CN109706128A - 基于甲壳动物戊肝病毒基因组序列的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于甲壳动物戊肝病毒基因组序列的检测方法及其应用。所述甲壳动物戊肝病毒（crustacea hepevirus），属于戊肝病毒，保藏编号为CCTCC No.V201869。病毒形态呈球形，直径27‑34 nm，能够感染罗氏沼虾。本发明还提供了上述甲壳动物戊肝病毒和同属病毒的检测方法和试剂盒。为甲壳类水产戊肝病毒的检测与防控提供新的可能。

Description

基于甲壳动物戊肝病毒基因组序列的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于水产养殖领域，具体涉及甲壳动物戊肝病毒基因组序列的检测方法及其应用。

背景技术

国际病毒分类委员会将戊肝病毒科（Hepeviridae）分为正戊肝病毒属（Orthohepevirus）和鱼戊肝病毒属（Piscihepevirus）。正戊肝病毒属包含所有的哺乳动物戊肝病毒和禽戊肝病毒，鱼戊肝病毒属包含鱼类戊肝病毒。然而，目前所有已知的戊肝科的病毒都是从脊椎动物或环境中分离到，戊肝病毒科的病毒还未见能够感染甲壳纲动物的报道，发明人首次在罗氏沼虾中发现一种戊肝病毒科的病毒，该病毒分类上属于一个全新的属，对该属命名为甲壳戊肝病毒属(Custahepevirus)，该病毒命名为甲壳动物戊肝病毒(crustacea hepevirus)。对此病毒的有效检测是进行该病毒乃至该属其他病毒的追踪、调研、预防和控制的前提，因此，需要提供一种有效的检测病毒的方法。

发明内容

针对感染甲壳动物的戊肝病毒的检测和防控需求，本发明提供特异性检测甲壳动物戊肝病毒（crustacea hepevirus）的方法，该病毒属于戊肝病毒科的新属和新种，能够感染甲壳类动物。

本发明的另一目的在于提供一种特异性检测上述新的戊肝病毒种及其病毒属的试剂盒，以便发明的检测方法得以广泛应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

甲壳动物戊肝病毒（crustacea hepevirus）属于戊肝病毒科，于2019年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCCNo. V201869。

所述甲壳动物戊肝病毒呈球形，为单股正链RNA病毒，直径为27-34 nm。能够感染罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）等甲壳类动物，主要感染的靶组织为沼虾的肝胰腺，症状表现为生长迟缓和高感染强度时的死亡。

所述甲壳动物戊肝病毒是指属于甲壳戊肝病毒属(Crustahepevirus)或以其他名称命名的该病毒属的病毒。由于戊肝病毒是RNA病毒，其用于复制其自身基因组RNA的依赖于RNA的RNA多聚酶缺少3’-5’外切酶活性，因此该酶在复制过程中没有纠错能力，其基因组的全部或部分存在有较大的变异性，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在同源性≥70%的变异，包含了变异碱基的子代病毒在同类宿主中仍然具有感染和继续复制后代的能力。作为新病毒，国际病毒分类委员会（ICTV）可能会给出其他的命名规则，因此甲壳动物戊肝病毒（crustacea hepevirus）作为该病毒的一个泛称，指代本发明所保护的同名病毒以及所有其他名称所代表的符合基因或多肽序列同源性的病毒。根据国际病毒分类委员会第十次报告中关于戊肝病毒科内不同属的划分标准（https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/positive-sense-rna-viruses/w/hepeviridae），同一个属的成员在宿主范围、ORF1的三个保守区（甲基转移酶、解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶）、遗传距离（属内氨基酸遗传距离小于0.6）或基因组结构上是相近的。借鉴ICTV的分类标准，将甲壳戊肝病毒属限定为与本发明中的甲壳动物戊肝病毒的ORF1中任意一个保守区（甲基转移酶methyltransferase、解旋酶helicase、RNA依赖的RNA聚合酶RdRp）的氨基酸遗传距离（p-distance）小于0.6的病毒。已测定的甲壳动物戊肝病毒CCTCC No. V201869的基因组序列如SEQ ID NO: 1所示，其3段ORF翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2-4所示。

