CN109725096A - 一种向日葵花盘挥发物的收集方法及装置 - Google Patents

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蒋杰贤
季香云
张�浩
陈义娟
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Abstract

本发明公开了一种向日葵花盘挥发物的收集方法及装置，其方法包括：4月底种植向日葵，待至7月中下旬，向日葵花期茂盛时，挑选无虫危害的向日葵花盘用于挥发物收集；将向日葵花盘剪下后，立即用无菌蒸馏水浸泡的湿润棉花包裹住与花盘连接的植株茎秆受伤处，防止受伤处释放额外的挥发物；用圆柱形玻璃罩将待测向日葵花盘罩住，放在洁净A4纸铺垫的平板玻璃桌上，用以收集花盘挥发物；固相微萃取的萃取头在230℃条件下被活化30分钟后，将其经玻璃罩上口径的不锈钢圆孔插入玻璃罩内，连续富集向日葵花盘挥发物；挥发物被富集30分钟后，立即取出萃取头，230℃条件下热解析2分钟后进行气相色谱–质谱联用分析。本发明能准确科学地鉴定出向日葵花盘释放的挥发物。

Description

一种向日葵花盘挥发物的收集方法及装置
技术领域
本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一种向日葵花盘挥发物的收集方法及装置。
背景技术
向日葵(Helianthus annuus)为菊科向日葵属的一年生草本植物，其植株在幼苗期、现蕾期和成熟期释放挥发物相对较少，而在开花期释放的较多且难被收集。此外，向日葵开花期释放的挥发物主要集中在花盘上。收集向日葵花盘挥发物，是鉴定其化学组分的重要前期准备过程，因此，设计精准科学的挥发物收集装置，是鉴定向日葵花盘挥发物组分的关键因素。固相微萃取法(Solid-phase microextraction, SPME)和吸附剂吸附法是收集植物挥发物的两种方法。查阅相关资料发现，植物挥发物组分鉴定的准确性会因收集方法的不同而发生变化。这两种方法是否都能精准测定向日葵花盘释放的挥发物，有待核实。
据记载，收集向日葵花盘挥发物的装置，主要是用纱网袋罩在花盘上，这种装置有以下不足：1)纱网袋有网眼缝隙，向日葵花盘释放的挥发物会从这些网眼“逃逸”出去，因此，采用该装置检测到的向日葵花盘挥发物成分，会比实际释放出的少；2)纱网袋一般由聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)等制成，且味道比较大，若将纱网袋罩在花盘上，这会增加不少杂质，依据该装置收集的挥发物成分并非是花盘自身实际释放出的。故而，避免以上两点不足，对准确收集并鉴定向日葵花盘挥发物，尤为重要。
在农林业生产上，向日葵常常被作为诱集植物控制靶标植食性昆虫，其花盘能够诱杀大豆上的钻心虫(Dectes texanus)、黄瓜上的长毛草盲蝽(Lygus rugulipennis)以及辣椒上的茶翅蝽(Halyomorpha halys)；此外，向日葵花盘对棉田绿盲蝽(Lygocoris lucorum)、果园白星花金龟(Potosia brevitarsis)和桃蛀螟(Conogethes pnctiferalis)也具有较强的引诱作用。为此，成功收集与准确鉴定向日葵花盘挥发物，对进一步分析每种挥发物引诱靶标植食性昆虫的功能至关重要，更是研发植物引诱剂产品的必要条件。
发明内容
本发明的目的是根据当前向日葵花盘挥发物收集装置的缺陷而提供的一种挥发物收集方法及收集装置，其原理是经过改进花盘挥发物收集装置，达到完全收集花盘挥发物、避免杂质气体干扰花盘释放挥发物的目标；此外，比较2种收集方法(本发明、Tenax吸附剂吸附法)对收集与鉴定向日葵花盘挥发物的影响。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一种向日葵花盘挥发物的收集方法，该方法包括以下具体步骤：
a、种植向日葵及采集向日葵花盘
