烷反应,随后将羟基取代为氯,得到中间体5a-c,化合物5a-c在氢化锂铝作用下将酯键还原成羟基,得到关键中间体6a-c,化合物6a-c经过取代还原将羟基还原为氨基得到关键中间体8a-c,化合物8a-c与3-(3-吡啶基)丙烯酸进行缩合反应得到化合物9a-c,化合物6a-c 与3-(3-吡啶基)丙烯酸进行缩合反应得到化合物7a-c;
(2)化合物12和14的合成
Scheme2
Reagents and conditions:(a)CH3OH,SOCl2,2h;(b)benzoyl chloride,NaHCO3,CH2Cl2, 4h,71%,over two steps;(c)LiAlH4,THF,2h,41%;(d)Chlorambucil,EDC,DMAP,4h,65%; (e)EDC,DMAP,4h,61%.
起始原料1经过酯化再与苯甲酰氯反应得到中间体10,化合物10在氢化锂铝作用下酯键被还原成羟得到中间体11,化合物11中羟基还原成氨基取代中间体13,化合物11、13分别与chlorambucil进行缩合反应得到目标化合物12和14。
本发明优点在于:
1、本发明的化合物经酶抑制试验,发现本发明的大多数化合物对NAMPT表现出优秀的抑制活性,尤其是化合物9a、9b表现出最好的抑酶活性,与阳性对照药FK866相当。
2、经体外抗肿瘤活性测试,发现本发明的化合物具有广谱抗肿瘤活性,尤其化合物9a 和9b是对于骨肉瘤(U2OS、Saos-2)和肝癌细胞株(HLF)的体外抗肿瘤活性与FK866 相当,显著优于chlorambucil,在进一步的体外抗肿瘤活性试验中,发现本发明的化合物9a、9c对PC-3和CT-26肿瘤株的抑制活性与阳性对照药FK866相当,显著优于chlorambucil,对HepG2和PANC-1肿瘤株的抑制活性显著优于阳性对照药FK866。
3、本发明的化合物在体内抗肿瘤试验中,对肿瘤生长的抑制效果显著高于相同剂量下阳性药FK866和chlorambucil,且毒性小,表现出高效低毒的特点,是一种优越的抗肿瘤药物。
4、本发明为深入研究和开发新结构类型抗肿瘤药物开辟了新的途径,提供了新的策略。
附图说明
图1是化合物9a和9b对CT-26正常小鼠移植瘤作用。其中,(A)肿瘤体积变化趋势;(B)给药结束后肿瘤重量;(C)给药结束后肿瘤照片;(D)小鼠体重变化趋势。*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001。
图2是化合物9a和9b对鼠结肠癌CT-26裸鼠移植瘤作用。其中,(A)肿瘤体积变化趋势;(B)给药结束后肿瘤重量;(C)给药结束后肿瘤照片;(D)裸鼠体重变化趋势。*P <0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围;此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
“抑制剂”是指阻断或以其它方式干扰特定的生物活性的分子如化合物、药物、酶活化剂或激素。
本申请使用的术语“治疗”意在表示疾病发展的延缓、防止疾病发展和/或降低将发展或预期发展的该症状的严重性。因此,这些术语包括改善已有的疾病症状、预防另外的症状、改善或预防症状的潜在的代谢原因、抑制障碍或疾病。
“药学上可接受”或“药理上可接受”是指并非在生物学上或其它方面实质上不希望的物质,即可将所述物质给药于个体,而不会导致任何实质上不希望的生物影响或以有害的方式与包含这种物质的组合物的任何组分相互作用。
辅料包括药剂学中的任何常用剂型,并应基于相容性和希望的剂型的释放分布性质来选择。示例性载体物质包括,例如,粘合剂、助悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂等。"药学上可相容的载体物质"可包括,例如,阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、糊精麦芽糖复合剂、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。
实施例一(E)-N-(4-(1-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基)-3-(吡啶-3-基) 丙烯酰胺的制备
(1)制备中间体2c:4-(1-(4-硝基苯甲酰基)哌啶-4-基)丁酸甲酯
取化合物1(1.0g,4.8mmol)溶于甲醇(30mL)中,再滴加SOCl2(1.1g,9.6mmol),反应4h。反应结束后,减压蒸干溶剂,再溶于二氯甲烷(30mL)中,加入4-硝基苯甲酰氯(1.8g,9.6mmol)、NaHCO3(0.8g,9.6mmol),室温反应过夜。反应结束后,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为二氯甲烷/甲醇混合溶剂(100:1),得中间体2c,无色油状物,计0.9g,收率57%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:7.25(d,J=8.64Hz,2H),6.75(d,J=8.64Hz,2H),3.56(s,3H),2.74(t,J=7.54Hz,2H),2.26(t,J=7.54Hz,2H),1.78-1.89(m,3H),1.62-1.74(m,2H), 1.40-1.56(m,4H),0.97-1.00(m,2H).MS(ESI positive):m/z[M+H]+:335.36.
