CN109701166A - 一种光遗传学刺激活化大范围皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的方法 - Google Patents
一种光遗传学刺激活化大范围皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109701166A CN109701166A CN201910103715.2A CN201910103715A CN109701166A CN 109701166 A CN109701166 A CN 109701166A CN 201910103715 A CN201910103715 A CN 201910103715A CN 109701166 A CN109701166 A CN 109701166A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- light
- cortex
- spinal cord
- regeneration
- cord injury
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 230000008439 repair process Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 title description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 29
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 claims abstract 4
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 19
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 9
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 claims description 8
- 238000005424 photoluminescence Methods 0.000 claims description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 8
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 claims description 4
- 108010035848 Channelrhodopsins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 210000003926 auditory cortex Anatomy 0.000 claims 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 claims 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims 1
- 241000283953 Lagomorpha Species 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 101000903581 Natronomonas pharaonis Halorhodopsin Proteins 0.000 claims 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002594 corticospinal effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000857 visual cortex Anatomy 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 31
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 11
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 10
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 9
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 9
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 8
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 6
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229910000679 solder Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150009249 MAP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 239000003994 anesthetic gas Substances 0.000 description 2
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- -1 dextran amine Chemical class 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 238000012402 patch clamp technique Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005476 soldering Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001448725 Endorchis Species 0.000 description 1
- 239000004836 Glue Stick Substances 0.000 description 1
- 108010050754 Halorhodopsins Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 240000001307 Myosotis scorpioides Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000080 chela (arthropods) Anatomy 0.000 description 1