选择裸露的田块，且田块附近没有其他植物，以避免其他植物对向日葵的化感作用；4月底，在裸露田块里，用铁锹挖点穴，每穴深15-25cm、间距40-50cm，将3-5粒饱满的向日葵籽种放进每个点穴内；之后，5-7天浇水一次；种植过程中，不使用任何农药；待至向日葵花期茂盛时即7月中、下旬，挑选无虫危害的向日葵花盘；
b、向日葵花盘处理
将向日葵花盘剪下，立即用无菌蒸馏水浸泡过的湿润棉花包裹住与向日葵花盘连接的植株茎秆受伤处，防止受伤处释放额外的挥发物；然后，使向日葵花盘竖立摆放在洁净的平板玻璃上，用洁净的圆柱形玻璃罩将向日葵花盘罩住；
c、微萃取挥发物
用洁净圆形不锈钢片盖住玻璃罩上口径，不锈钢片中间有圆孔，其孔的半径1.5-1.7mm，用铝箔纸封孔；将萃取头在气相色谱的汽化室活化，活化温度230℃，活化30min后随即将萃取头通过不锈钢片中间的圆孔插入到玻璃罩内富集挥发物，富集30min后取出萃取头，230℃条件下热解析2 min后进行气相色谱–质谱(GC/MS)联用分析；
d、挥发物检测
挥发物用气相色谱-质谱联用仪分析；HP-Wax石英毛细管色谱柱规格为30m×0.25mm×0.25μm，用99.999%的氦气作为载气气谱，氦气流量为1ml·min-1，汽化温度为230℃，分流进样，分流比15∶1；柱起始温度60℃，此温度下恒温2min，然后以20℃·min-1的速率逐渐升至230℃，230℃恒温10min；EI的电离方式，230℃的接口温度，200℃的离子源温度；70eV电离能，400V倍增电压，41~400amu的扫描质量范围；根据质谱库，鉴定向日葵花盘释放挥发物的化学成分；参照标准化合物的离子峰和保留时间，对比扫描的质谱图和检索结果的标准图谱，鉴定每种挥发物的化学结构；采用峰面积归一化法，计算每种向日葵花盘挥发物的相对含量。
一种实施上述方法的装置，该装置包括平板玻璃、 圆柱形玻璃罩、不锈钢片及微萃取器，所述圆柱形玻璃罩顶部设有圆孔，不锈钢片中部设有小孔，圆柱形玻璃罩设于平板玻璃上，不锈钢片盖在圆柱形玻璃罩顶部的圆孔上，微萃取器通过不锈钢片中部的小孔伸入圆柱形玻璃罩内。
所述不锈钢片中部小孔半径为1.3-1.7mm。
本发明其装置结构的超微化决定了它能避免经典固相萃取的较多缺点；挥发物在汽化室内被解吸后,靠流动相将其导入色谱柱,完成提取、分离和浓缩的一整套过程；具有操作更简易、携带更便利、运行费用更低、萃取速度更快、功能更齐全等优点，克服了固相萃取回收率低、吸附剂孔道易堵塞等缺点。此外，与传统的纱网袋相比，本发明中的玻璃罩更能收集完全向日葵实际释放的挥发物、也不会带来杂质气体。
附图说明
图1为本发明装置结构示意图；
图2为本发明装置使用状态图；
图3为Tenax吸附剂吸附法收集向日葵花盘挥发物装置示意图；
图4 为本发明采集方法的向日葵花盘挥发物的GC-MS总离子流色谱图；
图5为Tenax-TA吸附剂吸附法的向日葵花盘挥发物的GC-MS总离子流色谱图。
具体实施方式
参阅图1，本发明装置包括平板玻璃4、 圆柱形玻璃罩5、不锈钢片6及微萃取器7，所述圆柱形玻璃罩5顶部设有圆孔，不锈钢片6中部设有小孔，圆柱形玻璃罩5设于平板玻璃4上，不锈钢片6盖在圆柱形玻璃罩5顶部的圆孔上，微萃取器7通过不锈钢片6中部的小孔伸入圆柱形玻璃罩5内，微萃取器7的萃取头8富集挥发物。
参阅图2，收集向日葵花盘3挥发物时，将向日葵花盘剪下，立即用无菌蒸馏水浸泡过的湿润棉花1包裹住与向日葵花盘3连接的植株茎秆受伤处，将向日葵花盘3竖立摆放在洁净的平板玻璃4上，用洁净的圆柱形玻璃罩5将向日葵花盘3罩住；用洁净圆形不锈钢片6盖住玻璃罩5上口径，不锈钢片6中间有圆孔，用铝箔纸封孔；将微萃取器7在气相色谱的汽化室活化，活化后随即将微萃取器7通过不锈钢片6中间的圆孔插入到玻璃罩5内富集挥发物，富集后取出微萃取器7，对微萃取器7进行气相色谱–质谱(GC/MS)联用分析。
实施例1
a、设计试验处理：种植向日葵和收集向日葵花盘挥发物
