CN109735493B

CN109735493B - 一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元的方法

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Publication number: CN109735493B
Application number: CN201910180130.0A
Authority: CN
Inventors: 卢明; 卓毅; 段答
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Qizu Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109735493A

Abstract

本发明提供了一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向多巴胺能神经元分化的方法，属于干细胞诱导分化技术领域，包括：将嗅黏膜间充质干细胞采用诱导液在体积浓度为1～5％O₂环境下诱导培养18～24d，得到多巴胺能神经元，所述诱导液中含有嗅鞘细胞分泌蛋白。采用本发明的方法，将嗅黏膜间充质干细胞分化为多巴胺能神经元，得到的多巴胺能神经元的功能完整。

Description

一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元的方法

技术领域

本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体提供一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元分化的方法。

背景技术

帕金森病是因脑内黑质纹状体内的多巴胺能神经元丢失所致的一种神经退行性疾病，目前多采用药物治疗，但是药物治疗依然存在着很多局限性和耐药性。随着干细胞的研究不断深入，神经修复、替代与再生已经被大多数学者所认可，而且干细胞移植治疗帕金森病已是目前神经学科界领域研究的热点之一。目前，有研究表明神经干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞等都能在特定的环境下被诱导分化成多巴胺能神经元，但是这些细胞仍有不少问题存在，如伦理问题、免疫排斥问题以及细胞来源不足等。嗅黏膜间充质干细胞(Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells，OM-MSCs)不仅具有自我复制、造血支持以及免疫调节等功能，还具有多向分化的潜能。

目前诱导间充质干细胞向神经元方向分化的方法主要是通过单因子或者几种细胞因子联合起来进行诱导，如很多学者用脑源性神经生长因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)等分别单独诱导神经干细胞向神经元方向分化，也有部分学者将上述几种细胞因子联合起来共同对神经干细胞进行诱导分化，但是大部分研究所得到的靶细胞无正常神经元电生理特性及分泌神经递质等功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元的方法，采用本发明提供的方法能够获取更为丰富且功能完整的多巴胺能神经元。

本发明提供了一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元的方法，包括：

将嗅黏膜间充质干细胞采用诱导液在体积浓度为1～5％O₂环境下诱导培养18～24d，得到多巴胺能神经元；

所述诱导液中含有嗅鞘细胞分泌蛋白。

优选的，所述诱导液的制备方法，包括：

采用常规方法培养得到嗅鞘细胞培养物，用无血清纯化培养基纯化嗅鞘细胞培养物，当所述嗅鞘细胞培养物中嗅鞘细胞的纯度在90％以上时，开始收集嗅鞘细胞纯化液，收集嗅鞘细胞纯化液根据嗅鞘细胞的纯度、状态，为45～50h时嗅鞘细胞纯化液与含血清培养基交替换液，再继续使用无血清纯化培养基培养嗅鞘细胞，再培养45～50h后收集的无血清嗅鞘细胞上清液即为诱导液。

优选的，所述O₂的体积浓度为3％。

优选的，所述培养的时间为21d。

优选的，所述无血清纯化培养基以DMEM/F12液体培养基为基础培养基，每100ml包括：1～3mg转铁蛋白、氢化可的松5～15ul、胰岛素5～15ul、谷氨酰胺1～3ml、碱性成纤维生长因子18～22ng和表皮生长因子18～22ng。

优选的，所述嗅黏膜间充质干细胞传至第4代时进行诱导。

优选的，所述诱导培养的温度为35～42℃。

本发明提供了一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元的方法，将嗅黏膜间充质干细胞采用含有嗅鞘细胞分泌蛋白的诱导液在1～5％的O₂环境下诱导，能够将嗅黏膜间充质干细胞分化为多巴胺能神经元。

本发明实施例的结果显示：采用本发明的方法，将嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元，得到的多巴胺能神经元的功能完整。

