CN109758445B

CN109758445B - 一种提高肌酸对兴奋性神经毒性保护效果的方法

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Publication number: CN109758445B
Application number: CN201910115810.4A
Authority: CN
Inventors: 王铁鹏; 陈畅; 张婷; 赵博; 田云云; 李巧彦; 张倩; 孙悦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2039-02-15
Also published as: CN109758445A

Abstract

本发明公开了一种提高肌酸对兴奋性神经毒性保护效果的方法，建立了外源性一氧化氮供体GSNO处理SH‑SY5Y细胞的兴奋性神经毒性模型，利用该模型证明了单纯的肌酸因素对神经兴奋性毒性具有保护作用，但效果有限。在GSNO处理的SH‑SY5Y细胞模型中，两种神经型肌酸激酶CKBB和CKMT均发生亚硝基化修饰，且修饰后二者蛋白含量和酶活性都显著降低；过表达去亚硝基化修饰酶GSNOR可显著降低CKBB和CKMT的亚硝基化修饰，并可显著挽回CKBB和CKMT的含量及活性。本发明结合对神经型肌酸激酶的去亚硝基化修饰方案能显著增强肌酸对兴奋性神经毒性的保护作用。

Description

一种提高肌酸对兴奋性神经毒性保护效果的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种提高肌酸对兴奋性神经毒性保护效果的方法，具体的是涉及神经型肌酸激酶(CKBB和CKMT)的去亚硝基化修饰方法在增强肌酸的神经保护作用方面的药物应用。

背景技术

神经退行性疾病是一类由于神经细胞发生渐进性功能变异及死亡，进而导致病人行为异常和功能障碍，引起过早死亡的神经性疾病，包括阿兹海默氏病(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿舞蹈症(HD)、肌肉萎缩性侧索硬化症(ALS)等。在神经退行性疾病的发病机制中，兴奋性毒性是造成后期神经元死亡的共同途径。其中，由于线粒体呼吸链抑制、糖酵解抑制、修复DNA损伤耗能等过程所导致的能量耗竭是引发神经元死亡的重要原因。因此，在兴奋性毒性过程中促进能量提供，将显著缓解神经退化过程。利用肌酸来提升细胞的能量状态，从而治疗神经退行性疾病就是近年来备受关注的一种方式。

肌酸-肌酸激酶(EC 2.3.7.2)系统是细胞中执行能量存储和维持细胞能量平衡功能的关键调节因素。肌酸激酶(Creatine kinase,CK)能够可逆性地催化底物肌酸(Creatine，Cr)接受ATP的高能磷酸键，生成磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)储存能量；当细胞耗能时，再由CK催化，迅速将高能磷酸键由pCr传递给ADP生成ATP，以及时供能。这种快速的能量缓冲和供应机制在高能量消耗的组织(如大脑)中的作用尤为重要。近十几年来，人们逐渐认识到Cr-CK系统对于神经细胞有显著的保护作用。

研究结果显示，Cr对于治疗早期PD和HD具有较好的效果，Cr可以延迟50％早期PD病人的恶化程度，能改善HD患者病变组织的氧化还原状态，减缓脑萎缩。然而，Cr的治疗效果却不稳定，在不同的PD和HD患者之间差异很大，对于AD和ALS的干预，虽然在动物和细胞模型上显示出一定效果，但在临床上却没有看到明显的疗效。尽管Cr在治疗PD和HD方面已经进入二期临床，但其效果的不确定性仍然是困扰临床医生的难题。是什么原因造成Cr的治疗效果受限，未见有针对性的研究报道。文献调研发现，在众多尝试通过Cr改善神经退行病变的研究工作中，研究人员主要关注于Cr在剂量、时间、给药方式等因素，却并未提及Cr的加入是否能真正能被催化生成PCr，即忽略了CK的催化功能是否正常。

