CN109771410B - 紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的用途，属于制药领域。细胞试验结果表明：紫草酸对乙肝病毒(HBV)DNA及乙肝e抗原(HBeAg)的表达均有显著抑制作用，且呈剂量依赖性，因此具有抗HBV的活性。紫草酸能促进自噬体的形成和自噬溶酶体的降解，其抗HBV的分子机制是通过促进肝细胞发生完整的细胞自噬来干扰HBV诱导的不完整的自噬过程，从而抑制HBV的复制。以上结果表明，紫草酸对HBV具有较好的抑制作用，具备制备抗乙型肝炎等相关疾病药物的潜力。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，涉及紫草酸在制备抗病毒药物尤其是抗乙肝病毒药物中的新用途。
背景技术
乙肝病毒(HBV)是一种能导致机体产生急性或慢性肝炎的嗜肝性病毒。全世界约80％的肝癌是由乙型肝炎(简称乙肝)引发的，严重威胁着人类的健康。HBV是一种DNA病毒，属嗜肝DNA病毒科，是直径42nm的球形颗粒，又名Dane颗粒，有外壳和核心两部分。外壳厚7-8nm，占据有乙肝表面抗原(HBsAg)；核心直径27nm，含有部分双链、部分单链的环状DNA，DNA聚合酶，乙肝核心抗原(HBcAg)及乙肝e抗原(HBeAg)。HBV DNA的基因组约含3200个碱基对，分为长、短两条链。长链的长度固定，存在一缺口(nick)，连接有DNA聚合酶。当HBV复制时，以长链DNA为模板，内源性DNA聚合酶修补短链，使基因组成为完整的双链结构，然后进行转录。HBV DNA的长链有4个开放性读框(ORF)，即S区、C区、P区和X区。S区包括前S1、前S2和S区基因，编码前S1、前S2和S三种外壳蛋白；C区以包括前C区，C区基因编码HBcAg蛋白，前C区编码一个信号肽，在组装和分泌病毒颗粒以及在HBeAg的分泌中起重要作用；P基因编码DNA聚合酶；X基因的产物是X蛋白，其功能尚不清楚。HBV DNA的短链长度不定，不含开放读框，不编码蛋白。
目前临床使用的抗HBV的药物主要有核苷类逆转录酶抑制剂(如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定等)以及干扰素(α-干扰素和聚乙二醇化干扰素α-2a)。这些药物随着长期的使用易产生耐药性和毒副作用。因此，迫切需要开发出一些新型的抗HBV药物用于当前乙肝的预防和治疗。从丰富的植物资源中挖掘天然抗病毒药物，是开发抗HBV药物的重要途径。
紫草酸是丹参中提取的一种多酚类水溶性化合物。研究表明，紫草酸可改善四氯化物引起的体内外的肝脏氧化损伤，对肝脏具有保护作用；可以保护小肠缺血再灌注损伤，而缺血再灌注损伤与活性氧(ROS)的产生密切相关；可以抑制脂多糖(LPS)或胎牛血清(FBS)诱导的ROS的产生以及ERK1/2的磷酸化，并通过抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达及其酶的活性来减轻LPS诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)的迁移；能抑制神经细胞凋亡，并能减轻四氢吡啶离子(MPP+)引起的神经毒性。此外，还有多项研究表明紫草酸具有抗炎、抗癌、抗凋亡、抗艾滋病毒(HIV)等作用。但是，对紫草酸抗HBV的作用及机制尚未见报道。
自噬是真核细胞降解长寿蛋白、错误折叠蛋白和受损细胞器的重要生物学过程。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病,特别是肿瘤、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关。目前对于自噬流的检测是自噬与其相关疾病研究领域的热点。细胞自噬由多个步骤组成，其中包括:①吞噬泡的形成；②自噬体的形成；③自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；④自噬溶酶体的降解。自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程,自噬流中的任一环节受到阻碍均会导致细胞自噬无法完成其生物学功能。
研究表明，HBV可诱导肝细胞发生不完整的自噬，并通过自噬增强其DNA的复制。HBx是HBV的编码蛋白，HBV主要由HBx调控自噬的发生。HBx通过上调高迁移率族蛋白B(HMGB1)的表达，并通过乙酰化作用促使自噬的发生，从而促进HMGB1蛋白在细胞质的定位。HBx通过与HMGB1在细胞质内结合来诱导自噬的发生。本研究发现紫草酸具有显著抑制HBVDNA复制的作用，其抗病毒分子机制是通过诱导完整的细胞自噬来干扰HBV诱导的不完整的自噬过程，从而抑制HBV的复制。本研究为开发治疗乙肝的新型药物提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。
细胞试验结果表明：紫草酸对HBV DNA及HBeAg的表达均有显著抑制作用，且呈剂量依赖性，因此具有抗HBV活性。紫草酸能促进自噬体的形成和自噬溶酶体的降解，其抗HBV的分子机制是通过完整的细胞自噬来干扰HBV诱导的不完整的自噬过程，从而抑制HBV的复制。