(2)制备中间体3c:4-(1-(4-氨基苯甲酰基)哌啶-4-基)丁酸甲酯
取化合物2c(0.8g,2.4mmol)溶于甲醇(20mL)中,加入Pd/C(0.24g),H2反应过夜。反应结束后,滤去Pd/C,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为二氯甲烷/ 甲醇混合溶剂(100:3),得中间体3c,淡黄色油状物,计0.6g,收率82%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:7.26(d,J=8.12Hz,2H),6.70(d,J=8.12Hz,2H),6.15(s,2H),3.54(s,3H),2.70(t,J=7.36Hz,2H),2.23(t,J=7.36Hz,2H),1.77-1.85(m,3H),1.60-1.71(m,2H),1.41-1.55(m,4H),0.95-1.02(m,2H).MS(ESI positive):m/z[M+H]+:305.47.
(3)制备中间体5c:4-(1-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁酸甲酯
取化合物3c(0.6g,0.2mmol)溶于甲醇(5mL)中(安瓿瓶),-78℃下加入环氧乙烷(2mL),升温至50℃反应24h。反应结束后,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为二氯甲烷/甲醇混合溶剂(100:5),得中间体4c,淡黄色油状物,计0.4g,收率 51%。取化合物4c(0.4g,1.0mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中,滴加SOCl2(0.25g,2mmol),回流反应6h。反应结束后,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(1:1),得中间体D 5c,棕色油状物,计0.39g,收率90%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:7.26(d,J=8.23Hz,2H),6.75(d,J=8.23Hz,2H),3.75(s,7H),3.58(s,3H),2.78-2.91(m,2H),2.29(t,J=7.42Hz,2H),1.66(d,J=11.42Hz,2H),1.42-1.57(m,4H),0.96-1.03(m,2H).MS(ESI positive):m/z[M+H]+:430.45.
(4)制备中间体6c:(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)(4-(4-羟丁基)哌啶-1-基)甲酮
取化合物5c(0.38g,0.87mmol)溶于干燥四氢呋喃(20mL)中,加入氢化锂铝(0.04g,0.87mmol),室温反应1h。反应结束后,加入饱和食盐水(100mL),乙酸乙酯(50mL ×3)萃取,合并有机层,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为二氯甲烷/甲醇混合溶剂(100:2),得中间体6c,淡黄色油状物,计0.16g,收率 43%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:7.26(d,J=8.97Hz,2H),6.75(d,J=8.97Hz,2H),4.33-4.45(m,2H),3.73(s,7H),3.52-3.61(m,4H),3.38(t,J=7.13Hz,3H),2.82-3.05(m,2H), 2.66-2.77(m,2H),1.61-1.72(m,2H),1.32-1.42(m,2H),1.23-1.29(m,4H),1.01-1.11(m,2H). MS(ESI positive):m/z[M+H]+:402.34.