由于甲壳动物戊肝病毒是一种单链RNA病毒，基因组RNA的合成直接由其依赖于RNA的RNA聚合酶进行复制，在RNA复制过程中，依赖于RNA的RNA聚合酶缺乏3’-5’的纠错功能，导致基因组在自然复制时容易发生突变，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在同源性≥70%的变异，这些基因组序列发生变异的病毒也属于本发明所指的甲壳动物戊肝病毒。因此本发明所指的甲壳动物戊肝病毒的基因组序列包含以下特征：

（a）：如SEQ ID NO: 1所示的RNA序列；或

（b）：与（a）的部分片段的同源性≥70%的RNA序列；或

（c）：与（a）的全部序列同源性≥70%的RNA序列；或

（d）：由符合（a）或（b）的特征的多个部分片段连接形成的序列。

甲壳动物戊肝病毒感染的组织中也存在包含以下序列特征的核酸序列：

（a）：与SEQ ID NO: 1所示的序列互补的部分RNA序列；或

（b）：与SEQ ID NO: 1所示的序列互补的全部RNA序列；或

（c）：与（a）或（b）的部分片段的同源性≥70%的RNA序列；或

（d）：与（a）或（b）的全部序列同源性≥70%的RNA序列；或

（e）：由符合（a）或（c）的特征的多个部分片段连接形成的序列。

甲壳动物戊肝病毒还含有由其基因组核酸序列翻译的多肽，其多肽序列符合以下特征：

（a）：SEQ ID NO: 1的基因组的全部或部分序列翻译的多肽序列；或

（b）：与（a）的全部或部分有≥70%同源性的序列翻译的多肽序列。

一种检测甲壳动物戊肝病毒的检测方法，所述甲壳动物戊肝病毒符合上述的全部或部分特征。

一种检测甲壳动物戊肝病毒的检测方法，所述的检测方法针对或采用了基于与上述要求相符的基因组序列所筛选的特异性序列进行检测。

一种检测甲壳动物戊肝病毒的检测方法，所要求的特异性序列是指从符合下列特征的核酸序列中优选的核酸特异性序列：

（a）：SEQ ID NO: 1的RNA序列；或

（b）：（a）转换的DNA序列；或

（c）：（a）和（b）的≥70%同源的RNA或DNA序列；或

（d）：包含（a）、（b）或（c）的简并碱基的RNA或DNA序列；或

（e）：用次黄嘌呤或其他等效碱基代替的（d）的简并碱基的RNA或DNA序列；或

（f）：与（a）或（b）或（c）或（d）或（e）互补的RNA和DNA序列。

上述核酸特异性序列长度的优选方案为12-3000nt；更优选的，长度为30nt-1200nt；最优选的，长度为40nt-600nt。

一种检测甲壳动物戊肝病毒的检测方法，所要求的特异性序列还包括符合下列特征的多肽特异性序列：

（a）：SEQ ID NO: 1的核酸序列的全部或部分翻译的多肽序列；或

（b）：与（a）有≥70%同源的核酸序列的全部或部分翻译的多肽序列。

所述检测方法是以本发明提供的核酸特异性序列或多肽特异性序列为检测目标，采用核酸扩增方法、核酸探针方法、抗原抗体识别的免疫反应或核酸适配体对抗原识别的方法。

进一步的，上述检测方法从上述核酸特异性序列中设计1对或1对以上的成对引物。

所述的检测方法的引物可以是确定碱基的核酸特异性序列或含简并碱基的核酸特异性序列，还可以是包含锁核酸的核酸特异性序列。为了对≥70%同源的核酸特异性序列进行检测时，最简单的方式是将存在单核苷酸多样性的突变位点视为相应的碱基的简并位点，从而可用包含多种突变碱基的简并碱基的序列作为引物序列；对于这种简并方式也可用次黄嘌呤或其他等效碱基代替。

所述引物的长度为9nt-45nt；优选的，长度为15nt-30nt；更优选的，长度为18nt-25nt。

进一步的，所述引物选自如SEQ ID NO: 5- SEQ ID NO: 24所示的任意2条或2条以上的正向（F）和反向（R）互补序列的核酸特异性序列，或者2条之间的SEQ ID NO: 1的核酸特异性序列或其反向互补的核酸特异性序列。