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003477 cochlea Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- IYRDVAUFQZOLSB-UHFFFAOYSA-N copper iron Chemical compound [Fe].[Cu] IYRDVAUFQZOLSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007996 neuronal plasticity Effects 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002804 pyramidal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003238 somatosensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Radiation-Therapy Devices (AREA)
Abstract
一种光遗传学刺激大范围大脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的方法。利用LED灯作为光刺激的光源以扩大光照面积，从而活化大片脑区皮质，应用波形发生器精确控制LED灯的光强，频率以及波宽以达到需要的光刺激参数，在不损伤脑组织的情况下进行大范围的针对神经元的特异的光遗传学刺激，避免了对胶质细胞的影响，从而特异地增强大片脑区的神经元电活动，促进其轴突再生从而达到改善脊髓损伤后神经元功能的目的，是一种大范围特异地激活皮层第五层锥体神经元促进脊髓损伤后大量皮质脊髓束再生的方法。
Description
所属技术领域
本发明专利涉及一种活化大范围皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的方法的构建。基于光遗传技术的原理，采用发光二极管(light emitting diode，LED)来源的蓝光光源刺激大范围皮层中带有光敏离子通道蛋白(channelrhodopsin 2，ChR2)的神经元，使其产生动作电位，增强神经元电活动，从而促进其轴突的再生。这避免插入光纤对脑组织的损伤和光照范围过小的问题，采用LED灯在磨薄的颅骨表面代替插入光纤给光，采用波形发生器精确控制LED灯的频率和波宽，以激发大脑皮层第五层发出皮质脊髓束(corticospinal tract，CST)的内锥体神经元产生动作电位，增强其电活动，从而促进CST的再生以修复脊髓损伤，是一种应用工程技术和转基因技术大范围活化大脑皮层促进CST再生从而治疗脊髓损伤的方法。
背景技术
脊髓损伤是一种致残率、死亡率都非常高的神经系统疾病。据统计，世界范围内脊髓损伤每年发病率为23/百万，亚洲国家尤其中国和韩国发病率较高，为12.06-61.6/百万。目前我国约有200万脊髓损伤导致的截瘫患者，并且每年以约5万人的速度增加，而且呈现出高发病率、高致残率、低龄化的趋势，给家庭和社会带来了巨大的经济压力。仅在中国，因脊髓损伤导致的政府直接经济支出高达数十亿，因此脊髓损伤的研究与治疗成为世界各国研究的热点。脊髓损伤分为完全损伤和不完全损伤，对于完全性损伤，大脑和肢体之间的联接完全被破坏掉，因此大脑的信号无法到达损伤平面以下，结果就导致病人损伤平面以下的肢体瘫痪，失去自主运动的能力。自主运动不仅仅是可以减轻病人本身的痛苦，还可以避免对病人进行日常护理，从而减少整个社会的经济负担和人力负担，因此自主运动功能的恢复非常重要，而目前临床上治疗脊髓损伤对促进自主运动功能恢复还没有有效的方法。
CST被认为是恢复自主运动功能的关键要素[1，2]，它由大脑皮层的第五层大锥体神经元发出下行纤维组成，直接或间接地陆续终止于脊髓前角运动神经元，控制四肢和躯体的自主运动。因此，CST的再生可能重建自主运动能力。然而，在没有任何干预的情况下，CST的再生非常有限[3，4]。对于严重的脊髓损伤，例如有大量组织缺损的完全性脊髓损伤，CST再生仍然是一个极大的挑战。
最近研究表明，电刺激和磁刺激可以增强锥体神经元电活动，会促进CST再生。Camel等用电刺激大鼠大脑皮层，结果他们发现电刺激能增加轴突的出芽和再生[5]。Benito等用经颅高频重复磁刺激脊髓损伤的病人头部，发现磁刺激能促进运动评分的提高[6]。另一项研究表明电刺激的机制中，包括激活mTOR信号通路和Jak/Stat信号通路[7]，从而增强CST的轴突生长。但是，电或者磁刺激能活化大片脑区，同时影响胶质细胞的行为，并非只对神经元有特异性，所以，电或磁刺激促进CST再生的真正机制还有待进一步阐明。与电刺激相比，光遗传学刺激对于靶标神经元更具有特异性与选择性。
光遗传技术是一种联合遗传学和光来精确控制激活或抑制细胞的技术[8]。首先神经元被基因改造成能表达光敏离子通道蛋白，包括channelrhodopsin、halorhodopsin和archaerhodopsin[9]。这些离子通道蛋白在特殊波长的光照下会选择性地让某些离子通过，从而改变细胞膜电位状态，使其发生动作电位，或者抑制神经元活性，从而达到通过光实现调控神经元电活动[10]。因此，这个技术可以实现通过光精确的时空实现调控神经元的激活或抑制。近年有研究表明，光遗传技术刺激大脑运动皮质也能促进皮质脊髓束向中脑红核侧枝出芽，从而提高脊髓损伤后动物的运动功能[11]。因此，光遗传技术可以增强损伤后的神经可塑性。但是目前流行的光遗传刺激方法大多使用光纤插入的方式，这种方式有两个缺陷，一是必须插入组织内部，对脑组织本身有损伤作用；二是光照范围小，仅实用于核团等需要小范围光照部位，不适用于皮层等需要大范围光照的部位。
例如，在一项利用光遗传学特异性激活神经元治疗大鼠中风模型的研究中[12]，研究人员需要大范围刺激皮层，他们通过在大鼠大脑皮层插入多根光纤来达到扩大光激活范围的目的，然而这种插入光纤的方式对皮层脑组织有损伤，多根光纤对脑组织的损伤范围更大。我们构建的LED灯来源的光遗传装置代替光纤扩大光照范围，避免了对脑组织的损伤。又因为皮层所处位置非常表浅，因此，表面给光也能达到刺激的目的，另外为了实现精确控制，我们采用波形发生器连接LED灯，可以实现精确控制给光的频率和波宽。
首先购买蓝光的LED灯(图1A)，将灯背面的接点两端焊接上电线，再用热熔胶枪将焊点和裸露的电线包裹绝缘(图1B)。通过连接波形发生器(图1C)和LED灯，控制灯的电压，频率以及波宽。LED灯发出蓝光，其波长范围在460nm-480nm(图1D)。
