CN109735489B

CN109735489B - 溴离子在软骨组织工程中的应用

Info

Publication number: CN109735489B
Application number: CN201910103585.2A
Authority: CN
Inventors: 于涛; 刘旭; 周长忍
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-02-01
Also published as: CN109735489A

Abstract

本发明提供了溴离子在软骨组织工程中的应用。本发明首次提出并证明了溴离子可促进软骨细胞的增殖、分化及软骨细胞外基质(例如糖胺多糖等)的分泌，具备诱导软骨细胞再生及其分化的功能，可以有效起到促进软骨修复的作用；同时，溴离子对细胞的增殖、铺展和黏附无明显影响。本发明还提供了负载溴离子微球，可直接注射到缺损部位进行原位修复或将所述的微球复合于支架材料上制成生物支架材料；所述的生物支架材料可用作软骨‑软骨下骨缺损植入材料，具有优异的体外生物活性，显著的体内软骨‑软骨下骨一体化修复的双向生物学功能特性，在软骨‑软骨下骨缺损修复领域具有广阔的应用前景。

Description

溴离子在软骨组织工程中的应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，特别涉及溴离子在软骨组织工程中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是最常见的慢性自身免疫或者自身炎症机制功能缺失的疾病，发生于主要承重关节，如髋关节和膝盖等。根据近期的统计数据，全球OA的患病率已超过4％，而在老年人群中患病率尤其高，甚至超过18％，已严重影响人类的健康。目前而言，OA的治疗仍处于相对保守的阶段，通常包括适量锻炼、减肥或辅助减轻关节压力、止痛药缓解等方法，尚无有效的针对性治疗方案；如果骨关节严重恶化，人工关节置换手术就势在必行，这大大影响了患者后期的健康活动。骨关节主要包括关节软骨、软骨下骨和包被关节的滑膜组织。

目前，骨关节炎治疗的主要目的是通过各种措施减轻关节疼痛和改善关节功能。临床治疗包括非手术和手术治疗；而药物治疗构成了非手术治疗的主要组成部分。过去十年，在全世界范围内，软骨的组成成分软骨素和氨基葡萄糖被越来越多的指南所推荐使用。目前，氨基葡萄糖仍是美国最受欢迎的关节软骨营养药物，在欧洲，该产品被作为处方药品进行管理。但是目前针对氨基葡萄糖和硫酸软骨素治疗骨关节炎的疗效受到质疑：2006年，美国犹他州立大学医学院的Clegg DO等发现，氨基葡萄糖和硫酸软骨素单独或联合治疗并不能明显减轻膝骨关节炎患者的疼痛症状。2010年，瑞典伯尔尼大学的Simon Wandel等发现，与安慰剂相比，氨基葡萄糖单药治疗能更好地减轻关节疼痛，但没有临床显著性差异；而硫酸软骨素单药治疗和氨基葡萄糖及硫酸软骨素联合治疗均不能明显改善关节疼痛。骨关节炎的主要治疗药物为镇痛药和非甾体抗炎药，但这些药物往往会引起严重的胃肠道和心血管不良反应，尤其是长期应用时。最理想的治疗药物是既能减轻关节疼痛又能延缓关节结构破坏进展的病程改善药物；所以具备药物功能的新型软骨修复材料体系的建立具有很大的研究价值。

以往对OA的研究多集中在非钙化软骨，认为软骨细胞凋亡、软骨基质降解是OA的主要发病机制。近年来许多研究表明OA的发生也可能源于软骨下骨和软骨钙化层结构。骨重塑异常导致的软骨下骨密度增高、硬化或缺损，极大地减弱了软骨下骨吸收应力震荡的作用，使其丧失保护关节软骨的功能，引起继发性关节软骨退变。软骨和软骨下骨是一个相互依赖、不可分割的功能单位。