当包含1对引物时，可采用常规PCR检测、SYBR Green I染色的实时荧光定量PCR检测、数字PCR检测或依赖于解旋酶的等温扩增（HDA）检测。

当包含1对以上引物时，可采用套式PCR或多重PCR检测，套式PCR采用2对嵌套的引物，其中外侧的1对引物作为套式PCR的外引物用于第一步扩增，内侧的1对引物作为套式PCR的内引物用于第二步扩增；多重PCR采用2对或更多对相互独立的引物，对多个位点或不同基因型的甲壳动物戊肝病毒或其变异体进行检测。

还可以按照环介导的等温扩增（LAMP）引物的设计要求，以上述1对引物作为F3和B3引物，在其内侧，选择4条序列，通过组装设计成FIP和BIP引物，用于LAMP检测；还可在单链环区在设计1对引物，作为增强扩增的LF和LB引物，用于更快速的LAMP检测。

在引物设计中，还可以在引物的5’端接上3nt-50nt的人工序列、锚定序列或其他设计序列，按锚定引物多重扩增检测或基因芯片检测原理进行其他的扩增检测反应。

所述检测方法还可包括核酸探针。所述核酸探针的序列选自如SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 24所示的的正向和反向互补的核酸特异性序列，或者2条之间的SEQ ID NO: 1的核酸特异性序列或其反向互补的核酸特异性序列。

核酸探针可以用地高辛（DIG）、荧光素或者放射性同位素等进行所有核苷酸或特定核苷酸，如DIG-dUTP，的掺入法标记；也可以用DIG、荧光素、报告基团、荧光淬灭基团或放射性同位素等进行末端修饰标记，例如探针的5’端标记FAM、HEX、VIC等，3’端标记淬灭基团TAMRA等；进行直接对甲壳动物戊肝病毒或其他变异的同源病毒的基因组核酸进行独立的原位杂交或斑点杂交检测，也可与实时定量PCR技术联合，进行TaqMan探针或Beacon探针的荧光定量PCR检测。

所述的检测方法包括但不限于常规聚合酶链式反应（PCR）、恒温对流PCR、套氏PCR、实时荧光PCR、恒温对流实时荧光PCR、数字PCR、斑点杂交、原位杂交、环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增技术（RCA）、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增技术（HDA）、交叉引物扩增技术、核酸快递等温检测放大技术；也可包括但不限于同时对1株或1种以上甲壳动物戊肝病毒与其同源种或变异种的多重PCR、多重实时荧光PCR、基因芯片、芯片检测；还可以包括但不限于同时对包含甲壳动物戊肝病毒及其同源种或变异种的多重PCR、多重实时荧光PCR、基因芯片、芯片检测。

所述检测方法还包括采用免疫反应进行检测的方法。

进一步的，上述检测方法以多肽特异性序列为检测物或检测靶标符合下列特征：

（a）：如SEQ ID NO: 1所示的核酸序列，或其≥70%同源的核酸序列翻译的多肽或蛋白质的全部或部分为抗原；或

（b）：（a）的抗体或核酸适配体。

所述抗原可以是病毒株整体、裂解成分、衣壳、多肽、基因工程蛋白或多肽。所述抗体可以为多克隆抗体、杂交瘤细胞、单克隆抗体或单链抗体。所述核酸适配体可以为使用一个或多个多肽特异性序列经SELEX技术筛选所得的一条或多条核酸序列的单链RNA、单链DNA或单链锁核酸序列，可以通过核酸扩增、核酸克隆或人工合成制备特异性核酸适配体。所述抗原、抗体或核酸适配体可以按照现有技术的方法进行制备。

所述检测方法，可采用竞争性、间接或夹心型免疫反应也可采用固体支持物或免疫沉淀法。所述甲壳动物戊肝病毒的抗体或抗原性片段可采用现有技术进行标记，如荧光标记、化学发光标记、放射性标记或酶标记。扩增探针信号可以采用生物素和亲和素的方法，酶标记和介导的免疫试验，如ELISA检验。

本发明的保护范围也包上述甲壳动物戊肝病毒的抗血清、多克隆抗体、杂交瘤细胞、单克隆抗体、单链抗体或表达单链抗体的菌株或细胞株、核酸适配体或克隆表达生产核酸适配体的菌株。所述抗血清、多克隆抗体、杂交瘤细胞、单克隆抗体、单链抗体或核酸适配体以含有多肽特异性序列的甲壳动物戊肝病毒的病毒株，病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程蛋白或多肽为免疫原按照现有技术的方法进行制备。