神经细胞中的CK根据亚细胞定位不同分为胞浆中的CKBB和线粒体中的CKMT两种类型，它们对于氧化环境很敏感，容易受到氧化修饰而导致失活。兴奋性神经毒性是一种由一氧化氮介导的神经毒性作用，过量一氧化氮的产生造成了一种硝化化应激的环境，对许多重要蛋白质的正常功能造成影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高肌酸对兴奋性神经毒性保护效果的方法，建立了外源性一氧化氮供体GSNO处理SH-SY5Y细胞的兴奋性神经毒性模型，利用该模型证明了单纯的肌酸因素对神经兴奋性毒性具有保护作用，但效果有限。在GSNO处理的SH-SY5Y细胞模型中，两种神经型肌酸激酶CKBB和CKMT均发生亚硝基化修饰，且修饰后二者蛋白含量和酶活性都显著降低；过表达去亚硝基化修饰酶GSNOR可显著降低CKBB和CKMT的亚硝基化修饰，并可显著挽回CKBB和CKMT的含量及活性。尽管“单纯的肌酸保护”因素对神经兴奋性毒性的保护作用有限，但添加“去亚硝基化修饰(过表达GSNOR)”因素能显著增强肌酸对于毒性作用的保护，且该保护增强作用依赖于肌酸激酶活性。这种对肌酸保护作用的提升作用，在SH-SY5Y细胞系及原代培养的小脑颗粒神经元(CGN)神经兴奋性毒性模型中，都得到了证实。综上，本发明提出结合对神经型肌酸激酶的去亚硝基化修饰方案能显著增强肌酸对兴奋性神经毒性的保护作用。

其具体技术方案为：

肌酸激酶去亚硝基化修饰在提高肌酸对兴奋性神经毒性保护作用中的应用。

进一步，所述应用，采用高表达去亚硝基化修饰酶的方法降低肌酸激酶的亚硝基化修饰。

进一步，所述高表达去亚硝基化修饰酶为GSNOR。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明结合可降低肌酸激酶亚硝基化修饰的手段，能有效提高肌酸对兴奋性神经毒性的保护作用。该方法是对肌酸的神经细胞保护作用的有益补充，对于肌酸在保护神经退行性疾病方面的药物开发及临床治疗，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为提高肌酸对兴奋性神经毒性干预效果的工作技术路线图。

图2为GSNO处理SH-SY5Y细胞的剂量和时间效应；A为不同浓度GSNO处理的剂量曲线，B为1000μM GSNO处理不同时间的时间曲线。

图3为GSNO处理SH-SY5Y细胞的形态学变化；A、B分别为GSNO处理前、后细胞形态，C、D分别为GSNO处理前后细胞核DNA染色结果。

图4为不同浓度肌酸对SH-SY5Y细胞的保护作用。

图5为肌酸激酶的亚硝基化修饰检测；A图为CKBB，B图为CKMT。

图6为GSNOR对肌酸激酶的去亚硝基化修饰效果；A、B分别为CKBB和CKMT的检测结果，C、D分别是对A、B图的灰度扫描定量结果。

图7为去亚硝基化修饰作用(过表达GSNOR)对CKBB(图A)和CKMT(图B)蛋白含量的挽回作用，C、D分别是对A、B图的灰度定量结果。

图8为去亚硝基化修饰作用(过表达GSNOR)对CKBB(图A)和CKMT(图B)酶活性的保护作用。

图9为肌酸激酶去亚硝基化修饰对SH-SY5Y细胞兴奋性神经毒性的保护作用。

图10为肌酸激酶去亚硝基化修饰对CGN神经元谷氨酸兴奋性毒性的保护作用。图10A的a、b、c分别为对照组、谷氨酸刺激组、双因素保护组的GFP转染细胞形态；图10A的d、e、f分别为对照组、谷氨酸刺激组、双因素保护组的细胞核染色质hoechst33342染色形态；图中，长箭头指示存活细胞，短箭头指示凋亡细胞。图10B为各组别神经元存活比例的计数统计结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明所采用的科技术语放入中英文对照：肌酸(Creatine，Cr)，肌酸激酶(Creatine kinase,CK)，亚硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione,GSNO)，GSNO还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)，神经细胞胞浆型肌酸激酶(Creatine kinasebrain type,CKBB)，神经细胞线粒体型肌酸激酶(Mitochondrial creatine kinase,CKMT)，磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)，2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzene,DNFB)，小脑颗粒神经元(Cerebellar granule neuron,CGN)，阿兹海默氏病(Alzheimer'sdisease,AD)，帕金森氏症(Parkinson's disease，PD)，亨廷顿舞蹈症(Huntington'sdisease,HD)，肌肉萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)。

1.实验方法

1.1利用一氧化氮供体GSNO处理SH-SY5Y细胞的外源性兴奋性神经毒性模型

SH-SY5Y细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，添加青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。通过摸索GSNO处理的剂量和时间效应，确定模型建立条件为：1000μMGSNO处理SH-SY5Y细胞，24h时通过MTT法检测细胞活力；通过hoechst33342染色细胞染色质表征细胞的凋亡状态。具体结果如图2、图3所示。

