CN109701166B - 一种光遗传刺激促进皮质脊髓束再生修复脊髓损伤的装置 - Google Patents

Abstract

一种光遗传学刺激大范围大脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的方法。利用LED灯作为光刺激的光源以扩大光照面积，从而活化大片脑区皮质，应用波形发生器精确控制LED灯的光强，频率以及波宽以达到需要的光刺激参数，在不损伤脑组织的情况下进行大范围的针对神经元的特异的光遗传学刺激，避免了对胶质细胞的影响，从而特异地增强大片脑区的神经元电活动，促进其轴突再生从而达到改善脊髓损伤后神经元功能的目的，是一种大范围特异地激活皮层第五层锥体神经元促进脊髓损伤后大量皮质脊髓束再生的方法。

Description

一种光遗传刺激促进皮质脊髓束再生修复脊髓损伤的装置

所属技术领域

本发明专利涉及一种光遗传刺激活化大范围皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的装置。基于光遗传技术的原理，采用发光二极管(light emitting diode，LED)来源的蓝光光源刺激大范围皮层中带有光敏离子通道蛋白(channelrhodopsin 2，ChR2)的神经元，使其产生动作电位，增强神经元电活动，从而促进其轴突的再生。这避免插入光纤对脑组织的损伤和光照范围过小的问题，采用LED灯在磨薄的颅骨表面代替插入光纤给光，采用波形发生器精确控制LED灯的频率和波宽，以激发大脑皮层第五层发出皮质脊髓束(corticospinal tract，CST)的内锥体神经元产生动作电位，增强其电活动，从而促进CST的再生以修复脊髓损伤，是一种应用工程技术和转基因技术大范围活化大脑皮层促进CST再生从而治疗脊髓损伤的装置。

背景技术

脊髓损伤是一种致残率、死亡率都非常高的神经系统疾病。据统计，世界范围内脊髓损伤每年发病率为23/百万，亚洲国家尤其中国和韩国发病率较高，为12.06-61.6/百万。目前我国累计约有200万脊髓损伤导致的截瘫患者，并且每年以约5万人的速度增加，而且呈现出高发病率、高致残率、低龄化的趋势，给家庭和社会带来了巨大的经济压力。仅在中国，因脊髓损伤导致的政府直接经济支出高达数十亿，因此脊髓损伤的研究与治疗成为世界各国研究的热点。脊髓损伤分为完全损伤和不完全损伤，对于完全性损伤，大脑和肢体之间的联接完全被破坏掉，因此大脑的信号无法到达损伤平面以下，结果就导致病人损伤平面以下的肢体瘫痪，失去自主运动的能力。自主运动不仅仅是可以减轻病人本身的痛苦，还可以避免对病人进行日常护理，从而减少整个社会的经济负担和人力负担，因此自主运动功能的恢复非常重要，而目前临床上治疗脊髓损伤对促进自主运动功能恢复还没有有效的方法。

CST被认为是恢复自主运动功能的关键要素[1，2]，它由大脑皮层的第五层大锥体神经元发出下行纤维组成，直接或间接地陆续终止于脊髓前角运动神经元，控制四肢和躯体的自主运动。因此，CST的再生可能重建自主运动能力。然而，在没有任何干预的情况下，CST的再生非常有限[3，4]。对于严重的脊髓损伤，例如有大量组织缺损的完全性脊髓损伤，CST再生仍然是一个极大的挑战。

最近研究表明，电刺激和磁刺激可以增强锥体神经元电活动，会促进CST再生。Camel等用电刺激大鼠大脑皮层，结果他们发现电刺激能增加轴突的出芽和再生[5]。Benito等用经颅高频重复磁刺激脊髓损伤的病人头部，发现磁刺激能促进运动评分的提高[6]。另一项研究表明电刺激的机制中，包括激活mTOR信号通路和Jak/Stat信号通路[7]，从而增强CST的轴突生长。但是，电或者磁刺激能活化大片脑区，同时影响胶质细胞的行为，并非只对神经元有特异性，所以，电或磁刺激促进CST再生的真正机制还有待进一步阐明。与电刺激相比，光遗传学刺激对于靶标神经元更具有特异性与选择性。