如，所述抗甲壳动物戊肝病毒的抗体为单克隆抗体，可将浓缩的含多肽特异性序列的甲壳动物戊肝病毒株或其特定抗原片段，如，ORF1、ORF2、ORF3的抗原蛋白施予动物，如，小鼠，视需要可添加适当的佐剂，如：弗氏完全佐剂以进行初次免疫。经适当时间间隔后，视需要以灭活的病毒(或抗原蛋白)及适当的佐剂施与二次免疫。经适当时间间隔后，采集免疫动物的血清，用以评估适合用以采集脾脏细胞的小鼠。从所述适用的小鼠采集脾脏细胞与骨髓瘤细胞，如：FO细胞株、NS细胞株以PEG进行细胞融合。从融合细胞中筛选出具分泌能力的杂交瘤细胞株后，得到融合细胞系，该融合细胞系可分泌抗甲壳动物戊肝病毒的单克隆抗体。

上述检测方法，按照其方法的需要，可以对相应的方法的操作和实验室管理进行能力认证，开展对包括甲壳动物戊肝病毒及其同源种或变异种的商业化检测服务，或对商业化种苗培育、进出境检疫、产地检疫等开展对包括甲壳动物戊肝病毒及其同源种或变异种的检测；也可以将相应的试剂和工具进行组装，装配成试剂盒的形式进行对包括甲壳动物戊肝病毒及其同源种或变异种检测的试剂盒的商业化销售或应用服务；也可以在上述检测方法的基础上研发配套设备，或将已有的配套设备的检测范围扩大覆盖甲壳动物戊肝病毒及其同源种或变异种，进行对包括甲壳动物戊肝病毒及其同源种或变异种在内的检测设备的商业化销售或应用服务。

本发明具有以下优点：

本发明的甲壳动物戊肝病毒是一种新的戊肝病毒，可感染罗氏沼虾。本发明提供了基于甲壳动物戊肝病毒基因组序列的特征所建立的核酸扩增、核酸杂交、抗原结合、核酸适配体识别等特异性检测方法及其基于该方法所产生的试剂盒、检测设备和检测分析的应用，为甲壳类水产戊肝病毒的检测与防控提供新的可能。

生物保藏信息

甲壳动物戊肝病毒（crustacea hepevirus），保藏编号为CCTCC No. V201869，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址：中国武汉 武汉大学保藏中心，保藏日期：2019年1月24日。

附图说明

图1为甲壳动物戊肝病毒的电镜图片；

图2为甲壳动物戊肝病毒的系统发育进化树；

图3为罗氏沼虾感染戊肝病毒后的肝胰腺电镜图片；

图4为检测甲壳动物戊肝病毒的2%琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 甲壳动物戊肝病毒的分离、纯化和鉴定

1.1 分离和纯化

（1）取2-3 g罗氏沼虾头胸甲加入到离心管中，预冷的TNEP 缓冲液和200 μL PMSF异丙醇溶液，冰浴下用匀浆器10,000 rpm匀浆10 s；

（2）匀浆液于高速离心机4℃下10,000 g离心30 min，保留上清；

（3）依次使用0.45 μm和0.22 μm孔径的滤器过滤掉组织碎片、细菌和其他杂质；将上清于超速离心机4℃下100,000 g离心180 min，用TN缓冲液浸泡并缓慢摇动，使沉淀悬浮，吸取10 μL用于电镜观察；

（4）根据TEM扫描结果，于超速离心管中自上而下铺设蔗糖浓度（W/V）为20%、31.5%、43%、54.5%、66%浓度梯度，待4℃过夜放置后，加入上清进行4℃ 120,000 g离心240 min，脱糖后，获得病毒，暂时命名为甲壳动物戊肝病毒(crustacea hepevirus)；

（5）病毒序列的全基因组扩增：在通过高通量测序获得部分新型戊肝病毒序列的基础上，在此基础上设计引物对全基因组进行长片段的扩增和验证，然后采用SMARTER RACEcDNA Amplification Kit扩增S片段的3’末端和5’末端的以获得全基因组序列，如SEQ IDNO: 1所示。