1.2利用谷氨酸处理原代小脑颗粒神经元的神经兴奋性毒性模型

取出生7天的SD乳鼠的小脑组织，剥去脑膜后剪成1mm³左右的颗粒，在37℃水浴中，利用0.025％胰酶消化15min。接着，利用玻璃吸管吹打小脑组织以获取单细胞小脑颗粒神经元，将神经元接种在经过多聚赖氨酸包被的培养皿中。培养体系采用BME培养基，添加10％胎牛血清及25mM KCl，接种后24h添加10μM阿糖胞苷抑制胶质细胞增殖。细胞培养到9天时，利用100μM谷氨酸+10μM甘氨酸处理小脑颗粒神经元24h，利用0.5μg/mlhoechst33342染色细胞核DNA，根据DNA形态判断神经元存活与否。

1.3细胞质粒转染

SH-SY5Y细胞转染采用电转法。采用Lonza公司的Nucleofector^TM 2b电转仪，电转程序为G-004。33mm细胞培养皿中，接种细胞数约1×10⁶，电转采用100μl电转液体系，添加8μg pEGFP-N2-GSNOR质粒。

小脑颗粒神经元在胰酶消化成单细胞后，用含有血清的完全培养基终止消化。细胞离心后添加100μl细胞电转液及相应质粒，混匀后采用Nucleofector^TM 2b电转仪的O-003程序电转细胞。SH-SY5Y细胞及小脑颗粒神经元均在质粒转染48h后进行后续实验。

1.4 MTT法检测SH-SY5Y细胞活力

MTT使用完全培养基溶解成5mg/ml的浓缩液(10×)备用。SH-SY5Y细胞在药物处理后，加入终浓度为0.5mg/ml的MTT试剂，置于37℃培养箱中继续培养3h。弃除培养基，添加DMSO溶解紫色产物，以DMSO试剂为对照，检测不同细胞组别在565nm波长下的吸光度。以对照组吸光度为标准，定量各组别细胞活力值。

1.5荧光细胞计数法统计小脑颗粒神经元存活率

对于质粒转染细胞(质粒带有GFP荧光标记)，利用绿色荧光蛋白细胞计数法统计细胞细胞存活率。神经元加药处理完毕后，使用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，再采用0.5μg/ml hoechst33342染色细胞核DNA，荧光显微镜下均匀细胞核染色为存活细胞，DNA高亮皱缩者为凋亡细胞。具体计数操作为：在视野中随机选取5个独立视野，计数视野下的总GFP标记细胞数(300个细胞以上)，统计其中hoechst33342高亮染色且细胞核皱缩细胞数(凋亡神经元)和细胞核正常染色细胞数(非凋亡神经元)，以“凋亡细胞数/总GFP细胞计数”为指标统计基因转染组细胞凋亡率(参见图10)。

1.6生物素转化法检测蛋白亚硝基化修饰

肌酸激酶的亚硝基化修饰检测采用生物素转换法(Biotin-switch method)，具体步骤如下：

(1)裂解：采用细胞裂解液(250mM HEPES，1mM EDTA，0.1mM neocuporine，cocktail蛋白酶抑制剂，1％NP-40，NaOH调pH＝7.6)处理细胞，于4℃冰盒上裂解20min。4℃，12000g，离心10min，弃沉淀，留上清。BCA法定量蛋白，调平各组蛋白浓度，蛋白浓度要求小于0.8μg/ml。

(2)封闭：细胞裂解液中加入封闭试剂MMTS(20mM),50℃水浴锅中封闭蛋白30min，期间每5min涡旋震荡一次。

(3)沉淀：用4倍体积的冰丙酮沉淀蛋白，4℃，5000g，离心10min。重复2次。

(4)标记：配制标记液(250mM HEPES，1mM EDTA，0.1mM neocuporine，2.5％SDS，0.2mM biotin-maleimide，5mM ascorbate,NaOH调pH＝7.6)，用标记溶液重悬蛋白后，放于25℃水浴锅中孵育2h。

(5)再沉淀：用4倍体积的冰丙酮沉淀蛋白，4℃，5000g，离心10min。重复2次。

(6)还原：HEN buffer重悬细胞后加入1％SDS及200mM DTT，于100℃中水浴，煮15min，打开分子间二硫键。

(7)抓取：留出少许样品做input，余下样品中加入60μl streptavidin-agarose珠子，4℃，旋转仪上抓取过夜。次日，4℃，3000g，离心10min，弃上清。珠子用2×电泳上样缓冲液重悬，100℃加热15min。而后，常温离心，12000g，1min，收集亚硝基化修饰蛋白样品。

