CN109709202A - 一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法 - Google Patents

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白艳秋
吴治昊
王朝弘
刘豫屏
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Abstract

本发明涉及一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，包括以下步骤：(1)人工合成人类的半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸，然后将半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸转建构在哺乳细胞表达载体pDNA3.1(+)上，得到人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体；(2)将人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体在非人源细胞上进行细胞转染，然后进行裂解细胞并提取细胞裂解蛋白；(3)将提取获得的细胞裂解蛋白以及反应底物置于反应缓冲液中，加入待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物，进行反应后，检测底物及反应产物的含量，然后确定待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的抑制效果。与现有技术相比，本发明建立了快速且稳定的筛选方式。

Description

一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，具体涉及一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法。
背景技术
克拉伯病又称为Krabbe病，由丹麦儿科医师Krabbe于1916年首先报道。依据其临床特点，亦称为婴儿家族性弥漫性硬化。克拉伯病为常染色体隐性遗传代谢性疾病，突变基因位于14p。克拉伯病的基因缺陷引起半乳糖脑苷-β-半乳糖苷酶缺乏，是导致脑白质内有许多半乳糖脑苷的沉积而发病的遗传代谢性疾病。本病预后极差，婴儿型患者常于1岁之内病故。晚发者可生存至10岁左右。由于半乳糖神经酰胺转移酶能将神经酰胺转变为半乳糖脑苷，抑制半乳糖神经酰胺转移酶的活力，减少半乳糖脑苷在脑白质内累积沈淀成为克拉伯病的可能治疗方法之一，如专利AU2017278057A1就公开了一种神经酰胺半乳糖基转移酶抑制剂及其应用。但是，现有的神经酰胺半乳糖基转移酶抑制剂药物的效果评价较为复杂，使得高效神经酰胺半乳糖基转移酶抑制剂药物的筛选很慢，因此，半乳糖神经酰胺转移酶(CGT)抑制剂的快速筛选方法因此显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，包括以下步骤：
(1)人工合成人类的半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸，然后将半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸转建构在哺乳细胞表达载体pDNA3.1(+)上，得到人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体；
(2)将步骤(1)制备得到的人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体在非人源细胞上进行细胞转染，然后进行裂解细胞并提取细胞裂解蛋白；
(3)将提取获得的细胞裂解蛋白以及反应底物置于反应缓冲液中，加入待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物，进行反应后，检测底物及反应产物的含量，然后确定待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的抑制效果。
由于本发明的反应中使用的为带有特殊标记的底物，反应后可使用RapidFire高通量质谱系统读取反应后的底物和产物含量，因此较传统方法更加稳定及高通量。
所述的非人源细胞选自仓鼠卵巢细胞。
本发明中采用的半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸序列是根据美国NCBI网站提供讯息设计，人工合成委托生工生物工程公司代为人工合成。采用的细胞转染、裂解细胞、细胞裂解蛋白的提取均为现有技术。
优选的，所述的缓冲液包括HEPES、二烯酰基磷酰胆碱、MgCl2、MnCl2、牛血清白蛋白、KCl、EGTA和CHAPS，其中，所述HEPES的浓度为8～12nM，所述二烯酰基磷酰胆碱的浓度为30～40μM，所述MgCl2的浓度为3～6mM，所述MnCl2的浓度为3～6mM，所述牛血清白蛋白的质量分数为0.8％～1.5％，所述KCl的浓度为12～18mM，所述EGTA的浓度为0.8～1.5mM，所述CHAPS的浓度为5～10mM。
所述的底物包括神经酰胺和二磷酸尿苷半乳糖，所述神经酰胺和二磷酸尿苷半乳糖的质量比为(1.6～1.8):1。
反应中使用的为带有特殊标记的神经酰胺(C6-NBD-dihydro-ceremide)，反应后可使用RapidFire高通量质谱系统读取反应后的底物和产物含量，并且和内源表达的神经酰胺以及其产物能有所区分。
所述底物及反应产物的含量通过RapidFire高通量质谱系统读取得到。
所述细胞裂解蛋白、缓冲液、底物及待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的加入量分别为：细胞裂解蛋白的质量为3～5μg,神经酰胺的浓度为8～12μM,二磷酸尿苷半乳糖的浓度为15～20μM，待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的浓度为0.001μM～50μM，缓冲液使整个反应体系达到20μL。
所述反应的温度为35～40℃，反应时间为0.5～2h。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
使用RapidFire高通量质谱系统读取反应后的底物和产物含量，可提供在体外筛选半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速且稳定的筛选方法；
附图说明
图1是在人类半乳糖神经酰胺转移酶反应中测试不同量的细胞裂解产物以用来检测反应中的最优化细胞裂解产物条件
图2是在人类半乳糖神经酰胺转移酶反应中测试不同浓度的神经酰胺(底物)以用来检测反应中的最优化神经酰胺(底物)条件；
图3是使用半乳糖神经酰胺转移酶(CGT)抑制剂对此方法进行验证；
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，包括以下步骤：
(1)人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体的构建
将经由人工合成能够表达的人类半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸转建构在哺乳细胞表达载体pDNA3.1(+)(ThermoFisher Scientific,Grand Island,NY)上
(2)使用非人源细胞进行人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体的细胞转染以及细胞裂解蛋白的制备
将人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体转染入非人源细胞(中国田鼠卵巢细胞；CHO)中。转染后使用哺乳细胞蛋白提取液(Mammalian Protein Extraction Reagent；M-PER)裂解细胞并且提取细胞裂解蛋白；
三、使用含有人类半乳糖神经酰胺转移酶的细胞裂解产物进行体外药物筛选方法的建立
首先将定量后的人类半乳糖神经酰胺转移酶的细胞裂解蛋白进行蛋白定量，在反应缓冲液(10mM HEPES(pH 7.2)，35μM dioleoylphosphatidylcholine,，5mM MgCl2，5mMMnCl2，1％BSA，15mM KCl,1mM EGTA,8mM CHAPS)中加入定量后的细胞裂解产物以及反应中所需要的底物，底物为带有C6-NBD的神经酰胺(C6-NBD-dihydro-ceremide)和17.5μM二磷酸尿苷半乳糖(UDP-Galactose)，在37℃中反应一个小时。反应后的样品经由RapidFire高通量质谱系统读取反应后的底物和产物含量。方法建立过程中，反应中含有人类半乳糖神经酰胺转移酶的细胞裂解产物以及带有特殊标记物的神经酰胺(底物)所需加入的量都需经过优化测试，测试时不同量或浓度的细胞裂解产物以及底物被加入反应后，最佳优化量以及浓度如同图1以及图2中所展示：4ug的细胞裂解产物以及10uM的神经酰胺决定被选取为反应中的最优化条件。
四、半乳糖神经酰胺转移酶(CGT)药物的筛选方法的应用实例
人类半乳糖神经酰胺转移酶反应进行前，在含有细胞裂解产物，特殊标记物的神经酰胺(C6-NBD-dihydro-ceremide)，和二磷酸尿苷半乳糖(UDP-Galactose)的混合物中加入等待测试筛选的抑制剂(0.001μM–50μM in 0.5％DMSO)，在37℃中孵育一个小时后使用RapidFire高通量质谱系统读取反应后的底物和产物含量，以没有加入抑制剂的反应当做对照，计算不同浓度的抑制剂对于反应的抑制效果(％effect)，结果如图3所展示，同一个抑制剂参考化合物的四次重复实验，得到的结果非常类雷同，由次证明此筛选方法的稳定性。
另用此筛选方法，挑选出对于人类半乳糖神经酰胺转移酶具有较高抑制性的化合物(半抑制浓度(IC50)小于5uM的抑制剂)进行后续细胞以及动物实验，可以减少需要进行细胞以及动物实验的化合物数量。