光遗传技术是一种联合遗传学和光来精确控制激活或抑制细胞的技术[8]。首先神经元被基因改造成能表达光敏离子通道蛋白，包括channelrhodopsin、halorhodopsin和archaerhodopsin[9]。这些离子通道蛋白在特殊波长的光照下会选择性地让某些离子通过，从而改变细胞膜电位状态，使其发生动作电位，或者抑制神经元活性，从而达到通过光实现调控神经元电活动[10]。因此，这个技术可以实现通过光精确的时空实现调控神经元的激活或抑制。近年有研究表明，光遗传技术刺激大脑运动皮质也能促进皮质脊髓束向中脑红核侧枝出芽，从而提高脊髓损伤后动物的运动功能[11]。因此，光遗传技术可以增强损伤后的神经可塑性。但是目前流行的光遗传刺激方法大多使用光纤插入的方式，这种方式有两个缺陷，一是必须插入组织内部，对脑组织本身有损伤作用；二是光照范围小，仅实用于核团等需要小范围光照部位，不适用于皮层等需要大范围光照的部位。

例如，在一项利用光遗传学特异性激活神经元治疗大鼠中风模型的研究中[12]，研究人员需要大范围刺激皮层，他们通过在大鼠大脑皮层插入多根光纤来达到扩大光激活范围的目的，然而这种插入光纤的方式对皮层脑组织有损伤，多根光纤对脑组织的损伤范围更大。我们构建的LED灯来源的光遗传装置代替光纤扩大光照范围，避免了对脑组织的损伤。又因为皮层所处位置非常表浅，因此，表面给光也能达到刺激的目的，另外为了实现精确控制，我们采用波形发生器连接LED灯，可以实现精确控制给光的频率和波宽。

首先将发蓝光的LED灯(图1A)，在灯背面的接点两端焊接上电线，再用热熔胶枪将焊点和裸露的电线包裹绝缘(图1B)。通过连接波形发生器(图1C)和LED灯，控制灯的电压，频率以及波宽。LED灯发出蓝光，其波长范围在460nm-480nm(图1D)。

进一步验证装置是否有效，一是在体外实验中，采用电生理技术检测该装置能否引发脑片神经元动作电位；二是在小鼠头部安装该装置，刺激后能否引起大脑皮层第五层锥体神经元表达C-fos。利用转基因小鼠(Thy1-ChR2-YFP)，其在神经元特异地表达ChR2，将其大脑切成脑片，用膜片钳记录绿色荧光的大脑皮层第五层锥体神经元在LED蓝光刺激下能否引发动作电位(图2A)，结果显示，该装置能够实现蓝光刺激神经元产生动作电位，具有很好的守时性(图2B，2C)。接下来在体内实验中我们将该转基因小鼠的颅骨用牙科钻头磨薄，将LED灯贴在表面，用义齿基托树脂固定住，光刺激后90min采用免疫荧光技术检测大脑皮层第五层锥体神经元及早基因C-fos的表达情况。结果表明LED蓝光刺激后神经元有C-fos的表达(图3A，3B)，说明在体内被蓝光刺激后带ChR2基因的神经元可以被激活。

接下来我们使用这种方法刺激小鼠皮层，检测这种方法是否能促进CST的再生。将转基因小鼠和野生型小鼠做脊髓全横断损伤模型，3周以后将这种LED光遗传刺激装置用相同的方法贴在小鼠颅骨表面，每天给予光刺激，每次刺激40min，每天一次，两周后注射生物素化葡聚糖胺(biotin dextran amine，BDA)标记CST，一周后灌注动物取材切片，观察脊髓中CST的再生情况，结果显示与对照组(野生型组)相比这种光遗传刺激能够促进CST再生，CST的断端能进入损伤区(图4A，图4B)。

