CN109752544A - 一种检测黄曲霉毒素b1的胶体金试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明黄曲霉毒素B1的免疫胶体金检测卡及其制备方法，涉及动物源食品兽药残留检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含黄曲霉毒素B1单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测黄曲霉毒素B1，方便、快捷、结果准确。

Description

一种检测黄曲霉毒素B1的胶体金试纸条

技术领域

本发明涉及谷物食品中农药残留检测技术领域，特别是涉及黄曲霉毒素B1的免疫胶体金检测卡及其制备方法。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）和集蜂曲霉（A. nonius）一些菌株产生的；黄曲霉的产毒能力由于菌株的不同而差异甚大；寄生曲霉的所有菌株都能产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一种毒性很强的肝毒素，可引起肝脏的急性或慢性损害，它与乙肝病毒被认为是肝癌的最主要的两大诱因；除损害机体的肝脏以外，黄曲霉毒素对肾脏等其他多种组织器官也能造成严重损害，更为严重的是黄曲霉毒素已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。黄曲霉毒素广泛存在于花生、玉米、麦类、稻谷等谷物农产品中，在通心粉、调味品、牛奶和食用油等食品中也经常发现，严重危害人、畜、禽类健康。黄曲霉毒素 B1 被公认为是目前致癌力最强的天然物质，1993 年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。自从 1961 年发现黄曲霉毒素以来，黄曲霉毒素的种类越来越多。目前已分离鉴定出十二种，分别是黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2、B2a、G2a、GM1、R0 和毒醇；从化学结构上看，各种黄曲霉毒素的结构非常相似，都含有一个双呋喃环和氧杂萘邻酮（香豆素），前者为基本毒性结构，后者可能与致癌有关。黄曲霉毒素的毒性比氰化物和砒霜大很多倍。目前已查明，黄曲霉毒素对人和很多种动物都表现出剧烈的毒性，而且具有明显的致癌能力；其中黄曲霉毒素 B1 毒性最大，致癌能力最强，G1、M1 其次，B2、G2 和 M2 较弱。黄曲霉毒素 B1 除致癌外，还能引起突变和导致畸形。黄曲霉毒素 B1 的LD 50 为0.249 mg/kg, 小于 1 mg/kg，属特剧毒物质，其毒性为氰化钾的 10倍、为砒霜的 68 倍。人们发现，黄曲霉毒素 B1 是目前所有已知致癌物中致癌力最强的一种。

关于黄曲霉毒素的检测方法已经出现了许多的化学检测方法，如气相色

谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层层析法、分光光度法、液质联用仪（LC-MS）、气质联用仪（GC-MS）等。化学检测方法存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大（通常>500 mL）及前处理步骤繁琐等不足，无法在较大范围内系统、全面、快速分析黄曲霉毒素的含量。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种黄曲霉毒素B1的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出黄曲霉毒素B1的问题。

本发明的黄曲霉毒素B1胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了黄曲霉毒素B1-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。

本发明的黄曲霉毒素B1胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：

(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的黄曲霉毒素B1抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml，过0.22 µm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成黄曲霉毒素B1单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；

所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01 mol/L PBS定容至100 mL；

本发明可有效用于测定黄曲霉毒素B1，方法简单，方便、快捷，结果准确。

附图说明

图1为本发明黄曲霉毒素B1的免疫胶体金检测卡的结构图：图中1.加样孔 2.检测线 3.质控线 4.检测孔 5.试纸条 6.检测卡外壳。

图2为本发明黄曲霉毒素B1的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫 8.胶体金结合垫 9.PVC胶板 10.硝酸纤维素膜 11.吸水垫 。

具体实施方式

实施例1

图1、图2所示的实施例：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了黄曲霉毒素B1-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。

在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、结合垫8，样品垫7和结合垫8为并排结构。

在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和黄曲霉毒素B1-BSA检测线2。

在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，制成检测卡，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。

实施例2

黄曲霉毒素B1胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：

胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

抗体的预处理：将要标记的黄曲霉毒素B1抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml，过0.22 µm滤膜；

胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成黄曲霉毒素B1单克隆抗体胶体金标记物；

胶体金膜的制备：将步骤(3)黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

Claims (2)

1.黄曲霉毒素B1胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到：

(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl₄·3H₂O)5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的黄曲霉毒素B1抗体在1000 r/min，4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml，过0.22 µm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温1500 r/min离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成黄曲霉毒素B1单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、黄曲霉毒素B1蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1胶体金检测卡，其特征在于所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；

所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01 mol/L PBS定容至100 mL。