(5)制备中间体8c:(4-(4-氨基丁基)哌啶-1-基)(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)甲酮
取化合物6c(0.15g,0.37mmol)溶于干燥DMF(10mL)中,再加入甲磺酰氯(0.09 g,0.74mmol),再滴加几滴三乙胺,室温反应过夜。反应结束后,加入饱和食盐水(100mL),乙酸乙酯(50mL×3)萃取,合并有机层,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(1:1),得黄色油状物,直接投入下一步。将上一步所得粗品溶于DMF(5mL)中,再加入NaN3(0.12g,1.8mmol)室温反应过夜。反应结束后,加入饱和食盐水(100mL),乙酸乙酯(50mL×3)萃取,合并有机层,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干。残留物用柱色谱纯化,流动相为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(2:1),得淡黄色油状物,直接投入下一步。将上一步所得粗品溶于甲醇(10mL) 中,加入Pd/C(0.4g),H2反应过夜。反应结束后,滤去Pd/C,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为二氯甲烷/甲醇混合溶剂(100:10),得中间体8c,白色固体,计0.08 g,收率54%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:7.24(d,J=8.46Hz,2H),6.74(d,J=8.46Hz,2H),4.06-4.13(m,2H),3.74(s,6H),2.82(s,2H),2.79-2.82(m,2H),2.71(s,2H),2.39-2.48(m,3H), 1.62-1.67(m,2H),1.41-1.50(m,3H),1.22-1.28(m,6H),1.00-1.049m,2H),0.92(t,J=6.91Hz, 4H).MS(ESI positive):m/z[M+H]+:401.72.
(6)制备目标产物9c
取化合物8c(0.08g,0.2mmol)溶于DMF(5mL)中,加入3-(3-吡啶基)丙烯酸(0.036g,0.24mmol)、HATU(0.09g,0.24mmol)、DIPEA(76μL,室温反应4h。反应结束后,加入饱和食盐水(100mL),乙酸乙酯(50mL×3)萃取,合并有机层,无水硫酸钠干燥,抽滤,减压蒸干溶剂。残留物用柱色谱纯化,流动相为二氯甲烷/甲醇混合溶剂(100:5),得目标化合物9c,黄色固体,计0.07g,收率53%。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:8.74(d,J=0.9Hz,1H),8.53(dd,J=1.3Hz,4.7Hz,1H),8.16(t,J=5.5Hz,1H),7.93-8.00(m,1H),7.24(d,J=3.0Hz,2H),6.65-6.82(m,3H),3.94-4.26(m,2H),3.23-3.44(m,4H),3.17(q,J=6.0Hz,2H),2.68-2.95(m,4H),1.65(d,J= 11.8Hz,2H),1.38-1.51(m,3H),1.22-1.37(m,6H),0.97-1.06(m,4H).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6,TMS)δ:169.20,164.27,163.41,148.92,147.99,147.34,144.81,144.70,134.57,131.21,129.05,124.88,124.34,123.85,110.88,51.85,40.94,38.66,35.52,35.40,32.04,29.21, 29.16,23.47.MS(ESI positive):m/z[M+H]+:531.67.
化合物7a~c、9a~b、12和14制备方法参照实施例一。
实施例二化合物7a~c、9a~c、12和14酶抑制活性和体外抗肿瘤活性
1化合物7a~c、9a~c、12和14对NAMPT酶抑制测试
以下所述的酶是特指NAMPT。
1.1NAMPT酶的制备
将转化有重组质粒(NAMPT-pET28a+)的BL21(DE3)plysS细胞接种于2×YT培养基(37 μg/mL氯霉素和100μg/mL卡那霉素)中。通过诱导,离心收集菌体,并裂解细胞,把清液与Ni-NTA柱(购自QIAGEN公司)在冰上振摇孵育洗去杂蛋白,最后洗脱目的蛋白,最终拿到蛋白。
1.2实验方法
先将0.5μL化合物的不同浓度溶液加于96孔板,然后加入20μL酶反应混合溶液(除底物之外的酶反应组分),于室温孵育5min后,在加入4.5μL底物NAM溶液,37℃反应15min后,并于95℃加热1min终止酶反应;
将反应液在冰上冷却后,依次加入10μL 2M KOH和20%苯乙酮,混匀后于0℃作用2min,加入45μL 88%甲酸,37℃孵育10min;