以上结果表明，紫草酸对HBV具有较好的抑制作用，具备制备抗乙型肝炎等相关疾病药物的潜力。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
1.检测相关指标及其说明
HBV DNA：乙肝病毒的脱氧核糖核酸(即乙肝病毒基因)。HBV DNA是HBV感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标。HBV DNA阳性，提示HBV复制和有传染性。
HBsAg、HBeAg：乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染HBV的标志。乙型肝炎e抗原(HBeAg)是乙肝病毒核心颗粒中的一种可溶性蛋白质。在一般情况下，HBeAg埋藏于HBcAg内部，当HBcAg裂解时，HBeAg从肝细胞核内溶入血清，它的出现迟于HBsAg，而消失却早于HBsAg，所以是人体感染HBV后跟随HBsAg出现的第2个血清学抗原标志物。
ATG8/微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociated protein1light chain 3,LC3)：ATG8/LC3是目前研究中被最广泛使用的分子标志物。LC3参与了自噬体膜的形成，包括两种可相互转化的形式即LC3-I和LC3-II。细胞内新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶形式的LC3-I，后者经泛素化加工修饰，与自噬体膜表面的PE结合，成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体，是自噬体的标志分子，随自噬体膜的增多而增加。LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I的比例与自噬体的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性。
p62：也被称为SQSTM1，在多种细胞和组织中都有表达，可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物，随后被整合到自噬体中，并在自噬溶酶体中被降解。当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合，自噬囊泡中p62等蛋白或细胞器被溶酶体酶降解，p62水平降低；当自噬被抑制时自噬体积累，p62水平升高。因此，可以用Westernblot方法检测p62的水平，作为自噬能力变化的指征。在自噬被激活时，LC3的上调和p62的表达下降不一定有明显的关联。
雷帕霉素靶点(target of rapamycin，TOR)复合体1通过级联调控ATG基因的转录、翻译，或直接催化ATG 13过磷酸化在分隔膜形成阶段负性调控自噬途径，将自噬活性保持在较低的水平。TOR是自噬途径的负性调控因子，其活性与自噬活性呈此消彼长的关系。
2.材料
2.1细胞株：HepG2.2.15细胞、HepG2细胞由武汉大学病毒学国家重点实验室馈赠，并由本实验室保存。
2.2实验仪器
1)HEAR Cell CO2培养箱购于Heraeus公司(德国)；
2)生物安全柜购于苏净集团苏州安泰空气技术有限公司(苏州)；
3)XDS-1B倒置相差显微镜购于佳源兴业科技有限公司(北京)；
4)BP211D电子天平购于Startorius公司(德国)；
5)JA3003电子天平购于精密科学仪器有限公司(上海)；
6)凝胶成像仪及软件，BIO-RAD CFX ConnectTM Real-Time System、BIO-RADiMARKTM酶标仪购于BIO-RAD公司(美国)；
7)-80℃低温冰箱、4℃医用冷藏箱购自Haier公司(山东)；
8)DYY-6C型水平电泳槽，DYY-6C型电泳仪，DYC-40A型垂直电泳槽和DYC-40A电转仪购于六一仪器厂(北京)；
9)5415R台式低温高速离心机购于Eppendorf公司(德国)；
2.3试剂及耗材
1)DMEM培养基：Gibco公司(美国)；
2)血清：PAN(德国)
3)青霉素和链霉素：吉诺生物医学技术有限公司(杭州)；
4)胰酶：吉诺生物医学技术有限公司(杭州)；
5)蛋白marker、BCA蛋白定量试剂盒、胎牛血清：Thermo Fisher Scientific公司(美国)；
6)RIPA裂解液、蛋白上样缓冲液、蛋白酶抑制剂(PMSF)、超敏发光液、显影液、定影液：碧云天公司(上海)；
7)蛋白酶抑制剂cocktail：Roche公司(上海)；
8)脱脂奶粉：伊利集团股份有限公司(内蒙古)；
9)PVDF膜：Milipore公司(美国)；
10)质粒小量抽提试剂盒：天根生化科技有限公司(北京)；
11)DNA marker：TaKaRa公司(大连)；
12)脂质体转染试剂(LipoFiterTM)：汉恒生物公司(上海)；
13)二甲基亚砜(DMSO)、Tween 20：Sigma公司(美国)；
14)紫草酸(Lithospermic acid，LA)：瑞芬思生物科技有限公司(成都)