(8)western blot法检测各组细胞的input样品及抓取样品，用特异性CKBB及CKMT抗体定量肌酸激酶的亚硝基化修饰水平。

1.7 Western blot检测

配制RIPA裂解液，在4℃冰盒上裂解细胞15min。采用BCA法定量蛋白浓度。单泳道上样蛋白15μg，采用10％浓度SDS-PAGE电泳胶分离蛋白。电泳完毕，利用湿转印记仪将蛋白转印到硝酸纤维素(NC)膜上，采用李春红S染色检测蛋白条带，裁膜，再将NC膜在含有5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭2h。NC膜经TBST洗脱2次后，配制相应稀释度抗体4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜4次，每次10min。稀释二抗，室温下孵育NC膜1h，TBST溶液再洗膜4次后，采用ECL化学发光试剂盒显影。通过FluoChem HD-2成像仪拍照，利用AlphaWiew软件扫描蛋白条带灰度。实验中以α-tubulin为上样内参，待测蛋白的比较采用目标蛋白/内参蛋白的灰度值做定量。

1.8线粒体及胞浆分离

采用商品化线粒体分离试剂盒分离SH-SY5Y细胞的线粒体及胞浆成分。收集2×10⁷个细胞，加入1.0ml预冷研磨液，4℃冰盒上使用Dounce匀浆器研磨破碎细胞。通过差速离心法分离不同细胞组分：800g，离心10min沉淀细胞核、细胞膜碎片等杂质；10000g，离心10min，沉淀出线粒体，上清为细胞胞浆成分。

1.9肌酸激酶活性检测

使用商品化试剂盒检测肌酸激酶活性，基本测定原理为肌酸激酶催化肌酸与三磷酸腺苷生成磷酸肌酸，后者迅速成磷酸，与钼酸铵生成磷钼酸，在还原剂作用下产生钼蓝，检测660nm下吸光度，以对照组细胞为标准，定量不同组别酶活性。

1.10统计学方法

所有数据以

形式表示，采用Student's t-test方法比较组间显著性差异，以P<0.05(*)为显著性差异标准，以P<0.01(**)为非常显著，以P<0.001(***)为特别显著。

2.实验结果

2.1 GSNO处理SH-SY5Y细胞模型的建立

用不同浓度GSNO处理SH-SY5Y细胞24h，MTT法检测各组细胞活力，得到GSNO影响细胞活力的浓度依赖性曲线(图2A)。从图中可以看出，细胞活力随着GSNO浓度增加而逐渐下降，当GSNO浓度达到1000μM以后，细胞活力下降趋势减缓(图2A)。

使用1000μM GSNO处理SH-SY5Y不同时间，得到细胞活力的刺激时间依赖性曲线(图2B)。从图中可以看出，细胞活力随着GSNO处理时间延长而逐渐降低，GSNO处理时间超过24h，细胞活力趋于稳定(图2B)。

综合分析图1，得到模型建立的适宜条件：1000μM GSNO处理细胞24h。使用该条件处理细胞后，SH-SY5Y细胞发生明显的形态性变化，其可见光细胞形态由饱满转为皱缩(图3A、3B)，hoechst33342染色显示，GSNO处理后部分细胞核内DNA高亮浓缩，提示细胞走向凋亡(图3C、3D)。

2.2不同浓度肌酸对细胞系兴奋性神经毒性模型的保护作用

在1000μM GSNO处理SH-SY5Y细胞24h条件下，细胞活力减低为对照组52.89％。使用不同浓度肌酸干预时，细胞活力随着肌酸浓度增加而不断提高。肌酸浓度升至5mM时，其保护作用达到峰值，细胞活力活力提高至对照组的75.20％(P<0.01)，肌酸浓度增加至7.5mM时，其细胞保护作用不再继续增强(图4)。

2.3 CKBB和CKMT的亚硝基化修饰检测

如图5所示，采用1000μM GSNO处理SH-SY5Y细胞1h，收集样品，通过生物素转化法检测两种神经型肌酸激酶的亚硝基化修饰。结果显示，与对照组相比，GSNO处理后CKBB和CKMT的亚硝基化修饰水平都显著升高。