金属离子广泛存在于生物体之中，它们不仅存在于细胞液和细胞膜中，而且在核糖体、蛋白质和核酸之中也大量存在着金属离子。它们参与体内的物质运输、能量转换、信息传递、代谢调控等各种复杂的生物过程，以维持生命体系的一切正常活动。对生物体系而言，目前约有大约30多种元素为生物体所必须的，其中包括11种宏量元素(C、H、O、N、P、S、Cl、K、Na、Ca、Mg)，3种微量元素(Fe、Zn、Cu)。近期，吴成铁与常江研究员带领的研究团队在软骨-软骨下骨一体化修复的研究工作中取得突破性进展；通过金属元素Mn的引入不仅通过激活HIF信号通路促进兔子软骨细胞(Chondrocyte)和骨髓间充质干细胞(rBMSC)的增殖，支持软骨细胞成熟和促进骨髓间充质干细胞向成骨分化；而且可以通过诱导炎症模型的软骨细胞产生自噬保护软骨细胞。所以利用无机离子的生物学效应调控软骨及其软骨下骨的修复行为是有效的改良措施之一。

发明内容

本发明首要的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供溴离子在软骨组织工程中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种含溴离子的生物支架材料。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

溴离子(Br^-)在软骨组织工程中的应用。

发明人首次发现了溴离子可促进软骨细胞的增殖、分化及软骨细胞外基质(例如糖胺多糖等)的分泌，具备诱导软骨细胞再生及其分化的功能，可以有效起到促进软骨修复的作用。

所述的软骨组织工程包括调控软骨及其软骨下骨的修复行为等。

所述的溴离子可负载于微球上，作为软骨组织工程的细胞载体；直接注射到缺损部位进行原位修复或将所述的微球复合于支架材料上制成复合支架材料。

一种生物支架材料，包含溴离子。

所述的溴离子优选均匀分布于所述的生物支架材料中。

所述的支架材料优选为软骨组织工程支架材料。

所述的溴离子优选为通过在生物支架材料制备过程中添加溴化物加入至所述的生物支架材料中，例如，制成负载溴离子的微球。

所述的溴化物优选为氯化溴、溴化钠、溴化钾的至少一种。

所述的溴离子的浓度优选为10mM以下；进一步优选为1～5mM。

所述的微球的聚合物原料优选为可降解生物材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的至少一种。

所述的可降解生物材料的重均分子量优选为10000～100000。

所述的负载溴离子的微球的制备方法优选为：将含Br^-的水溶液滴加至PLGA溶液中，制备初乳；再将初乳滴加到聚乙烯醇水溶液中，冰浴搅拌6h，再室温搅拌24h，得到负载Br^-的PLGA微球。

所述的PLGA溶液的溶剂优选为二氯甲烷。

所述的聚乙烯醇水溶液优选为1.5％的聚乙烯醇水溶液。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明首次提出并证明了溴离子可促进软骨细胞的增殖、分化及软骨细胞外基质(例如糖胺多糖等)的分泌，具备诱导软骨细胞再生及其分化的功能，可以有效起到促进软骨修复的作用。同时，本发明的溴离子对细胞的增殖、铺展和黏附无明显影响。

2.本发明还提供了一种负载溴离子微球，有望用于软骨组织工程中，例如，直接注射进行原位修复或用于生物支架材料中。本发明的生物支架材料可用作软骨-软骨下骨缺损植入材料，其具有优异的体外生物活性，显著的体内软骨-软骨下骨一体化修复的双向生物学功能特性。因此，本发明中的生物支架在软骨-软骨下骨缺损修复领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1的结果分析图，其中，(a)为ATDC5在Br培养环境下的增殖活性分析结果，(b)为ATDC5在Br培养环境下的GAG分泌含量分析结果。

图2是ATDC5在Br^-培养环境下的活死染色照片图。

图3是ATDC5在Br^-培养环境下的阿辛蓝染色图。

图4是不同分子量的PLGA微球的载药量结果分析图。

图5是不同分子量的PLGA微球对释放速率影响的结果分析图。

图6是PLGA微球降解过程的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1溴离子(Br^-)对软骨细胞分化的影响

小鼠胚胎瘤细胞ATDC5(购自上海联迈生物工程有限公司)接种在96孔板中，细胞在含有不同浓度溴离子的DMEM/F12培养基中，于37℃，95％湿度的二氧化碳(CO₂)培养箱中培养。在考察溴离子(Br^-)对软骨细胞分化的影响时，设置了用NaBr配制得到的0.5mM、1mM，5mM，10mM，100mM这5个浓度梯度的溴离子溶液。

1.细胞增殖测试

分别在ATDC5细胞培养的第2、4、7、10、14天，利用CCK-8试剂盒(购自东仁化学DOJINDO，Japan)来检测细胞在不同培养基中的增殖情况。在细胞培养的第2、4、7、10、14天，吸出原有的培养基，加入110μL混有CCK-8试剂的培养基(每100mL的DMEM/F12培养基中混有10mL的CCK-8试剂)，于培养箱中孵育45min，反应完成后通过酶标仪测定450nm处的吸光度。