向日葵(2016年4月购于京东网恒林园艺专营店)被种植在裸露的田块上(田块附近没有其他植物，以避免其他植物对向日葵的化感作用)；4月底，在裸露地用铁锹挖“点穴”(每穴深度15-25厘米、间距40-50厘米)，将3-5粒饱满的向日葵种子放进每个“点穴”内；之后，5-7天浇水一次；种植过程中，不使用任何农药；待至向日葵花期茂盛时(7月20日左右)，挑选无虫危害的向日葵花盘用于挥发物收集。将向日葵花盘用剪刀剪下后，立即用湿润棉花(无菌蒸馏水浸泡)包裹住与花盘连接的植株茎秆受伤处，防止受伤处释放额外的挥发物；然后，用圆柱形玻璃罩将待测向日葵花盘罩住，放在洁净的平板玻璃上，用以收集花盘挥发物。
b、基于固相微萃取法的挥发物检测法
参阅图2，收集向日葵花盘挥发物时，先将向日葵花盘(花盘与茎秆连接的受伤处用湿润棉花球包裹)放在洁净的平板玻璃上，然后用圆柱形玻璃罩罩住向日葵花盘，使花盘竖立摆放；用圆形不锈钢片(不锈钢片中间的圆孔半径1.3-1.7mm)盖住玻璃罩上口径，铝箔纸封口。萃取花盘挥发物前，先将萃取头在气相色谱的汽化室活化(活化温度230℃)，活化30min后随即将萃取头插入到玻璃罩内富集挥发物，富集30min后取出萃取头，230℃条件下热解析2 min后进行气相色谱–质谱(GC/MS)联用分析。为消除收集装置而非向日葵花盘自身释放的挥发物对本试验的干扰，在收集花盘挥发物前，在上述活化条件下首先检测空玻璃罩的空白数据(对照)。重复3次。固相微萃取的萃取头(50/30μm，DVB/CAR/PDMS，Stableflex自动萃取头)购于美国Supelco公司。
c、基于固相微萃取法的挥发物检测条件
将萃取头在230℃气室内热解析，2min后，将挥发物用气相色谱-质谱联用仪分析。HP-Wax石英毛细管色谱柱规格为30m×0.25mm×0.25μm，用99.999%的氦气作为载气气谱，氦气流量为1ml·min-1，汽化温度为230℃，分流进样(分流比15：1)；柱起始温度60℃，此温度下恒温2min，然后以20℃·min-1的速率逐渐升至230℃，230℃恒温10min；EI的电离方式，230℃的接口温度，200℃的离子源温度；70eV电离能，400V倍增电压，41~400amu的扫描质量范围。根据美国国家标准与技术研究院的质谱库，鉴定向日葵花盘释放挥发物的化学成分。参照标准化合物的离子峰和保留时间，对比扫描的质谱图和检索结果的标准图谱，从而科学鉴定每种挥发物的化学结构。采用峰面积归一化法，计算每种花盘挥发物的相对含量。
对比例2
a、设计试验处理：种植向日葵和收集向日葵花盘挥发物
向日葵(2016年4月购于京东网恒林园艺专营店)被种植在裸露的田块上(田块附近没有其他植物，以避免其他植物对向日葵的化感作用)；4月底，在裸露地用铁锹挖“点穴”(每穴深度15-25厘米、间距40-50厘米)，将3-5粒饱满的向日葵种子放进每个“点穴”内；之后，5-7天浇水一次；种植过程中，不使用任何农药；待至向日葵花期茂盛时(7月20日左右)，挑选无虫危害的向日葵花盘用于挥发物收集。将向日葵花盘用剪刀剪下后，立即用湿润棉花(无菌蒸馏水浸泡)包裹住与花盘连接的植株茎秆受伤处，防止受伤处释放额外的挥发物；然后，用圆柱形玻璃罩将待测向日葵花盘罩住，放在洁净A4纸铺垫的平板玻璃桌上，用以收集花盘挥发物。
b、基于Tenax-TA吸附剂吸附法的挥发物收集法
参阅图3，收集向日葵花盘挥发物时，先将向日葵花盘(花盘与茎秆连接的受伤处用湿润棉花球包裹)放在洁净的平板玻璃桌上，然后用圆柱形玻璃罩罩住向日葵花盘，使花盘竖立摆放；用橡胶塞塞住玻璃罩上口径，并将两个插管经橡胶塞插进玻璃罩内，分别作为出气管和入气管。在无水硫酸钠干燥器与抽气泵之间连接吸附管(管内装载80目的150mgTenax-TA吸附剂；管长150mm，管内外直径分别4mm、6mm)；抽气速率3L/min，抽气泵连续抽气30min。二氯甲烷(1.5mL用量)淋洗吸附挥发物后的吸附管。重复3次。Tenax-TA吸附剂被用于收集花盘挥发物前，先在活化仪上活化2h(活化温度300℃)。
c、基于Tenax-TA吸附剂吸附法的挥发物检测条件