2.4 GSNOR的去亚硝基化修饰作用

向SH-SY5Y细胞中过表达去亚硝基化修饰酶GSNOR，检查对肌酸激酶亚硝基化修饰的调节效果。图6显示，GSNO处理后CKBB和CKMT的亚硝基化修饰显著升高，但在GSNOR过表达后，CKBB的亚硝基化修饰水平减低为GSNO处理组的31.68％(P<0.01，图6A)，CKMT的亚硝基化修饰下降到GSNO处理组的39.64％(P<0.01,图6B)。结果表明，GSNOR对CKBB和CKMT的去亚硝基化修饰作用效果显著。

2.5去亚硝基化修饰对肌酸激酶功能的影响

2.5.1去亚硝基化修饰对肌酸激酶蛋白含量的影响

图7所示的实验结果表明，1000μM GSNO处理SH-SY5Y细胞24h将导致两种肌酸激酶蛋白含量显著减低，其中，CKBB和CKMT的蛋白含量分别减低至对照组的29.97％(P<0.01)和23.26％(P<0.001)。过表达GSNOR能显著挽回GSNO处理条件下的肌酸激酶含量；其中，CKBB蛋白水平提升至对照组的72.43％，与GSNO组相比有显著性差异(P<0.01)，CKMT蛋白水平提升至对照组细胞的80.60％，与GSNO组相比差异显著(P<0.001)。

2.5.2去亚硝基化修饰对肌酸激酶活性的影响

采用1000μM GSNO处理SH-SY5Y细胞2h，收集细胞后，利用试剂盒分离胞浆及线粒体成分，并分别检测胞浆部分及线粒体部分的肌酸激酶活性。结果如图8所示，GSNO处理后，胞浆部分的肌酸激酶(CKBB)活性减低为对照组的21.30％(P<0.001)，线粒体部分的肌酸激酶(CKMT)活性降低至对照组的43.05％(P<0.01)。过表达GSNOR能够显著提升GSNO处理条件下SH-SY5Y细胞中的肌酸激酶活性；其中，使CKBB活性提升至对照组的73.63％，与GSNO处理组有显著差异(P<0.001)，使CKMT活性提高到对照组的85.75％，与GSNO组差异显著(P<0.01)。

2.6肌酸激酶去亚硝基化修饰对肌酸保护作用的提升

如图9所示，设置以下六个组别，加以不同条件处理，MTT法检测各组SH-SY5Y细胞活力。具体结果如下：

(1)对照组：细胞不处理，细胞活力作为对照。

(2)GSNO刺激组：1000μM GSNO处理细胞24h后细胞活力减低为对照组的51.35％(P<0.001)。

(3)肌酸单因素保护组：GSNO刺激前先加入5mM肌酸孵育30min，之后采用1000μMGSNO处理细胞，同时加入5mM肌酸。细胞处理24h后，MTT法检测显示细胞活力提升至对照组的71.19％，与GSNO处理组相比有显著性差异(P<0.05)。

(4)GSNOR单因素保护组：SH-SY5Y细胞转染GSNOR-GFP质粒，过表达48h后，采用1000μM GSNO刺激细胞24h。MTT结果显示，本组细胞活力升高至对照组的73.06％，与GSNO处理组有显著性差异(P<0.05)。

(5)肌酸+GSNOR双因素保护组：细胞先过表达GSNOR-GFP质粒48h，再加入5mM肌酸孵育30min，之后采用1000μM GSNO处理细胞，同时加入5mM肌酸，细胞处理24h。MTT结果表明，该组细胞活力提升明显，达到对照组的88.20％，与GSNO处理组相比有显著性差异(P<0.001)。且该组细胞活力与“肌酸单因素保护组”有显著性差异(P<0.05)。本组结果表明，双因素保护组能显著增强肌酸对于兴奋性神经毒性的保护作用。

(6)肌酸+GSNOR+肌酸激酶抑制剂组：双因素保护组在GSNO处理同时添加10μMDNFB(肌酸激酶抑制剂)后，其细胞活力降低至对照组的49.16％，与GSNO处理组相比没有统计学差异(ns，P>0.05)。

图9结果表明，肌酸对GSNO引发的SH-SY5Y细胞兴奋性毒性具有一定的保护作用，但作用有限。过表达去亚硝基化修饰酶GSNOR能显著增强肌酸的神经保护作用，但这种增强作用可被肌酸激酶抑制剂所拮抗。结合图6、图7、图8的结果分析可以推断，GSNOR是通过对肌酸激酶的去亚硝基化修饰，挽回CKBB和CKMT的功能，从而增强肌酸的神经保护作用的。