2.细胞分化测试

分别在ATDC5细胞培养的第7天和第14天，对培养的ATDC5分化成软骨细胞所分泌的糖胺多糖(GAG)的含量进行定量检测以及dsDNA(双链DNA)含量测定，计算得到每微克dsDNA的含量，再对数据进行均一化处理。

(1)木瓜蛋白酶裂解液的配制

以PBS溶解以下成份：50mM Na₃PO₄，20mM Nacetyl cysteine，28μL/mL木瓜蛋白酶，0.22μm滤膜过滤后4℃保存。

(2)细胞的裂解

培养的单层细胞或将培养的细胞团转移至孔板中，PBS洗两次，在孔板中加入300μL木瓜蛋白酶裂解液，封口膜封口后于60℃水浴中保温16h，完成后对孔板进行离心，200μL枪头吹打裂解液进行混均。将裂解液转移至1.5mL EP管中，离心取上清后立即测定或保存于-80℃待用。此样品用于双链DNA(ds DNA)及GAG含量的测定。

(3)ds DNA含量的测定

取步骤(2)得到的裂解产物样品，通过Nanodrop仪器测试dsDNA的浓度。

(4)GAG含量测定

取步骤(2)得到的裂解产物样品同DMMB染色液以体积比1:6的比例进行反应，完成后于酶标仪上检测525nm处的吸光值，以ds DNA含量进行标准化，计算每微克ds DNA中GAG的相对含量。

3.活/死细胞染色

在ATDC5细胞培养的第2、4、7、10、14天，对培养的ATDC5细胞进行活死染色，吸除培养基加入活死染料，室温避光孵育45min，吸去活死染料，加入PBS并在倒置荧光显微镜下观察。

图1显示了细胞增殖实验结果，其中，图1(a)反映了ATDC5在Br培养环境下的增殖活性，图1(b)展现了ATDC5在Br培养环境下的GAG分泌含量情况。从图1(a)可以看出，在含有溴离子的培养环境下，ATDC5细胞增殖能力检测OD值由第二天到第四天都出现了较大的降低，说明了ATDC5细胞在软骨诱导培养基的环境下分化成了软骨细胞。细胞分化测试结果方面，从图1(b)可以看出，与普通的培养环境比较下，在含有溴离子的培养环境下，溴离子的浓度达到1mM、5mM、10mM时，软骨细胞分泌GAG的能力出现了明显的提高，其中溴离子的浓度达到5mM时，软骨细胞分泌GAG的能力提高效果最为明显。由此可见，Br^-在1～10mM浓度范围内对ATDC5的增殖、铺展和黏附无明显影响；且Br^-对软骨分泌的GAG有提高，特别是浓度在5mM左右时。

从图2活死染色结果可以看出，由于ATDC5细胞分泌了细胞外基质(ECM)，部分染料被分泌的ECM沾染上，难以被冲洗干净，因而细胞的活死染色出现了除代表活细胞的绿色和代表死细胞的红色以外的橙色部分，这也进一步说明了ATDC5细胞在诱导培养基的作用下分化为软骨细胞，而没有出现明显的死细胞。

实施例2溴离子对软骨钙化的影响表征

本实施例中所用的分化培养基为在普通DMEM(Gibco)培养基加入以下终浓度的各成分制得：100nM地塞米松(Sigma,USA)，50μg/mL维生素C(Sigma,USA)，100μg/mL丙酮酸钠(阿拉丁,中国)，40μg/mL脯氨酸(阿拉丁,中国)，1vol％ITS(West,USA)，1vol％双抗(penicillin/streptomycin，品牌Gibco)。

小鼠胚胎瘤细胞ATDC5在添加了5％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃，95％湿度的CO₂培养箱中培养。当培养瓶中的细胞密度到90～95％时，将细胞进行胰酶消化、离心传代。细胞扩增到实验所需数量后，胰酶消化细胞并离心收集细胞，按2×10⁵/孔的密度将细胞接种于96孔培养板中，待细胞贴壁生长24h后，加入含不同浓度Br离子(0.5mM、1mM，5mM，10mM，100mM)的分化培养基。