CST的再生一直是脊髓损伤领域的一大难点，目前研究认为缺乏内在生长能力可能是CST再生失败的主要原因，有研究认为，增强锥体神经元电活动，可能会促进它的CST再生。例如用电刺激和磁刺激，有研究表明电刺激的机制中，包括激活mTOR信号通路和Jak/Stat信号通路，从而增强CST的轴突生长，而光遗传技术比电或者磁刺激对于靶标神经元更具有特异性与选择性，因此利用光遗传技术能更特异地刺激大脑皮层第五层锥体神经元，达到特异地促进CST再生的目的。然而目前的光遗传刺激大多采用插入光纤的方式还有很多缺陷，为了解决插入光纤对脑组织的损伤和光照范围过小的问题，本发明专利旨在构建一种利用光遗传刺激来刺激广泛的大脑皮层从而特异性促进CST再生的装置来治疗脊髓损伤，为脊髓损伤的治疗提供新的策略。

发明内容

为了克服现有光遗传刺激插入光纤对脑组织的损伤和光照范围过小的问题，本发明专利构建了一种利用大范围光遗传学刺激装置刺激大脑皮层，以促进皮质脊髓束再生治疗脊髓损伤的新方法，其能够在对脑组织无创的情况下避免刺激到胶质细胞，广泛而特异性地刺激大脑皮层锥体神经元，提高其电活动，而促进CST再生，从而为治疗脊髓损伤提供新方法。

本发明专利的基本方案包括：采用蓝光LED灯作为发光光源，用波形发生器精确控制其电压，频率和波宽，将其贴在磨薄的颅骨上，通过光照刺激大片区域大脑皮层中带有光敏离子通道蛋白ChR2的神经元产生动作电位，增加其电活动，通过对其进行光遗传刺激而实现促进其轴突CST的再生的效果，从而治疗脊髓损伤。

本发明专利的有益效果：此方法通过构建的LED光遗传装置可以在对脑组织无损伤的情况下更大范围地活化大片脑区的神经元，增强它们的电活动，促进脊髓损伤后皮质脊髓束的再生，从而为治疗脊髓损伤提供新的方法。

附图说明

图1LED光遗传装置的构建。(图A示LED贴片灯；图B示背后焊接电线的LED灯外观；图C示波形发生器外观；D示LED灯发出蓝光)。

图2电生理检测LED光遗传装置激活脑片中的神经元产生动作电位。(图A示LED光遗传装置正在体外进行光刺激脑片，同时电生理仪正在检测脑片中神经元的动作电位；图B示当LED光源的蓝光刺激脑片时，带有ChR2的大脑皮层神经元发出动作电位，频率为5HZ；图C示图B的放大图，示记录到的光刺激下的神经元发出的动作电位。)

图3免疫荧光技术检测LED光遗传装置激活体内大脑皮层锥体神经元。(图A示光刺激90min后大脑切片的C-fos和Map2双标的免疫荧光染色图片，bar＝100μm；B图示A图方框里的高倍图，箭头示在第五层表达ChR2和Map2的大锥体细胞表达C-fos，bar＝50μm。)

图4检测LED光遗传装置刺激两周后皮质脊髓束的再生情况。(图A，B分别示实验组和对照组的小鼠脊髓纵切片，bar＝1mm。A1，A2分别为A图的小鼠脊髓头端和损伤区的皮质脊髓束的标记情况。B1，B2分别为B图的小鼠脊髓头端和损伤区的皮质脊髓束的标记情况，bar＝50μm。)

图5(本发明专利的整体思想模式图)