附图说明

图1为本发明嗅黏膜间充质干细胞和嗅鞘细胞光镜下形态图；

图2为本发明嗅黏膜间充质干细胞诱导分化后光镜下形态图；

图3为本发明细胞分化后神经元和多巴胺能神经元标记物荧光图。

具体实施方式

将嗅黏膜间充质干细胞采用诱导液在体积浓度为1～5％的O₂环境下诱导培养18～24d，得到多巴胺能神经元。

本发明对所述嗅黏膜间充质干细胞的来源没有特殊限定，采用常规的嗅黏膜间充质干细胞即可，在本发明实施例中，所述嗅黏膜间充质干细胞具体采用名称为“一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法”、申请号为201410228728.X的中国专利公开的分离培养方法得到。

在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞优选传至第4代时进行诱导。

在本发明中，所述诱导液的制备方法，优选包括：采用常规方法培养得到嗅鞘细胞培养物，用无血清纯化培养基纯化嗅鞘细胞培养物，当所述嗅鞘细胞培养物中嗅鞘细胞的纯度在90％以上时，开始收集嗅鞘细胞纯化液，收集根据嗅鞘细胞的纯度、状态，为45～50h时嗅鞘细胞纯化液与含血清培养基交替换液，再继续使用无血清纯化培养基培养嗅鞘细胞，再培养45～50h后收集的无血清嗅鞘细胞上清液即为诱导液。

本发明对所述嗅鞘细胞培养物的培养方法没有特殊限定，将常规嗅鞘细胞按照常规培养即可得到。

在本发明中，所述无血清纯化培养基优选以DMEM/F12液体培养基为基础培养基，每100ml优选包括：1～3mg转铁蛋白、氢化可的松5～15ul、胰岛素5～15ul、谷氨酰胺1～3ml、碱性成纤维生长因子18～22ng和表皮生长因子18～22ng；更优选为1.5～2.5mg转铁蛋白、氢化可的松8～12ul、胰岛素8～12ul、谷氨酰胺1.5～2.5ml、碱性成纤维生长因子19～21ng和表皮生长因子19～21ng。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售即可。

本发明对所述含血清培养没有特殊限定，采用常规培养嗅鞘细胞使用的含血清培养基即可。

在本发明中，所述纯化的方法优选为采用上述无血清纯化培养基对OECs进行纯化。

在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞的数量与诱导液的体积比优选为10⁷个:3ml。

在本发明中，所述诱导培养在体积浓度为1～5％O₂环境下进行，所述O₂的体积浓度优选为3％。

在本发明中，诱导培养的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述诱导培养的时间为18～24d，优选为21d。

在本发明中，所述诱导培养过程中优选为每45～50h更换1次诱导液，优选每48h更换1次。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

第一步，按照名称为“一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法”、申请号为201410228728.X的中国专利公开的分离培养方法培养得到OM-MSCs(嗅黏膜间充质干细胞)，将得到的嗅黏膜间充质干细胞采用上述专利中公开的鉴定方法进行鉴定。OM-MSCs传至第4代时用于诱导，对得到的嗅黏膜间充质干细胞进行细胞免疫荧光检测，结果显示其可同时表达STRO-1和Nestin，同时对嗅黏膜间充质干细胞表面标记物进行流式细胞技术检测，经流式细胞术检测，OM-MSCs不表达造血干细胞标志CD34和CD45，但表达黏附分子和基质细胞标记CD73、CD90和CD105，且纯度高达97％以上，细胞显微镜下形态见图1A。

第二步，OECs(嗅鞘细胞)分离、培养及鉴定：实验室专用鼠包(为经过高温高压消毒处理)于无菌环境下取新生3天小鼠嗅球，4℃预冷，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffersaline，PBS)清洗3遍，于显微镜下剥离嗅球表面的软膜，取纤维层与嗅小球层，再用眼科剪剪碎。PBS洗涤3～4遍后用0.25％胰蛋白酶37℃消化15min，DF12+10％FBS终止消化，离心弃上清后加DF12+10％FBS重悬，每瓶各0.5ml铺瓶，再各自加入0.5ml含10％FBS的高糖DF12培养基，然后置入37℃，5％CO₂湿化培养箱中培养。待细胞纯度达到90％以上时移至六孔板内行P75细胞免疫荧光鉴定，细胞显微镜下形态见图1B。