将吸附了挥发物的Tenax填料溶解于1.5mL二氯甲烷中，用涡旋仪震荡摇匀，2min后，加入0.2ml甲醇，使混合溶液分层，取1.0μL上清液进样挥发物分析。其次是设置色谱柱检测条件，30m×0.25mm×0.25μm的石英毛细管色谱柱；柱温60℃，此温度下恒温2min，然后以20℃·min-1的速率逐渐升至230℃，230℃恒温10min；汽化温度为230℃；用99.999%的氦气作为载气气谱，氦气流量为1ml·min-1，汽化温度为230℃，分流进样(分流比15：1)；质谱检测器：EI的电离方式，70eV电离能；质谱标准库：美国国家标准与技术研究院的质谱库。
效果对比
运用本发明收集并鉴定向日葵挥发物后(GC-MS总离子流色谱图见图4)，分析结果显示，向日葵花盘挥发物主要由α-蒎烯和β-水芹烯组成，相对含量分别为74.09±4.28、18.83±3.51%；此外，γ-松油烯(1.32±0.19%)、β-蒎烯(1.43±0.17%)、莰烯(0.60±0.06%)、4-蒈烯(0.57±0.11%)、右旋萜二烯(1.61±0.34%)、桉油精(0.62±0.05%)、巴伦西亚橘烯(0.95±0.07%)也是向日葵花盘挥发物组分，但含量相对较少。
使用Tenax-TA吸附剂吸附法检测出的向日葵花盘挥发物主要是一些杂质(GC-MS总离子流色谱图见图5)，主要包括：十甲基环五硅氧烷和十二甲基环六硅氧烷，这两种组分的相对含量总和占50%以上。
比较本发明方法和基于Tenax-TA吸附剂吸附法的挥发物收集法，前者能客观准确地反映向日葵花盘自身实际释放出的挥发物成分，而后者不能检测出花盘挥发物。因此，针对向日葵花盘挥发物的检测，本发明的挥发物采集方法，是收集与检测向日葵挥发物的正确方法。

Claims (3)

1.一种向日葵花盘挥发物的收集方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
a、种植向日葵及采集向日葵花盘
选择裸露的田块，且田块附近没有其他植物，以避免其他植物对向日葵的化感作用；4月底，在裸露田块里，用铁锹挖点穴，每穴深15-25cm、间距40-50cm，将3-5粒饱满的向日葵籽种放进每个点穴内；之后，5-7天浇水一次；种植过程中，不使用任何农药；待至向日葵花期茂盛时,即7月中、下旬，挑选无虫危害的向日葵花盘；
b、向日葵花盘处理
将向日葵花盘剪下，立即用无菌蒸馏水浸泡过的湿润棉花包裹住与向日葵花盘连接的植株茎秆受伤处，防止受伤处释放额外的挥发物；然后，使向日葵花盘竖立摆放在洁净的平板玻璃上，用洁净的圆柱形玻璃罩将向日葵花盘罩住；
c、微萃取挥发物
用洁净圆形不锈钢片盖住玻璃罩上口径，不锈钢片中间有圆孔，其孔的半径1.3-1.7mm，用铝箔纸封孔；将萃取头在气相色谱的汽化室活化，活化温度230℃，活化30min后，随即将萃取头通过不锈钢片中间的圆孔插入到玻璃罩内富集挥发物，富集30min后取出萃取头，230℃条件下热解析2 min后进行气相色谱–质谱(GC/MS)联用分析；
d、挥发物检测
挥发物用气相色谱-质谱联用仪分析；HP-Wax石英毛细管色谱柱规格为30m×0.25mm×0.25μm，用99.999%的氦气作为载气气谱，氦气流量为1ml·min-1，汽化温度为230℃，分流进样，分流比15∶1；柱起始温度60℃，此温度下恒温2min，然后以20℃·min-1的速率逐渐升至230℃，230℃恒温10min；EI的电离方式，230℃的接口温度，200℃的离子源温度；70eV电离能，400V倍增电压，41~400amu的扫描质量范围；根据质谱库，鉴定向日葵花盘释放挥发物的化学成分；参照标准化合物的离子峰和保留时间，对比扫描的质谱图和检索结果的标准图谱，鉴定每种挥发物的化学结构；采用峰面积归一化法，计算每种向日葵花盘挥发物的相对含量。
2.一种实施权利要求1所述方法的装置，其特征在于，该装置包括平板玻璃、 圆柱形玻璃罩、不锈钢片及微萃取器，所述圆柱形玻璃罩顶部设有圆孔，不锈钢片中部设有小孔，圆柱形玻璃罩设于平板玻璃上，不锈钢片盖在圆柱形玻璃罩顶部的圆孔上，微萃取器通过不锈钢片中部的小孔伸入圆柱形玻璃罩内。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述不锈钢片中部小孔半径为1.3-1.7mm。
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