表1 甲壳动物戊肝病毒基因组测序引物

1.2 种属鉴定

甲壳动物戊肝病毒电镜图片如图1所示，该病毒呈球形，直径27-34 nm。根据戊肝病毒目各个科（属）病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）的氨基酸序列，利用Muscle软件进行比对，利用Mega软件构建最大相似度进化树（图2），分别基于RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋白构建的系统发育进化树显示该病毒与戊肝病毒科的已知2个属亲缘关系都较远，属于戊肝病毒科的新属下的新种。对其进行了保藏，保藏编号为CCTCC No. V201869。

实施例2 甲壳动物戊肝病毒对罗氏沼虾的侵染

取发病罗氏沼虾样品制备匀浆液，经无菌过滤和超速离心后，通过投喂感染和浸浴感染对其进行人工感染实验，感染沼虾主要症状表现为生长迟缓。感染甲壳动物戊肝病毒的罗氏沼虾的肝胰腺电镜图片如图3所示。由图片可知，罗氏沼虾的肝胰腺中均可见甲壳动物戊肝病毒的病毒粒子。

实施例3 检测甲壳动物戊肝病毒的PCR试剂盒

检测甲壳动物戊肝病毒的PCR试剂盒包括以下成分：

表2 检测甲壳动物戊肝病毒的引物序列及扩增片段：

参照以下方法检测：

取发病罗氏沼虾肝胰腺样品20 mg于1.5 mL无RNA酶EP管中，研磨后加入0.75 mLTRIzol^TM试剂，充分震荡混匀，室温放置5 min；于4℃ 12 000 rpm离心5 min，取上清到一只新的无RNA酶的微量离心管中；加入1/5体积的氯仿，振摇以剧烈混合15 sec，室温放置5min；于4℃下，12 000 rpm离心15 min。仔细吸取上层水相，移至一只新的无RNA酶的微量离心管中；加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，置室温10 min；于4℃下，12000 rpm离心10 min，倒去上清。加入1 mL无RNA酶的75%乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，再于4℃下，7000 rpm离心5 min，小心倒去上清；室温晾干沉淀。加入20 µL无RNA酶的水溶解RNA沉淀，立即用于RT-PCR或保存于-80℃待用。临用前，调整RNA模板浓度为500 ng/µL。反转录为cDNA，然后利用如表2所示的引物进行套式PCR扩增。具体的反应体系与条件如下：

配制除Taq DNA聚合酶以外的大体积预混物，分装保存于-20℃。检测前，吸取无酶预混液，按比例加入相应体积Taq DNA聚合酶，混匀后分装24 μL/管。第一轮扩增程序：94℃变性2min；94℃ 20 s、53℃ 30 s、72℃ 60 s，30个循环；72℃延伸7 min。第二轮扩增程序为：94℃变性2 min；94℃ 20 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸7 min。

表3 第一轮PCR扩增体系

表4 第二轮PCR扩增体系

将PCR产物以2%琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图4所示。图4（上）中可以观察到735 nt的初次扩增条带。图4（下）中可以观察到400 nt的初次、二次扩增条带。图4（下）中，泳道4-9为感染该病毒的病虾的扩增条带。

实施例4 针对甲壳动物戊肝病毒的特异性序列进行LAMP检测

首先合成序列如SEQ ID NO: 25-30所示的引物，然后根据以下步骤进行甲壳动物戊肝病毒的特异性检测。

甲壳动物戊肝病毒的LAMP引物

（1）模板RNA的制备：取罗氏沼虾肝胰腺样品20 mg于1.5 mL无RNA酶EP管中，研磨后加入0.75 mL TRIzol^TM试剂，充分震荡混匀，室温放置5 min；于4℃ 12 000 rpm离心5 min，取上清到一只新的无RNA酶的微量离心管中；加入1/5体积的氯仿，振摇以剧烈混合15 sec，室温放置5 min；于4℃下，12 000 rpm离心15 min。仔细吸取上层水相，移至一只新的无RNA酶的微量离心管中；加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，置室温10 min；于4℃下，12 000 rpm离心10 min，倒去上清。加入1 mL无RNA酶的75%乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，再于4℃下，7000 rpm离心5 min，小心倒去上清；室温晾干沉淀。加入20 µL无RNA酶的水溶解RNA沉淀，立即用于RT-PCR或保存于–80℃待用。临用前，调整RNA模板浓度为500 ng/µL。