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明专利所用的仪器和试剂作详尽的描述：

1.主要仪器和试剂

LED贴片灯(深圳北科商贸有限公司)，波形发生器(郑州明禾电子科技有限公司)，夹子导线(上海华谊医用仪器有限公司)，锡焊电烙铁(温州伊莱科电气有限公司)，透明热熔胶棒(义务联溪胶棒厂)，热熔胶枪(苏州宝时得科技有限公司)，希玛数字光照度计(上海宝新仪器仪表有限公司)，立体定位仪+小鼠固定夹适配器(RWD公司)，呼吸麻醉机(RWD公司)，义齿基托树脂(上海新世纪齿科材料有限公司)，自凝牙托水(香港德派实业有限公司)，体视显微镜(德国Leica公司)，牙科钻(韩国SAEYANG MICROTECH)，冰冻切片机(Thormo)，震荡切片机(美国World Precision Instruments公司)，荧光显微镜(德国Leica公司)，0.01M PBS(中杉金桥)，Hoechst33342(Sigma)，山羊血清(GIBCO)，一抗(C-fos，CALBIOCHM)，二抗(Alex-555，Abcam)。

2.实验动物信息

(1)转基因小、鼠：C57小、鼠，B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J，进口自美国JAX公司。

(2)野生型小鼠：C57小鼠，由中山大学实验动物中心提供。

本发明专利详细的具体操作技术说明如下：

1.LED光遗传装置的构建

先将导线中的铜线暴露出来，用锡焊电烙铁把铜线焊接在LED灯背面的焊接点上。再用热熔胶枪把焊点和裸露的电线喷上透明熔胶包裹焊点和电线以绝缘，等待冷却后使用。连接波形发生器和LED灯的导线，控制灯的电压，频率以及波宽。参数如下：波形CMOS波，电压4.5V，频率5HZ，占空比1.7％。程序：每工作1min，间隔3min。使用另一台波形发生器设置外部触发信号，参数为：波形CMOS波，电压5V，频率4.17m HZ，占空比50％。被控制的波形发生器的调制模式参数设为：功能：BST(CH1)，模式：外部触发(AC)，控制：ON。安照此设置后，可以实现LED蓝光的电压4.5V，频率5HZ，波宽3ms，工作1min，休息3min的实验条件。

2.小鼠颅骨磨骨后LED光遗传装置的安装

将小鼠用呼吸麻醉机麻醉后，把头部背侧皮毛剪干净；从中间剪开大约1.5cm的切口；用小鼠耳杆左右尖端卡住小鼠的耳蜗，两端的上下和左右的标尺保持一致，前端卡口扣住小鼠的牙齿和头部，固定完成后小鼠头部不能移动；小鼠头部以前囟bregma为零点，进行调整，保持和lambda在同一水平，即Z轴为0，前后平整；然后调Y轴为-2.5，X轴为1和-1，左右平整；在体视显微镜下，用牙科钻轻轻打磨前囟左右的区域，范围AP：1mm，LM(-1.5mm，1.5mm)，注意不要把颅骨磨穿，磨到颅骨变软，大脑的血管清晰可见(达到做双光子标准)为止，把构建好的LED光遗传装置用立体定位仪的持针夹固定住，然后用义齿基托树脂涂在装置周围，固定好整个装置，待义齿基托树脂变硬后再将持针夹撤去。

3.LED光遗传装置的刺激效果的检测

(1)电生理

用转基因小鼠麻醉后取材其大脑，用人工脑脊液浸泡着在震荡切片机上将其切成300μm厚度的脑片，复苏30min后，采用电生理仪用膜片钳技术记录大脑皮层锥体神经元在光刺激下动作电位的爆发情况。将LED光遗传装置安装在电生理仪旁边，将头部无限接近脑片，按照上述程序给光，同时记录，参数同步骤1。