15)阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，Adv)：鼎瑞化工有限公司(上海)
16)人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)酶联免疫分析(ELISA)：慧嘉生物(厦门)
17)人乙型肝炎E抗原(HBeAg)酶联免疫分析(ELISA)：慧嘉生物(厦门)
18)LC3、p62抗体：万类(沈阳)；β-actin：Santa Cruz(美国)
19)雷帕霉素(Rapamycin)：CST公司(美国)
20)LB培养基：Biosharp公司(合肥)
3.紫草酸对细胞上的毒性检测(CCK-8法)
取出96孔细胞培养板(HepG2.2.15细胞生长的丰度为60％左右)，吸去每孔中的培养基，向96孔板中加入100μL系列不同浓度的药液(0，0.196、0.391、0.781、1.563、3.125、6.25、12.5、25、50μM的紫草酸)，每个浓度都设置5个复孔。将培养板在培养箱孵育8天，然后向每孔加入100μL CCK-8稀释液(按DMEM培养基与CCK-8试剂体积比为9：1来配制)，将培养板在培养箱内孵育30min，用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
计算不同浓度的药液处理时细胞的存活率，结果表明，在HepG2.2.15细胞上紫草酸处理8d，3.125μM以下对细胞无明显毒性，选择0.75、1.5、3μM作为无毒浓度。
4.紫草酸对HBV DNA的抑制作用
试验方法：
1)将HepG2.2.15细胞接种于6孔板中，待细胞长至60％的细胞丰度。
2)在药物对细胞的无毒浓度内选择低、中、高3个剂量。在细胞中加入不同浓度的紫草酸药液(含2％FBS的DMEM作为稀释液)，在37℃，5％CO2的培养箱培养8d，每隔2d换一次药液(即在第3、5、7d换药)。同时设置仅加入稀释液的细胞孔作为病毒对照，加入12.5μM阿德福韦酯(简记为：Adv)作为阳性药物对照。
3)收集加入药液培养后第4、6、8d(即对应在第5、7d换药前)的细胞上清液，-80℃保存。收集加入药液培养后第4、6、8天的细胞：将细胞用无FBS的培养基覆盖一层(6孔板：200μL/孔)，-20℃保存。
4)细胞内DNA的提取和测定
①使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS。先用胰蛋白酶消化细胞(6孔板：200μL/孔)，然后每孔加入200μL含10％FBS的DMEM终止消化，使细胞悬浮，收集最多不超过500万的细胞，离心(10000rpm，1min)沉淀后再加入200μLPBS重悬于1.5mLEP管中。
②清除RNA。加入4μL100mg/mL的RNase A，Vortex混匀(除特别说明外，Vortex均为5-10s)。室温(15-25℃)放置2min。
③加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀。
④加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃水浴孵育10min(可用温度计测量温度，水浴时用带孔的泡沫板放样品)。加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
⑤加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
⑥把步骤⑤中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1min。倒弃废液收集管内液体。
⑦加入500μL洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1min。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
⑧加入600μL洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1min。倒弃废液收集管内液体。
⑨再≥18000g(约≥12000rpm)离心1min，以去除残留的乙醇。
⑩将DNA纯化柱置于一洁净的1.5mL离心管上，加入洗脱液洗脱(洗脱2次，每次50μL)。室温放置1-3min。≥12000rpm离心1min。所得液体即为纯化得到的总DNA。
5)细胞上清中游离的DNA提取
①收集细胞培养上清，1500g(3000rpm)低速离心15min，去沉淀后，加入PEG8000(500μL DNA上清液加200μL 20％PEG8000)，4℃，1h。
②离心，10000g，4℃，10min，以200μL10mM pH8.0TE重悬沉淀，以4μL 20mg/mL的蛋白酶K(至终浓度400μg/mL，含1％的SDS)37℃消化2h，200μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，乙醇(加入体积为水层体积的2倍)沉淀(含0.2M NaCl)，静置20min，10000g，4℃，10min。