（2）配制反应体系：引物HE-F3和引物HE-E3各0.2 µM，引物HE-FIP和引物HE-BIP各0.8 µM，引物HE-LF和引物HE-LB各1.6 µM，dNTP每种1.4 mM，MgCl₂ 6 mM，甜菜碱1.2M，Tris-HCl 20 mM，KCl 10 mM，MgSO₄ 2 mM，(NH₄)₂SO₄ 10 mM，曲拉通X-100 0.1%，Bst DNA聚合酶8U，加入无菌双蒸水使各管的终体积为25 µL。上述反应体系配制完成后，混匀后分装到无菌的EP管中（规格为200 µL）。

（3）按照如下的反应程序进行基因扩增反应：63℃保温40 min，再80℃保温5 min。

（4）判断检测结果：反应结束后，在反应体系中加入核酸染料GeneFinder^TM 0.5 µL，然后在阳光下观察被测样品反应产物的颜色，如果是绿色荧光则表示该样品的甲壳动物戊肝病毒检测结果为阳性，如果为浅橙色则表示该样品的甲壳动物戊肝病毒检测结果为阴性。

利用上述方法，对不同来源的带有甲壳动物戊肝病毒的罗氏沼虾样品和带有白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的凡纳对虾样品进行了检测，另设无菌水作为阴性对照，检测结果表明模板为带有甲壳动物戊肝病毒的罗氏沼虾样品管显示为绿色荧光，而其他来源的模板和无菌水管均显示均为浅橙色。

实施例5 检测甲壳动物戊肝病毒抗原的ELISA检测试剂盒

该试剂盒组成：10:1兔抗甲壳动物戊肝病毒多克隆抗体包被的96孔板1块、牛血清白蛋白封闭液10 mL、160:1小鼠抗甲壳动物戊肝病毒单克隆抗体0.5 mL、160:1辣根过氧化物酶羊抗鼠IgM二次抗体酶结合物0.5 mL、TMB显色液、2M 硫酸、组织裂解液5 mL、洗涤液（PBST,NaCl 0.8 g, KH₂PO₄ 0.02 g, Na₂HPO₄·12H₂O 0.29 g, KCl 0.02 g, Tween20 0.05 mL,叠氮钠0.01 g, 加双蒸水至100 mL, pH 7.4）100 mL、PBS样品稀释液5 mL、阳性对照1支和阴性对照1支。按照下面的步骤进行检测。

（1）包被与封闭：将样品用样品稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100 µL，置37℃，4 h；弃去孔中液体（为避免蒸发，板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中）；5%小牛血清置37℃封闭40 min。封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3 min。洗涤方法：吸干孔内反应液，将洗涤液注满板孔，放置2 min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干。

（2）加入待检测样品(建立合适的浓度梯度)：检测时一般采用1:50-1:400的稀释度，保证样品吸取量>20 µL。将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔，每孔100 µL，置于37℃，孵育60 min。用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

（3）加入酶标抗体：根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行。37℃，孵育60 min。每孔加100 µL。洗涤同前。

（4）加入底物液(现用现配)：每孔加入TMB-过氧化氢尿素溶液100 µL，置37℃避光放置3-5分钟。

（5）终止反应：每孔加入终止液50 µL终止反应，于20min内测定实验结果。

（6）结果判断：检测450 nm波长下各孔吸光度值，以空白孔系统调零，用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 基于甲壳动物戊肝病毒基因组序列的检测方法及其应用

<130> 20190129

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7760

<212> RNA

<213> crustacea hepevirus

<400> 1

gggggggggg aaaacuccaa uaauuaacua uuaacuauua aacauuaacu auuaacuauu 60

aacuauugaa caaauuaacu gauaacgaug gauauuaauc cacaucaagu uaacaacguu 120

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aacuccauca aaaacucugu cguuuucaag aaaggcaaca aagaagaaau ggucuauaau 1200

ggcaucgacc ccaccacggc ggaauaugau caacucguaa uuucguuaua caucauaugc 1260

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aaccaaguga ucagcggcau uuucaacuuc uccaucaccu caaccaucaa aaaucauuac 1380

aucaagauca agcauuugcu caagaaagag cuuacaaccg uguuccccgu caccuuugga 1440

acacgcugca acaaaugccu uggcaaaggc aaaauauuca gcaaaacaag caugaacaau 1500

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uucaugccga aagauuuugu uuacgaacuu aaaauagaag cacccaccga uaaagaauac 1620