酶标仪激发波长设置为382nm、发射波长设置为445nm测量荧光值;
依据公式计数抑制率:E=R/(1+(C/IC50)S)+B(其中E为抑酶活性,C为化合物浓度,R、IC50、S、B为待拟合的参数),在origin软件中将抑酶活性数据与化合物浓度的曲线进行拟合,求出化合物的IC50。
1.3实验结果
结果如表1所示,除化合物12和14(IC50>2μM)外,大多数化合物对NAMPT表现出优秀的抑制活性(IC50范围:0.15-37.51nM),有5个化合物(7a-c和9a-c)的IC50值低于5nM,尤其是化合物9a、9b表现出最好的抑酶活性(IC50分别为0.16nM和0.15nM),与阳性对照药FK866(IC50=0.15nM)相当。
表1目标化合物NAMPT抑制活性
2化合物7a~c、9a~c、12和14体外抗肿瘤活性测试
2.1实验准备
1)样品配制
用DMSO(Merck)溶解成后,加入PBS(-)配成1000μM的溶液或均匀的混悬液,然后用含DMSO的PBS(-)稀释。样品终浓度100、10、1、0.1、0.01、0.001μM。
2)细胞株
A549(肺癌细胞)、NCI-H1299(肺癌细胞)、U2OS(骨肉瘤细胞)、Saos-2(骨肉瘤细胞)、HCT-116(结肠癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)、HLF(肝癌),PC-3(前列腺癌)、HepG2 (肝癌)、PANC-1(胰腺癌)和CT-26(结肠癌),均由本实验室冻存和传代。
3)培养液
DMEM或PRMI1640+10%FBS+双抗。
2.2实验方法
CCK-8法。96孔板每孔加入浓度为6-10×104个/mL的细胞悬液100μL,置37℃,5%CO2培养箱内。24小时后,加入样品液,10μL/孔,设三复孔,37℃,5%CO2作用48小时。每孔加入10μLCCK-8溶液,然后37℃下避光孵育1-4小时后,用全波长多功能酶标仪测 450nm OD值。
2.3实验结果
实验结果显示这些多靶点化合物具有广谱抗肿瘤活性,其IC50值在0.001-86μM之间,在所有测试肿瘤株中,所有目标化合物对骨肉瘤(U2OS、Saos-2)和肝癌细胞株(HLF) 的体外抗肿瘤活性要优于其他四种肿瘤细胞株(表2)。其中化合物9a和9b对两种骨肉瘤细胞株(U2OS、Saos-2)和肝癌细胞株(HLF)的IC50值均小于0.001μM,与FK866相当 (IC50<1nM),显著优于chlorambucil(IC50>100μM)。化合物9c的抑制活性也达到了纳摩尔级(IC50范围:0.13~0.52μM)。这表明化合物9a-c对骨肉瘤细胞和肝癌细胞株具有较好的选择性。
表2目标化合物体外抗肿瘤活(μM)
鉴于化合物9a和9b在分子和细胞水平具有优秀的靶点抑制和体外抗肿瘤活性,为测试其对肿瘤细胞株的选择性,进一步选取了四种常见的肿瘤细胞株(前列腺癌PC-3、肝癌HepG2、胰腺癌PANC-1和结肠癌CT-26)对化合物9a和D9b进行体外抗肿瘤活性测试,FK866和chlorambucil为阳性对照药。
结果如表3所示,化合物9a和9b对PC-3和CT-26肿瘤株的抑制活性均达到纳摩尔级(对PC-3肿瘤株的IC50分别为0.02μM和0.01μM;对CT-26肿瘤株的IC50分别为0.022μM 和<0.001μM),与阳性对照药FK866相当(对PC-3的IC50为0.01μM;对CT-26的IC50为0.22μM)。上述结果表明,化合物9a和9b对前列腺癌和结肠癌肿瘤株具有较好的抑制活性。
表3目标化合物体外抗肿瘤活性(μM)
实施例三目标化合物体内抗肿瘤效果
1化合物9a和9b对鼠结肠癌CT-26正常小鼠移植瘤的作用
根据体外抗肿瘤活性结果,首先以鼠结肠癌CT-26正常小鼠移植瘤模型评价化合物9a 和9b的体内抗肿瘤活性,FK866和chlorambucil为阳性对照药。
给药剂量化合物9a、FK866和chlorambucil为5mg/kg,一天一次;化合物9b为2mg/kg,一天一次;连续腹腔注射给药14天。结果显示(图1),化合物9a和9b均能有效的抑制肿瘤生长,抑瘤率分别为71.1%和53.5%,明显高于阳性对照药(FK866抑瘤率为18.9%,chlorambucil为21.6%),其中化合物9a体内抗肿瘤活性优于9b,且均具有统计学意义(P<0.05)。此外,给药过程中小鼠体重未明显下降,表明化合物9a和9b的毒性较小。
2化合物9a和9b对鼠结肠癌CT-26裸鼠移植瘤的作用
以鼠结肠癌CT-26裸鼠移植瘤模型评价化合物9a和9b(相同的给药方式、给药剂量) 的体内抗肿瘤活性。结果显示(图2),化合物9a依然表现出有效的肿瘤生长抑制作用,抑瘤率为52.4%,优于FK866给药组(抑瘤率为27.6%)和chlorambucil给药组(抑瘤率为13.4%);而9b则几乎失去抑制作用(抑瘤率仅为21.9%)。
