CN109771427A - 一种通过提高依克多因光学纯度来增强其安全性和抗炎抗过敏活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过提高依克多因光学纯度来增强其安全性和抗炎抗过敏活性的方法。本发明选取两种不同光学纯度的依克多因，其比旋光分别为160和180，分别命名为Ectoin‑160和Ectoin‑180，测试了其对角质细胞的毒性和抗炎活性。实验证明Ectoin‑180比Ectoin‑160具有更低的细胞毒性；同时，抑制炎症的Ectoin‑160和
Description
技术领域
本发明涉及一种具有生理活性的氨基酸衍生物的安全性和抗炎抗过敏活性的评测，具体地说是一种增强(S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸(依克多因)的安全性和抗炎抗过敏活性的方法。
背景技术
皮肤过敏和炎症是常见的皮肤问题，这类疾病通常是由于皮肤受到各种刺激，像动物毛发、环境、空气、花粉、化学制剂、化妆品等等因素引发的。在世界范围内，特别是中国，20％的人有过敏性皮炎的症状，并且还在逐渐增多。皮肤过敏对皮肤伤害比较严重，如何治疗和预防是一项重要的议题。使用处方药内服或者外用都有可能取得不错的效果，但是也伴随着一些副作用。如果在日常皮肤护理时注意这一问题，选用含有抗过敏、抗炎成分的护肤品就可以做到事半功倍。因此含抗过敏、抗炎成分的护肤品需求量逐年增大，但是该市场也是鱼龙混杂，良莠不齐。很多护肤品添加一些非天然的激素，导致严重的副作用。
(S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸(依克多因，Ectoin)来源于高嗜盐菌(Halomonas Elongata)，是一种天然的小分子氨基酸衍生物，具有一个手性碳原子。在高盐、高温、高紫外线辐射的极端条件下，依克多因使嗜盐菌免受伤害。依克多因是耐盐生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质。体内外研究表明依克多因能通过体内合成和体外转运两种途径在细胞内积累，调节细胞内外渗透压平衡。因此依克多因具有渗透压调节作用以及稳定蛋白质水合层，保护酶、DNA等生物大分子和细胞膜结构的作用，可以帮助细胞及动植物抵抗冷冻、干旱、高温、高盐、辐射等各种不利环境。我们最近的研究表明光学活性的依克多因具有显著的抗过敏、抗炎效果，并且光学纯度越高，该效果越明显。
发明内容
本发明主要是通过提高依克多因光学纯度，从而降低依克多因的细胞毒性，从而提高其安全性，同时增强其抗炎抗过敏活性。
本发明选取两种不同光学纯度的依克多因，其比旋光分别为160和180，分别命名为Ectoin-160和Ectoin-180，测试了其对角质细胞的毒性和抗炎活性。实验证明Ectoin-180比Ectoin-160具有更低的细胞毒性；同时，抑制炎症抗过敏的Ectoin-160和Ectoin-180的最小浓度分别为0.75％和0.5％，表明依克多因光学纯度越高，其抗炎抗过敏活性越高。
本发明的有益效果是对本发明涉及的通过提高依克多因光学纯度来增强其安全性和抗炎抗过敏活性的方法属于首次公开。对于进一步将其应用于化妆品的开发具有良好的前景。
附图说明
1、图1为Ectoin-160对角质细胞的毒性测试
2、图2为Ectoin-180对角质细胞的毒性测试
3、图3为不同浓度Ectoin-160对TNF-α抑制
4、图4为不同浓度Ectoin-180对TNF-α抑制
5、图5为不同浓度Ectoin-160对PGE2的抑制
6、图6为不同浓度Ectoin-180对PGE2的抑制
7、图7为不同浓度Ectoin-160对IL-6的抑制
8、图8为不同浓度Ectoin-180对IL-6的抑制
9、图9为不同浓度Ectoin-160对IL-8的抑制
10、图10为不同浓度Ectoin-180对IL-8的抑制
具体实施方式
本发明涉及的具体化合物依克多因，通过以下实施例对本发明中的化合物的生物学效应验证做进一步详细的说明，下述非限制性实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1.细胞毒性的评价：
实验材料：
细胞系：HaCat细胞。
培养液：含10％胎牛血清的MEM培养基。
培养条件：37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
溶液及对照：对照组：培养液；样品组(TA)：用培养液稀释至测试浓度； MTT溶液：5mg/mL。
试验步骤：
细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，调整细胞浓度为0.8～1.0×105个 /mL，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，培养24h。
暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同浓度的测试样品，以及阴性对照或阳性对照。培养箱孵育24±0.5h。相差倒置显微镜下观察细胞形态和特性。
MTT测试：每孔加入20μL MTT溶液，培养箱孵育3±0.5h。去除孔中液体，每孔加入100μL DMSO，置于振荡器振荡10-15min后，在酶标仪570 nm波长处测定吸收值。
数据分析：
各组数据以均值±标准差表示，以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(Viability)。
实施例2.体外抗炎抗过敏评价
实验材料：
细胞系：HaCat细胞。
培养基：含10％FBS的MEM培养基，2-8℃保存2周。测试条件：温度37±0.5℃，湿度>90％，5％CO2浓度.