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gagcaaguaa gacaucuuua caccgcggua acaagaacga gcaauaaauu gguaacguac 4140

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uuauccucag ugagcaacga cggaccagac aacaucucga uguucuuaga cggcgugugg 5460

aaacagcauu cgggacaacc uuucaccuug gacgguaaca ccauguuuaa caugauggcc 5520

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aucuacacaa cacaaacuga uugggaagaa caaaaacuca gcaucaccga uucucucgac 5820

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uacuucggua ucaaaaucac ccccgaugaa guacgaaccu uacugaugua ccuuuaccau 5940

cucaaggaaa aacccgaucu agaggacauc aaaguugaaa auuuugaauu ccgugcaauc 6000

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<211> 501

<212> PRT

<213> crustacea hepevirus

<400> 3

Met Ser Asn Leu Leu Lys Leu Lys Thr Ala Gln Val Asn Thr Pro Thr

1 5 10 15

Leu Gly Thr Ile Thr His Lys Gly Glu Thr Ile Glu Val Asn Cys Glu

20 25 30

Thr Ala Ala Gly Arg Ala Trp Leu Ala Lys Tyr Leu His Pro Pro Ser

35 40 45

Asp Pro Met Pro Gly Phe Cys Gly Tyr Pro Asp Arg Asn Thr Leu Ser

50 55 60

Thr Val Gln Leu His Tyr Arg Gly Glu Lys Glu Ile Ala Leu Gly Cys

65 70 75 80

His Lys Gly Asp Gly Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ala Lys Tyr Cys

85 90 95

His Leu Phe His Trp Gly Ala Arg Ala Pro Cys Val Gly Val Trp Tyr

100 105 110

Asp Ala Thr Gly Gly Lys Pro Ala Phe Asp Pro Thr Glu Thr Gln Trp

115 120 125

Met Ile Asn Lys Gln Phe Asp Trp Lys Ala Trp Asp Arg Asp Ile Glu

130 135 140

Lys Ala Arg Arg Thr Tyr Gly Ser Val Ser Ile Tyr Gln Asp Glu Thr

145 150 155 160

Ala Phe Ser Asn Arg Gly Val Ile Thr Val Ala Asn Phe Arg Pro Asp

165 170 175

Trp Val Asp Val Glu Leu Gly Pro Val Phe Thr Val Arg Asp Ile Ala

180 185 190

Asn Ala Leu Lys Ala Asp His Arg Thr Leu Lys Val Pro Pro Ser Met

195 200 205

Leu Arg Ser Asn Thr Ile Asp Arg Asp Gly Tyr Glu Val Leu Glu Pro

210 215 220

Lys Lys Thr Asp Val Asn Leu Thr Pro Pro Tyr Lys Trp Arg Ile Met

225 230 235 240

Met Ile His Ser Trp Pro Arg Asp Glu Ser Asp Leu Ile Asn Leu Ser

245 250 255

Arg Lys Ala Tyr Ser Gly Met Leu Arg Glu Gly Ala Phe Ile Thr Ser

260 265 270

Arg Ile Ala Gln Asp Val Asn Ser Phe Lys Gln Gly Asp Thr Phe Asp

275 280 285

Ala Ile Ala Leu Tyr Val Arg Asp Glu Asn Thr Val His Asn Phe Pro

290 295 300

Leu Tyr Thr Asp Ile Asn Asn Phe Gly Glu Trp Met Asp Cys Asp Phe

305 310 315 320

Ala Phe Thr Trp Val Met Tyr Ser Gln Met Ala Thr Ser Gln Asp Gln

325 330 335

Ser Thr Gln Pro Phe Thr Ala Asn His Ile Leu Tyr Lys Trp Tyr Asn

340 345 350

Gly Phe Glu Val Ser Val Gly Leu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Phe Gln