③200μL 10mM Tris-HCl(pH8.0)重悬沉淀，加入4μL 100mg/mL的RNase A至终浓度2mg/mL，37℃消化0.5h，200μL酚/氯仿(1:1)抽提，取上层(水层，含DNA)，乙醇(加入体积为水层体积的2倍)沉淀(含0.2M NaCl)，静置20min，10000g，4℃，10min，沉淀重悬于50μLTE中。
④测定：用超微量生物检测仪，取2μLDNA溶液上样，测其纯度和浓度(包括浓度，OD260/OD280，OD260/OD230)。
6)qRT-PCR检测HBV DNA的表达量
①引物：5’-AGA AAC AAC ACA TAG CGC CTC AT-3’(sense)
5’-TGC CCC ATG CTG TAG ATC TTG-3’(antisense)
②反应体系：
加样：
③上机分析：
Bio-Rad荧光定量PCR仪设置程序：
实验结果：
表1 LA对HBV DNA的抑制作用
结论：在HepG2.2.15细胞上，相对于不加药的细胞对照，紫草酸和阿德福韦酯给药处理8天，细胞内和细胞上清中的HBV DNA表达均显著下调，说明紫草酸对HBV DNA的表达有明显抑制作用，且呈剂量依赖性。
5.紫草酸抑制HBeAg、HBsAg的表达
实验方法：
1)将HepG2.2.15细胞接种于12孔板中，待细胞长至60％的细胞丰度。
2)在药物对细胞的无毒浓度内选择低、中、高3个剂量。在细胞中加入不同浓度的紫草酸药液(含2％FBS的DMEM作为稀释液)，在37℃，5％CO2的培养箱培养8d，每隔2d换一次药液(即在第3、5、7d换药)。同时设置仅加入稀释液的细胞孔作为病毒对照，加入12.5μM阿德福韦酯(简记为：Adv)作为阳性药物对照。各设置3个复孔。
3)取加入药液培养后第4、6、8d(即对应在第5、7d换药前)的细胞上清液，于-80℃保存。
4)ELISA法测定HBeAg、HBsAg：
所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品和样品，标准品各2个复孔，样品各3个复孔。
①标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品5个浓度，各设2个复孔，在第1、第2孔中分别加标准品100μL，然后在第1、第2孔中加标准品稀释液50μL，混匀；然后从第1孔、第2孔中各取100μL分别加到第3孔和第4孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μL，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μL弃掉，再各取50μL分别加到第五、第六孔中，按此稀释，检测HBsAg的试剂盒稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为5400pg/mL，3600pg/mL，1800pg/mL，900pg/mL，450pg/mL，检测HBeAg的试剂盒稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为54IU/L，36IU/L，18IU/L，9IU/L，4.5IU/L)。
②加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
③温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。
④配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
⑦温育：操作同3。
⑧洗涤：操作同5。
⑨显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min.
⑩终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
实验结果：
表2 LA对细胞上清中HBeAg、HBsAg的抑制作用
结论：在HepG2.2.15细胞上，相对于不加药的细胞对照，紫草酸和阿德福韦酯处理8天，细胞上清中的HBeAg表达均明显下调，紫草酸处理组的HBsAg的表达下调弱于阿德福韦酯处理组，这说明紫草酸对HBeAg有明显抑制作用，且呈剂量依赖性，对HBsAg的抑制效果弱于阿德福韦酯。
另外，在HepG2细胞上转染pblue、pHBV1.3质粒，Rapamycin或紫草酸作为自噬诱导剂处理，结果发现，与正常细胞(pblue)相比，Rapamycin或紫草酸均能显著提高LC3-Ⅱ的表达，促进自噬体的形成。同时还发现，Rapamycin或紫草酸均能显著降低p62的表达，促进自噬溶酶体的降解，而病毒对照的p62降低不明显，HBV不能促进自噬溶酶体的降解，诱导的是不完整的自噬。有文献报道，HBV诱导的不完整自噬有助于增强其复制。本发明表明紫草酸抑制HBV的分子机制是通过诱导完整的细胞自噬过程干扰HBV的复制，这为抗HBV药物的筛选及其分子机制研究提供了新的思路。
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| GR01 | Patent grant | ||
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