第三步，OECs上清液的收集：当细胞爬出数量较多时换成无血清OECs纯化液培养基对细胞进行纯化，当纯度达到约90％以上时开始进行OECs纯化液收集，收集纯化液根据OECs的纯度、状态，基本为45～50h OECs纯化液与含血清培养基交替换液，更换含血清培养基的目的为使细胞状态更佳，再继续使用OECs纯化培养基培养细胞，45～50h后收集的无血清OECs上清液即为诱导液，将收集的诱导液置于-80℃冰箱储存备用，诱导液中主要起诱导分化作用成分为OECs分泌蛋白。

无血清OECs纯化液培养基以DMEM/F12液体培养基为基础培养基，每100ml优选包括：3mg转铁蛋白、氢化可的松5ul、胰岛素15ul、谷氨酰胺3ml、碱性成纤维生长因子18ng和表皮生长因子18ng。

第四步，低氧微环境下诱导OM-MSCs向多巴胺能神经元方向分化，实验将OM-MSCs分为两组：常氧诱导组(21％O₂+OECs)、低氧诱导组(3％O₂+OECs)。其中常氧是指正常氧气浓度21％，低氧是指3％的氧气浓度。

诱导步骤：当OM-MSCs传代至第4代时，首先将OM-MSCs含血清培养基全量换液成上述诱导液(OECs上清液)，再将其移至氧气浓度为3％的低氧微环境下进行培养，试图激活OM-MSCs中与促进细胞分化相关的信号通路。培养瓶每次3ml诱导液进行诱导，六孔板及小培养皿每次各1ml进行诱导，均48h换上清液一次，诱导21-24天后对分化的细胞进行检测。

第五步，OM-MSCs诱导分化后神经细胞的鉴定：

当OM-MSCs在低氧微环境下诱导21天时，光镜下可见低氧诱导组中类神经元样细胞数量明显最多(见图2)。再通过细胞免疫荧光检测分化后细胞神经元标记物(βⅢ-tubulin)和多巴胺能神经元标记物(TH)表达，其步骤为：取出6孔板内载玻片，先用PBS洗涤3次，5min；再将细胞进行固定：固定液为4％多聚甲醛溶液15min即可；固定时间结束后，先冲洗掉固定液，兔抗βⅢ-tubulin(1:1000)、兔抗TH(1:1000)放置于4℃的冰箱内孵育过夜；第二天取出载玻片，PBS洗涤一抗3遍，5min/次；加入二抗，避光孵育1h，用PBS洗掉二抗，3遍，5min/次；加入DAPI进行核染色，15min；甲醇洗涤1次，用抗猝灭剂封片，观察并记录实验结果。结果显示：低氧诱导组神经元数量显著增加，且低氧诱导组还表达多巴胺能神经元标记物TH(见图3，A：诱导分化后神经元标记物βⅢ-tubulin荧光染色；B：诱导分化后多巴胺能神经元标记物TH荧光染色)。

当OM-MSCs在低氧微环境下诱导21天后，通过Westernblot检测分化后细胞神经元标记物(βⅢ-tubulin、TH)及胶质细胞标记物(GFAP)的蛋白表达。其步骤为：按照BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)使用说明操作，测定蛋白浓度。根据蛋白定量结果，第一孔加入maker，其他每孔用5×loading buffer配平总量为20μg上样于120g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝至凝胶底部时，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。用1×TBST配制5％脱脂奶粉液室温封闭2h后，将膜浸入，室温放置1h。再加入一抗4℃摇床孵育过夜，用TBST洗膜3次，用1×TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例1:4000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45-60min。孵育结束，1×TBST洗3次，每次15min。ECL显色曝光：使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3min，用吸水纸吸尽液体，用保鲜膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光数秒至数分钟；显影冲洗。结果显示：与常氧组比较，低氧组中βⅢ-tubulin与TH表达均显著增高，而GFAP表达显著下调，且常氧组中βⅢ-tubulin与TH表达均最少，而GFAP的表达最高。