(2)免疫荧光检测C-fos的表达情况

将安装好LED光遗传装置的小鼠用相同程序刺激30min，刺激的同时观察行为学变化。刺激90min后灌注取材小鼠大脑，后固定后浸泡在30％脱水，1周后冰冻切片机进行切片，再进行免疫组织化学荧光染色。先PBS清洗3次，每次10min，用10％的山羊血清在37℃封闭30min，加上一抗C-fos在4℃冰箱孵育过夜，第二天用PBS清洗3次，每次10min，再加上二抗Alex-555在37℃孵育1h，再用PBS清洗3次，每次10min，然后用90％甘油封片，荧光显微镜下拍照观察。

4.小鼠脊髓全横断模型的构建

购买JAX实验室转基因小鼠(B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J)和中山大学动物实验中心的野生型小鼠，术前小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(0.64mg/10g)进行麻醉。经固定体位、备皮消毒后，在无菌条件下切开皮肤、浅筋膜，用器械沿T8～T10两侧棘突顺腰棘肌群走向钝性分离肌肉和韧带，用自制拉钩固定手术区域，清晰暴露T9棘突和椎弓，有齿镊轻提T9棘突，用眼科持针钳沿T9～T10椎弓间隙轻轻咬开椎弓根部，并逐渐咬下T9椎弓，暴露T10段脊髓。用直尖小梁剪剪开硬脊膜后，将一侧刀脚插到底部，快速全横断整个脊髓，充分止血后，依肌层、皮下组织、皮肤顺序逐层缝合。术后做好标记，每只动物肌肉注射青霉素16万单位1mL/d，连续3天，在膀胱区用手适度按压进行人工排尿，每日1～2次。为防止未长好的伤口被咬开，术后单笼喂养。此后，依据膀胱功能恢复情况，可逐渐减少排尿次数，动物饲养一个月后取材检测，期间给以保温，自然光照时间，以及充分的饮食。

5.LED光遗传装置刺激脊髓全横断小鼠大脑皮层

上述小鼠脊髓横断3周以后，按照2的同样的方法将LED光遗传装置安装在脊髓全横断的小鼠头部。每天将波形发生器的夹子导线连接上小鼠头部的LED光遗传装置，一台仪器同时控制两只小鼠。刺激程序：1min*10个刺激，每个刺激间隔3min，总时长40min，每天一次，刺激两周。

6.活化大片脑区对脊髓损伤后小鼠皮质脊髓束再生的效果检测

LED光遗传刺激2周后，采用BDA顺行示踪皮质脊髓束，观测其再生效果。将其头部固定于立体定位仪上，去除LED光遗传装置，用小型牙科钻前囟后1mm，旁开矢状缝1mm处打开颅骨，形成两个直径约3mm的圆形骨窗，即显露出两侧小鼠脑皮质体感运动区，在体视镜下，用微量注射器吸入需要量的10％BDA溶液(分子量10,000)，进行BDA注射。每侧脑选择4个注射点，注射点选择在前囟后1mm、2mm，旁开矢状缝1mm和2mm处，并避开血管。每个注射点的剂量为0.5μl，在距大脑皮层表面深度为1mm和0.5mm时，分别注入0.25μl和0.25μl，每次注射后针头要滞留5min，然后再缓慢的退针。总的说来，每只动物要接受4个注射点(光刺激侧)，BDA总量为4μl。注射完后逐层缝合头皮，继续常规饲养1周。术后肌肉注射青霉素16万U/ml/天，连续3天。期间给以保温，自然光照时间，以及充分的饮食，常规人工排尿。7天后动物灌注取材，荧光镜下拍照，评估CST的再生情况。

实验结果显示：

1.构建的LED光遗传装置可以在体外激活脑片产生动作电位

采用电生理仪记录在LED光遗传装置的光刺激下，转基因小鼠大脑皮层第五层锥体神经元动作电位爆发的情况，结果显示每1秒给5个光刺激，同时也记录到相应的动作电位爆发，频率为5HZ(图2)，这说明我们构建的LED光遗传装置可以达到光遗传刺激的效果。