对比两次体内实验发现,化合物9a和9b对正常小鼠肿瘤的抑瘤率明显高于裸鼠。这结果表明两者可能具有激活小鼠免疫系统的作用,导致在正常小鼠中表现出优于免疫力低下的裸鼠的抗肿瘤活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种多靶点抗肿瘤活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐,其特征在于,该化合物的结构通式如式(I)所示:
其中,R为酯基或酰胺基;
X为邻位、间位或对位的氧、氮、硫原子;
N为1到4个碳的饱和烷烃链。
2.根据权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐,其特征在于,所述的药学上可接受的盐是其有机酸盐或无机酸盐;所述的无机酸盐为盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸;所述的有机酸为乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸、鞣酸、枸橼酸、三氟醋酸、苹果酸或苯磺酸盐。
3.根据权利要求2所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐,其特征在于,所述的药学上可接受的盐不含结晶水,或含一个或一个以上结晶水。
4.根据权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐,其特征在于,所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂选自:
(E)-N-(4-(1-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺;
(E)-4-(1-(2-(二(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基3-(吡啶-3-基)丙烯酸酯;
(E)-4-(1-(3-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基3-(吡啶-3-基)丙烯酸乙酯;
(E)-4-(1-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基3-(吡啶-3-基)丙烯酸乙酯;
(E)-N-(4-(1-(2-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺;
(E)-N-(4-(1-(3-(双(2-氯乙基)氨基)苯甲酰基)哌啶-4-基)丁基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺;
4-(1-苯甲酰哌啶-4-基)丁基4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酸甲酯;
N-(4-(1-苯甲酰哌啶-4-基)丁基)-4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)丁酰胺。
5.权利要求1~4任一所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐在制备抑制剂中的应用,其特征在于,所述的抑制剂为:NAMPT抑制剂、DNA抑制剂或NAMPT/DNA双靶点抑制剂。
6.权利要求1~4任一所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤、抗癌药物方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述肿瘤和癌症为肺癌、骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌或胰腺癌。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂及其药学上可接受的盐作为NAMPT抑制剂、DNA抑制剂或NAMPT/DNA双靶点抑制剂。
9.权利要求4中烟酰胺磷酸核糖转移酶氮芥类抑制剂7a~c、9a~c、12、14的制备方法,其特征在于,反应流程如下:
(1)化合物7a~c和9a~c的合成
以哌啶丁酸盐酸盐(化合物1)为起始原料,酯化后与不同取代位置的硝基苯甲酰氯反应得到中间体2a-c,化合物2a-c经过还原得到中间体3a-c,化合物3a-c在甲醇中与环氧乙烷反应,随后将羟基取代为氯,得到中间体5a-c,化合物5a-c在氢化锂铝作用下将酯键还原成羟基,得到关键中间体6a-c,化合物6a-c经过取代还原将羟基还原为氨基得到关键中间体8a-c,化合物6a-c与3-(3-吡啶基)丙烯酸进行缩合反应得到化合物7a-c,化合物8a-c与3-(3-吡啶基)丙烯酸进行缩合反应得到化合物9a-c;
(2)化合物12和14的合成
起始原料1经过酯化再与苯甲酰氯反应得到中间体10,化合物10在氢化锂铝作用下酯键被还原成羟得到中间体11,化合物11中羟基还原成氨基取代中间体13,化合物11、13分别与chlorambucil进行缩合反应得到目标化合物12和14。
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