Claims (8)

1.一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人工合成人类的半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸，然后将半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸转建构在哺乳细胞表达载体pDNA3.1(+)上，得到人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体；
(2)将步骤(1)制备得到的人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体在非人源细胞上进行细胞转染，然后进行裂解细胞并提取细胞裂解蛋白；
(3)将提取获得的细胞裂解蛋白以及反应底物置于反应缓冲液中，加入待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物，进行反应后，检测底物及反应产物的含量，然后确定待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的抑制效果。
2.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述的非人源细胞选自仓鼠卵巢细胞。
3.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述的缓冲液包括HEPES、二烯酰基磷酰胆碱、MgCl2、MnCl2、牛血清白蛋白、KCl、EGTA和CHAPS，其中，所述HEPES的浓度为8～12nM，所述二烯酰基磷酰胆碱的浓度为30～40μM，所述MgCl2的浓度为3～6mM，所述MnCl2的浓度为3～6mM，所述牛血清白蛋白的质量分数为0.8％～1.5％，所述KCl的浓度为12～18mM，所述EGTA的浓度为0.8～1.5mM，所述CHAPS的浓度为5～10mM。
4.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述的底物包括神经酰胺和二磷酸尿苷半乳糖，所述神经酰胺和二磷酸尿苷半乳糖的质量比为(1.6～1.8):1。
5.根据权利要求4所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述神经酰胺为带有C6-NBD标记的神经酰胺。
6.根据权利要求5所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述底物及反应产物的含量通过RapidFire高通量质谱系统读取得到。
7.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述细胞裂解蛋白、缓冲液、底物及待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的加入量分别为：细胞裂解蛋白的质量为3～5μg,神经酰胺的浓度为8～12μM,二磷酸尿苷半乳糖的浓度为15～20μM，待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的浓度为0.001μM～50μM，缓冲液使整个反应体系达到20μL。
8.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述反应的温度为35～40℃，反应时间为0.5～2h。
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