阿辛蓝染色分析：阿辛蓝(Alcian Blue)1g溶于100mL 0.1mol/L醋酸纳-盐酸缓冲液中，配制得到阿辛蓝溶液。以10％多聚甲醛进行固定，PBS洗两次，以阿辛蓝溶液染色30min，PBS洗去浮色，进行显微镜观察并拍照。

结果如图3所示，Br离子浓度在1～5mM时，软骨细胞阿辛蓝着色程度最高，表明Br在5mM浓度范围对软骨细胞GAG多糖有促进作用。

实施例3负载溴离子微球的制备

本实施例利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备负载Br^-的PLGA微球。

将PLGA溶解在二氯甲烷中，将含Br^-的水溶液(NaBr水溶液)滴加其中，制备初乳；再将初乳滴加到1.5％的聚乙烯醇水溶液中，冰浴搅拌6h，再室温搅拌24h，得到负载Br^-的PLGA微球。

通过上述方法，分别利用不同分子量的PLGA(重均分子量10000、30000、100000的PLGA，购自济南岱罡生物工程有限公司)制备得到了不同的PLGA微球。对PLGA微球的载药量、离子释放速率和降解性能等进行了测定。

1.载药量：精密称取10mg的PLGA微球，利用浓硝酸硝解，并定容到10mL，利用电感耦合等离子体法ICP测定钠(Na)元素的含量(ICP-AES,Optima 5300DV,Perkin Elmer,USA)，计算得到PLGA微球中NaBr的含量，再依据中国药典2015年版9015药品晶型研究及晶型质量控制指导原则的“(三)载药量和包封率的检査”计算得到载药量。

2.离子释放速度：取20mg的PLGA微球，与5mL磷酸盐缓冲液(pH＝5.5)一起加入在塑料试管中，置于37℃的恒温摇床中，以100r/min的速度进行释放试验，定时取出0.5mL溶液，并向试管中补加0.5mL新鲜的PBS溶液，继续震荡。利用定时取出的溶液，通过离子色谱(1260infinity,Agilent Technologies,USA)检测溶液中Br的含量，计算得到定期释放的NaBr的含量，再计算得到离子释放的速度。

如图4所示，分子量越高，Br的载药量就越高，当PLGA分子量100000时，其载药量达到了5.5％。

不同分子量的PLGA微球的释放速率如图5所示，PLGA的降解性能与PLGA的分子量有负相关性。当PLGA的分子量越大时，PLGA微球的降解性能就越差，因此药物的释放速率也就越低。同时，分别在第4天、第7天、第14天通过扫描电镜对PLGA微球的降解情况进行观察，其中，由重均分子量为30000制得的PLGA微球结果如图6所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.溴离子在软骨组织工程中的应用，其特征在于：

所述的溴离子促进软骨细胞的增殖、分化及软骨细胞外基质的分泌，诱导软骨细胞再生及分化；

所述的溴离子的浓度为1～5 mM；

所述的溴离子负载于微球，直接注射到缺损部位进行原位修复或将所述的微球复合于支架材料上制成复合支架

材料；

所述的软骨组织工程包括调控软骨及其软骨下骨的修复行为。

2.一种生物支架材料，其特征在于：

包含溴离子；

所述的溴离子的浓度为1～5 mM；

所述的溴离子均匀分布于所述的生物支架材料中；

所述的支架材料为软骨组织工程支架材料；

所述的溴离子通过在生物支架材料制备过程中添加溴化物加入至所述的生物支架材料中；

所述的溴离子负载于微球；

所述的微球的聚合物原料为可降解生物材料；

所述的溴化物为氯化溴、溴化钠、溴化钾的至少一种；

所述的可降解生物材料的平均分子量为10000～100000；

所述的微球的聚合物原料为聚乳酸、聚羟基乙酸和乳酸 -羟基乙酸共聚物中的至少一种；

所述的负载溴离子的微球的制备方法为：将含Br-的水溶液滴加至 PLGA溶液中，制备初乳；再将初乳滴加到聚乙烯醇水溶液中，冰浴搅拌6h，再室温搅拌24h，得到负载溴离子的微球；

所述的 PLGA的重均分子量为10000～100000；

所述的 PLGA溶液的溶剂为二氯甲烷；

所述的聚乙烯醇水溶液1.5%的聚乙烯醇水溶液。