2.构建的LED光遗传装置可以在体内激活大脑皮层的第五层锥体神经元

将LED光遗传装置安装在转基因小鼠头部，用相同的参数刺激小鼠，90min后灌注取材，免疫荧光结果显示，大片脑区的第五层锥体神经元表达C-fos(图3)，这说明我们构建的LED光遗传装置在体内可以达到刺激到大脑皮层第五层锥体神经元的效果。

3.采用光遗传技术活化大片皮层神经元可以提高脊髓损伤后小鼠皮质脊髓束的再生能力

构建小鼠脊髓全横断模型，在3周以后将LED光遗传装置安装在小鼠头部，每天进行光遗传刺激，刺激时长1min，每个刺激间隔3min，总时长40min，每天一次，刺激两周。注射BDA标记CST，一周以后灌注观察。结果显示对比对照组，光刺激转基因小鼠组的CST能够更近地到达损伤区(图4)。这说明这种活化大范围脑皮层的方法可以促进脊髓损伤后的皮质脊髓束的再生。

参考文献：

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Claims (5)

1.一种用于光遗传刺激活化大范围脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的装置，其包括：发光二极管(light emitting diode，LED)作为光刺激的光源，即LED光源，与所述LED光源电连接的第一波形发生器和第二波形发生器；所述第一波形发生器控制所述LED光源的波形为CMOS波，电压为4.5V，频率为5Hz，占空比为1.7％；所述第二波形发生器控制外部触发信号，第二波形控制器的参数为：CMOS波，电压为5V，频率为4.17mHz，占空比为50％；

该装置：(1)只在大脑皮层表面进行光照刺激，不侵入脑组织；(2)采用蓝光发光二极管(light emitting diode，LED)作为光刺激的光源；(3)引起大脑皮层第五层锥体神经元特异性表达光敏离子通道蛋白(channelrhodopsin2，ChR2)；(4)单个LED灯光照范围大于0.5×0.5平方厘米；(5)蓝光特异性地活化第五层锥体神经元；(6)脊髓损伤后，蓝光活化第五层锥体神经元促进其轴突，即皮质脊髓束出芽或者再生；(7)所述蓝光活化促进皮质脊髓束出芽或者再生能促进脊髓损伤后神经功能修复。

2.根据权利要求1所述的用于光遗传刺激活化大范围脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的装置，还具有以下特征：(1)使用蓝光LED灯作为光刺激的光源，以扩大光照面积，从而活化大片脑区，包括运动皮层、感觉皮层、视皮层、听皮层在内的浅表脑区；(2)LED灯的光强、频率以及波宽能实现调控，以达到需要的光刺激参数。

3.根据权利要求1所述的用于光遗传刺激活化大范围脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的装置，还具有以下特征：皮层第五层锥体神经元特异性表达阳离子和阴离子的光敏离子通道蛋白，还包括：ChR1，NpHR以及基因改造的eNpHR3.0，Arch，ArchT，eBR，Mac以及基因改造的eArch3.0，eArchT3.0和eMac3.0，Jaws，NsXeR。

4.根据权利要求1所述的用于光遗传刺激活化大范围脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的装置，还具有以下特征：(1)在不损伤脑组织的情况下进行光刺激，增强神经元电活动，促进脊髓损伤后皮质脊髓束的出芽或再生；(2)进行大范围的光刺激，增强大片脑区的神经元电活动，促进脊髓损伤后大量皮质脊髓束的出芽或再生；(3)特异性针对神经元的光刺激，避免了对胶质细胞及其他细胞的影响，从而特异地增强神经元电活动。

5.根据权利要求1所述的用于光遗传刺激活化大范围脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的装置，还具有以下特征：此装置光源还包括黄光、橙光、红光在内的LED灯，配合相应的光敏离子通道蛋白，从而实现抑制和调节大片脑区的神经元活动，包括运动皮层、感觉皮层、视皮层、听皮层，从而减少神经元轴突出芽或者再生，从而达到调控神经元轴突或突触过度生长的目的。