2.7原代神经元兴奋性神经毒性模型验证

如图10所示，设置以下六个组别，经不同处理后，加入0.5μg/ml hoechst33342染料染色10min，荧光显微镜下，根据DNA染色结果判断小脑颗粒神经元(CGN)是否凋亡。采用荧光细胞计数法统计CGN细胞存活率。具体结果如下：

(1)对照组：转染pEGFP-N2空载体的对照组小脑颗粒神经元(CGN)，仅加入10μM甘氨酸，作为对照。

(2)谷氨酸刺激组：小脑颗粒神经元(CGN)转染pEGFP-N2空载体48h，之后，采用10μM甘氨酸+100μM谷氨酸处理24h。统计结果显示，本组神经元存活率降低至29.47％(P<0.01)。

(3)肌酸单因素保护组：小脑颗粒神经元(CGN)转染pEGFP-N2空载体48h后，利用5mM肌酸预孵育神经元细胞30min。而后，添加10μM甘氨酸+100μM谷氨酸+5mM肌酸，处理24h。结果表明，本组神经元存活率为34.93％，但与谷氨酸刺激组相比，没有显著性差异(ns，P>0.05)。

(4)GSNOR单因素保护组：小脑颗粒神经元(CGN)转染pEGFP-N2-GSNOR质粒48h后，添加10μM甘氨酸+100μM谷氨酸处理神经元24h。计数统计结果表明，本组细胞存活率为44.01％，与谷氨酸刺激组相比有显著性差异(P<0.05)。

(5)肌酸+GSNOR双因素保护组：小脑颗粒神经元(CGN)转染pEGFP-N2-GSNOR质粒48h后，利用5mM肌酸预孵育神经元细胞30min。而后，添加10μM甘氨酸+100μM谷氨酸+5mM肌酸，处理24h。本组细胞活力显著升至66.65％，与谷氨酸刺激组有非常显著的差异(P<0.01)，与肌酸单因素保护组相比也有很显著的增强(P<0.01)。

(6)肌酸+GSNOR+肌酸激酶抑制剂组：小脑颗粒神经元(CGN)转染pEGFP-N2-GSNOR质粒48h后，利用5mM肌酸预孵育神经元细胞30min。而后，添加10μM甘氨酸+100μM谷氨酸+5mM肌酸+10μM DNFB(肌酸激酶抑制剂)，处理24h。本组神经元存活率为26.78％，与谷氨酸刺激组相比没有显示出保护作用(ns，P>0.05)。

图10的结果表明，在谷氨酸刺激神经元的兴奋性神经毒性条件下，肌酸对毒性未表现出显著的保护作用，“肌酸+GSNOR过表达”双因素处理则能显著提升肌酸对神经毒性的保护。

综上所述，发明人发现在兴奋性神经毒性条件下，NO通过亚硝基化修饰肌酸激酶降低了CKBB和CKMT的蛋白含量及酶活性，因此限制了肌酸对于神经毒性的保护效果。通过针对肌酸激酶的去亚硝基化操作(如过表达GSNOR等方式)，可挽回肌酸激酶的功能，并能显著增强肌酸对兴奋性神经毒性的保护效果。该发现对于提高肌酸在治疗神经退行性疾病方面的临床效果具有潜在的应用价值。

本发明研究结果表明：

(1)硝化应激/兴奋性毒性处理条件下，CKBB和CKMT的蛋白含量和酶活性均出现显著下调。

(2)硝化应激/兴奋性毒性处理条件下，CKBB和CKMT均发生亚硝基化修饰。

(3)利用肌酸Cr作为保护剂，其保护神经细胞硝化应激/兴奋性毒性的作用有限。

(4)通过去亚硝基化手段(如过表达GSNOR等)，可有效降低CKBB和CKMT的亚硝基化修饰，并可有效挽回CKBB和CKMT的蛋白含量和酶活性。

(5)去亚硝基化修饰手段(如过表达GSNOR等)，可显著提高肌酸(Cr)对于硝化应激/兴奋性毒性的神经保护作用。这种保护作用的提高可被肌酸激酶(CK)抑制剂所逆转，说明是通过降低肌酸激酶的亚硝基化修饰、提高肌酸激酶的功能来实现的。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.去亚硝基化修饰的神经型肌酸激酶在制备提高肌酸对兴奋性神经毒性保护作用的药物过程中的应用。其特征在于，采用神经细胞中高表达去亚硝基化修饰酶GSNOR的方法降低神经型肌酸激酶的亚硝基化修饰。