第六步，OM-MSCs在体外诱导分化后的神经功能检测：

OM-MSCs诱导21天后通过膜片钳技术检测神经元细胞膜表面的钾离子通道开放情况。其步骤为：此实验于20℃～25℃室温下进行，在倒置显微下，选取典型神经元细胞(21d)进行膜片钳检测。电流记录是用全细胞膜片钳技术并利用放大器在电脑显示屏上进行。培养皿内液体用充O₂饱和的细胞外液置换。参考电极与细胞外液采用3mol/L KCl-琼脂盐桥连接。玻璃电极经两步拉制仪拉制后行热抛光，充电极内液后入水电阻为2～4MΩ。检测钾电流的细胞内液为：120mmol/L KF，20mmol/L NMG，2mmol/L MgATP，pH值调至7.4；细胞外液：130mmol/L氯化胆碱，5mmol/L KOH，10mmol/L Hepes，12mmol/L Glucose，2mmol/L MgCl₂，2mmol/L CaCl₂，pH值调至7.4。细胞于全细胞记录模式下稳定4～6min。记录电流用EPC-9放大器10KHz滤波进行过滤。用Pulse 8.0+Pulsefit软件采集数据并分析做图。结果显示：将膜电位钳制在-80mV，给予脉冲宽度为300ms，在+20mV电压刺激引出的钾电流，当往细胞外液中加入钾离子通道阻滞剂TEA-CL时，钾离子电流被阻断，将膜电位钳制在-80mV，给予脉冲宽度为300ms，从-80mV开始以10mV步幅递增至+70mV刺激引出钾电流。

OM-MSCs诱导21天后收集其无血清上清液，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测实验各组上清液中多巴胺浓度差异。其步骤为：将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，置37℃，4h，或4℃，24h；弃去孔中液体。5％小牛血清置37℃封闭40min，封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。吸干孔内反应液，将洗涤液注满板孔，放置2min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干洗涤次数3次。加入待检测样品(建立合适的浓度梯度)，检测时一般采用1:50-1:400的稀释度，应采用较大稀释体积进行，一般保证样品吸取量>20umol，再将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，置于37℃，40-60min。用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。再根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行，置于37℃，30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，洗涤同前。加入底物液(现用现配)：首选TMB-过氧化氢尿素溶液，OPD-过氧化氢底物液系统次之，底物分别加入到每孔中并置37℃避光放置3-5分钟，加入终止液显色。终止反应：每孔加入终止液后终止反应，于20min内测定实验结果。结果判断：OPD显色后采用492nm波长，TMB反应产物检测需要450nm波长。检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价(数值的大小依具体检测要求而定)。ELISA结果显示：根据图中检测的标准曲线对实验各组分泌的多巴胺浓度值进行统计，低氧诱导组中细胞分泌的多巴胺浓度约为常氧组的三倍，其浓度值为1.70±0.03ng/ml。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的方法得到的多巴胺能神经元具有完整的功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种诱导嗅黏膜间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元分化的方法，包括：

将嗅黏膜间充质干细胞采用诱导液在体积浓度为1~5%O₂环境下诱导培养18~24d，得到多巴胺能神经元；

所述诱导液中含有嗅鞘细胞分泌蛋白；

所述诱导培养过程中每48h更换1次诱导液；

所述诱导培养过程中应用的无血清纯化培养基以DMEM/F12液体培养基为基础培养基，每100ml包括：1~3mg转铁蛋白、氢化可的松5~15μl、胰岛素5~15μl、谷氨酰胺1~3ml、碱性成纤维生长因子18~22ng和表皮生长因子18~22ng。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导液的制备方法，包括：

采用常规方法培养得到嗅鞘细胞培养物，用无血清纯化培养基纯化嗅鞘细胞培养物，当所述嗅鞘细胞培养物中嗅鞘细胞的纯度在90%以上时，开始收集嗅鞘细胞纯化液，收集嗅鞘细胞纯化液根据嗅鞘细胞的纯度、状态，为45~50h时嗅鞘细胞纯化液与含血清培养基交替换液，再继续使用无血清纯化培养基培养嗅鞘细胞，再培养45~50h后收集的无血清嗅鞘细胞上清液即为诱导液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述O₂的体积浓度为3%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为21d。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗅黏膜间充质干细胞传至第4代时进行诱导。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的温度为35~42℃。