待测物质(TA)：用培养液稀释至所需测试浓度.
LPS(Sigma)：用超纯水稀释至1mg/mL，0℃保存。
试剂盒：IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2的ELISA。
试验步骤：
第一步，常规培养细胞，将细胞以密度为2.0～3.0×105个/mL/孔接种于12 孔板，返回培养箱培养18-24h。
第二步，取出培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1mL含不同浓度的测试样品的培养液，对照组加入以LPS(10μg/mL)作为刺激物，空白组加入培养液，培养24±1h。
第三步，去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h。
第四步，收集上清液，-80℃保存，细胞因子采用ELISA试剂盒进行测定。
数据分析：数据以均值±标准差表示，数据采用SPSS进行分析，如果 p<0.05考虑差异具有统计学意义.
实施例3.Ectoin-160和Ectoin-180对角质细胞的毒性测试
根据实施例1的方法进行Ectoin-160和Ectoin-180对角质细胞的毒性测试，如图1和2所示，当依克多因浓度达到1.2％时，使用Ectoin-160处理的角质细胞相对活性为71％，使用Ectoin-180处理的角质细胞相对活性达到78％，所以Ectoin-180比Ectoin-160拥有更低的细胞毒性，即更高的安全性。
实施例4.Ectoin-160和Ectoin-180对角质细胞的抗炎抗过敏活性。
这一测试所针对的炎症因子主要包括TNF-α(肿瘤坏死因子)、PGE2(前列腺素E2)、IL-6(白介素6)、以及IL-8(白细胞介素-8)等。根据实施例2 的实验步骤进行测试，其结果如下：
1.对炎症因子TNF-α表达的影响：
图3为不同浓度的Ectoin-160对TNF-α表达量的影响，从柱形图来看，Ectoin-160浓度从0.25％到0.75％，肿瘤坏死因子的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-160对TNF-α的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.5％；图4为不同浓度的Ectoin-180对TNF-α表达量的影响，从柱形图来看，Ectoin-180浓度从0.25％到0.75％，肿瘤坏死因子的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-180对TNF-α的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.5％。
2.对PGE2表达的影响：
图5为不同浓度的Ectoin-160对PGE2表达的影响，从柱形图来看，Ectoin-160浓度从0.25％到0.75％，PGE2的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-160对PGE2的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.75％；图6为不同浓度的Ectoin-180对PGE2 表达的影响，从柱形图来看，Ectoin-180浓度从0.25％到0.75％，PGE2 的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-180 对PGE2的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.5％。这也说明了Ectoin-180比Ectoin-160具有更高的抑制PGE2表达的效率。
3.对IL-6表达的影响：
图7为不同浓度的Ectoin-160对IL-6表达的影响，从柱形图来看，Ectoin-160浓度从0.25％到0.75％，IL-6的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-160对IL-6的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.75％；图8为不同浓度的Ectoin-180对IL-6 表达的影响，从柱形图来看，Ectoin-180浓度从0.25％到0.75％，IL-6 的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-180 对IL-6的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.5％。这也说明了Ectoin-180比Ectoin-160具有更高的抑制IL-6表达的效率。
4.对IL-8表达的影响：
图9为不同浓度的Ectoin-160对IL-8表达的影响，从柱形图来看，Ectoin-160浓度从0.25％到0.75％，IL-8的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-160对IL-8的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.75％；图10为不同浓度的Ectoin-180对 IL-8表达的影响，从柱形图来看，Ectoin-180浓度从0.25％到0.75％， IL-8的表达量都比0％的时候小，而且随浓度增加而减少，说明Ectoin-180对IL-8的表达有抑制作用，其最小抑制浓度为0.25％。这也说明了Ectoin-180比Ectoin-160具有更高的抑制IL-8表达的效率。
Claims (4)
1.高光学纯度的氨基酸衍生物(S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸(依克多因)在皮肤抗炎抗过敏中的应用和安全性评价。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过提高依克多因光学纯度(或比旋光值)来增强其安全性和抗炎抗过敏活性。
3.如权利要求1和2所述的安全性，其特征在于，提高依克多因的光学纯度(或比旋光值)具有更低的细胞毒性。
4.如权利要求1和2所述的抗炎抗过敏活性，其特征在于，提高依克多因的光学纯度(或比旋光值)具有更高的抗炎抗过敏活性。
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| CN112569145A (zh) * | 2019-09-27 | 2021-03-30 | 默克专利股份有限公司 | 依克多因和灵芝提取物对皮肤炎症的协同作用 |
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| DE19933463A1 (de) * | 1998-07-10 | 2000-01-13 | Beiersdorf Ag | W/O-Emulsionen mit einem Gehalt an Ectoinen |
| CN108778250A (zh) * | 2016-03-07 | 2018-11-09 | 乌尔萨法姆药物有限责任公司 | 眼科用组合物 |
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