355 360 365

Ala Ala Cys Ala Met Glu Asp Glu Thr Ala Leu Arg Leu Ala Asn Asn

370 375 380

Val Leu His Glu Ala Asn Asp Ala Asp Thr Val Ala Asn Asn Ser Trp

385 390 395 400

Ala Thr Leu Ala Arg Thr Ala Leu Ser Leu Ala Pro Gln Ala Phe Glu

405 410 415

Trp Leu Ser Asn Val Phe Gly Ser Lys Lys Asn Lys Gln Lys Arg Asp

420 425 430

Asp Lys Lys Glu Ile Lys Lys Glu Val Lys Lys Glu Val Lys Gln Met

435 440 445

Val Lys Pro Glu Asn Lys Gln Leu Ala Lys Pro Ala Pro Gln Pro Arg

450 455 460

Arg Arg Arg Ser Arg Ser Lys Ser Ala Ser Arg Lys Gly Pro Val Asn

465 470 475 480

Thr Pro Arg Ser Lys Ser Met Gly Pro Lys Val Pro Leu Gly Glu Tyr

485 490 495

Leu Gly Asn Asn Lys

500

<210> 4

<211> 81

<212> PRT

<213> crustacea hepevirus

<400> 4

Met Thr Gln Cys Gln Asp Phe Ala Ala Thr Leu Ile Gly Thr Pro Ser

1 5 10 15

Ala Pro Ser Asn Tyr Ile Ile Ala Ala Arg Lys Lys Ser His Leu Val

20 25 30

Ala Thr Lys Val Thr Ala Gln His His Ser Val Gln Gln Gln Ser Ile

35 40 45

Val Thr Phe Ser Thr Gly Ala His Val His Pro Val Trp Ala Tyr Gly

50 55 60

Thr Thr Gln Gln Ala Ala Asn Gln Pro Leu Thr Leu Pro Lys Pro Asn

65 70 75 80

Gly

Claims (10)

1.一种甲壳动物戊肝病毒（crustacea hepevirus），其保藏编号为CCTCC No.V201869，其基因组序列如SEQ ID NO: 1所示。

2. 一种甲壳戊肝病毒，其特征在于，能够感染甲壳纲动物，其甲基转移酶、解旋酶或RNA依赖的RNA聚合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2中相应氨基酸序列的遗传距离小于0.6。

3. 一种检测如权利要求1或2所述的病毒的检测方法，其特征在于，该检测方法的特异性序列为

（a）：SEQ ID NO: 1的RNA序列；或

（b）：（a）转换的DNA序列；或

（c）：（a）和（b）的≥70%同源的RNA或DNA序列；或

（d）：包含（a）、（b）或（c）的简并碱基的RNA或DNA序列；或

（e）：用次黄嘌呤或其他等效碱基代替的（d）的简并碱基的RNA或DNA序列；或

（f）：与（a）或（b）或（c）或（d）或（e）互补的RNA和DNA序列的部分或全部。

4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，特异性序列长度为12 nt-3000 nt。

5. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，该方法至少包括1对从特异性序列中选择12 nt-30 nt的单链DNA或RNA片段为特异性引物；

优选的，所述的特异性引物选择自SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 24所示的序列以及SEQID NO: 5-SEQ ID NO: 24中任意2条序列之间的特异性序列中的片段。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还可以包括1条从特异性序列中选择的15nt以上的多聚核苷酸序列片段为特异性探针。

7. 根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述的引物和探针采用聚合酶链式反应或环介导恒温扩增或依赖解旋酶的等温扩增或其他核酸扩增或核酸杂交检测技术。

8. 一种检测如权利要求1或2所述的病毒的检测方法，其特征在于，检测物为

（a）：SEQ ID NO: 1的核酸序列的全部或部分翻译的多肽；或

（b）：与（a）有≥70%同源的核酸序列的全部或部分翻译的多肽；或

（c）：（a）或（b）的抗体；或

（d）：（a）或（b）的核酸适配体。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，采用多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体或核酸适配体建立的酶联免疫吸附分析、荧光免疫分析、免疫层析试纸条或核酸适配体序列的特异性扩增或其他免疫学或拟免疫学检测。

10.一种采用如权利要求3-9任一所述的检测方法检测甲壳戊肝病毒属病毒的试剂盒，其特征在于，将检测方法所需的各试剂配置成配套的试剂盒或配套设备。