进一步验证装置是否有效，一是在体外实验中，采用电生理技术检测该装置能否引发脑片神经元动作电位；二是在小鼠头部安装该装置，刺激后能否引起大脑皮层第五层锥体神经元表达C-fos。利用转基因小鼠(Thy1-ChR2-YFP)，其在神经元特异地表达ChR2，将其大脑切成脑片，用膜片钳记录绿色荧光的大脑皮层第五层锥体神经元在LED蓝光刺激下能否引发动作电位(图2A)，结果显示，该装置能够实现蓝光刺激神经元产生动作电位，具有很好的守时性(图2B，2C)。接下来在体内实验中我们将该转基因小鼠的颅骨用牙科钻头磨薄，将LED灯贴在表面，用义齿基托树脂固定住，光刺激后90min采用免疫荧光技术检测大脑皮层第五层锥体神经元及早基因C-fos的表达情况。结果表明LED蓝光刺激后神经元有C-fos的表达(图3A，3B)，说明在体内被蓝光刺激后带ChR2基因的神经元可以被激活。
接下来我们使用这种方法刺激小鼠皮层，检测这种方法是否能促进CST的再生。将转基因小鼠和野生型小鼠做脊髓全横断损伤模型，3周以后将这种LED光遗传刺激装置用相同的方法贴在小鼠颅骨表面，每天给予光刺激，每次刺激40min，每天一次，两周后注射生物素化葡聚糖胺(biotin dextran amine，BDA)标记CST，一周后灌注动物取材切片，观察脊髓中CST的再生情况，结果显示与对照组(野生型组)相比这种光遗传刺激能够促进CST再生，CST的断端能进入损伤区(图4A，图4B)。
CST的再生一直是脊髓损伤领域的一大难点，目前研究认为缺乏内在生长能力可能是CST再生失败的主要原因，有研究认为，增强锥体神经元电活动，可能会促进它的CST再生。例如用电刺激和磁刺激，有研究表明电刺激的机制中，包括激活mTOR信号通路和Jak/Stat信号通路，从而增强CST的轴突生长，而光遗传技术比电或者磁刺激对于靶标神经元更具有特异性与选择性，因此利用光遗传技术能更特异地刺激大脑皮层第五层锥体神经元，达到特异地促进CST再生的目的。然而目前的光遗传刺激大多采用插入光纤的方式还有很多缺陷，为了解决插入光纤对脑组织的损伤和光照范围过小的问题，本发明专利旨在构建一种利用光遗传刺激装置来刺激广泛的大脑皮层从而特异性促进CST再生的方法来治疗脊髓损伤，也为脊髓损伤的治疗提供新的策略。
发明内容
为了克服现有光遗传刺激插入光纤对脑组织的损伤和光照范围过小的问题，本发明专利构建了一种利用大范围光遗传学刺激装置刺激大脑皮层，以促进皮质脊髓束再生治疗脊髓损伤的新方法，其能够在对脑组织无创的情况下避免刺激到胶质细胞，广泛而特异性地刺激大脑皮层锥体神经元，提高其电活动，而促进CST再生，从而为治疗脊髓损伤提供新方法。
本发明专利的基本方案包括：采用蓝光LED灯作为发光光源，用波形发生器精确控制其电压，频率和波宽，将其贴在磨薄的颅骨上，通过光照刺激大片区域大脑皮层中带有光敏离子通道蛋白ChR2的神经元产生动作电位，增加其电活动，通过对其进行光遗传刺激而实现促进其轴突CST的再生的效果，从而治疗脊髓损伤。
本发明专利的有益效果：此方法通过构建的LED光遗传装置可以在对脑组织无损伤的情况下更大范围地活化大片脑区的神经元，增强它们的电活动，促进脊髓损伤后皮质脊髓束的再生，从而为治疗脊髓损伤提供新的方法。
附图说明
图1LED光遗传装置的构建。(图A示LED贴片灯；图B示背后焊接电线的LED灯外观；图C示波形发生器外观；D示LED灯发出蓝光)。
图2电生理检测LED光遗传装置激活脑片中的神经元产生动作电位。(图A示LED光遗传装置正在体外进行光刺激脑片，同时电生理仪正在检测脑片中神经元的动作电位；图B示当LED光源的蓝光刺激脑片时，带有ChR2的大脑皮层神经元发出动作电位，频率为5HZ；图C示图B的放大图，示记录到的光刺激下的神经元发出的动作电位。)
图3免疫荧光技术检测LED光遗传装置激活体内大脑皮层锥体神经元。(图A示光刺激90min后大脑切片的C-fos和Map2双标的免疫荧光染色图片，bar＝100μm；B图示A图方框里的高倍图，箭头示在第五层表达ChR2和Map2的大锥体细胞表达C-fos，bar＝50μm。)
图4检测LED光遗传装置刺激两周后皮质脊髓束的再生情况。(图A，B分别示实验组和对照组的小鼠脊髓纵切片，bar＝1mm。A1，A2分别为A图的小鼠脊髓头端和损伤区的皮质脊髓束的标记情况。B1，B2分别为B图的小鼠脊髓头端和损伤区的皮质脊髓束的标记情况，bar＝50μm。)
图5摘要附图(本发明专利的整体思想模式图)
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明专利所用的仪器和试剂作详尽的描述：
1.主要仪器和试剂
LED贴片灯(深圳北科商贸有限公司)，波形发生器(郑州明禾电子科技有限公司)，夹子导线(上海华谊医用仪器有限公司)，锡焊电烙铁(温州伊莱科电气有限公司)，透明热熔胶棒(义务联溪胶棒厂)，热熔胶枪(苏州宝时得科技有限公司)，希玛数字光照度计(上海宝新仪器仪表有限公司)，立体定位仪+小鼠固定夹适配器(RWD公司)，呼吸麻醉机(RWD公司)，义齿基托树脂(上海新世纪齿科材料有限公司)，自凝牙托水(香港德派实业有限公司)，体视显微镜(德国Leica公司)，牙科钻(韩国SAEYANG MICROTECH)，冰冻切片机(Thormo)，震荡切片机(美国World Precision Instruments公司)，荧光显微镜(德国Leica公司)，0.01M PBS(中杉金桥)，Hoechst33342(Sigma)，山羊血清(GIBCO)，一抗(C-fos，CALBIOCHM)，二抗(Alex-555，Abcam)。
2.实验动物信息
(1)转基因小鼠：C57小鼠，B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J，进口自美国JAX公司。
(2)野生型小鼠：C57小鼠，由中山大学实验动物中心提供。
本发明专利详细的具体操作技术说明如下：
1.LED光遗传装置的构建
先将导线中的铜线暴露出来，用锡焊电烙铁把铜线焊接在LED灯背面的焊接点上。再用热熔胶枪把焊点和裸露的电线喷上透明熔胶包裹焊点和电线以绝缘，等待冷却后使用。连接波形发生器和LED灯的导线，控制灯的电压，频率以及波宽。参数如下：波形CMOS波，电压4.5V，频率5HZ，占空比1.7％。程序：每工作1min，间隔3min。使用另一台波形发生器设置外部触发信号，参数为：波形CMOS波，电压5V，频率4.17m HZ，占空比50％。被控制的波形发生器的调制模式参数设为：功能：BST(CH1)，模式：外部触发(AC)，控制：ON。安照此设置后，可以实现LED蓝光的电压4.5V，频率5HZ，波宽3ms，工作1min，休息3min的实验条件。
2小鼠颅骨磨骨后LED光遗传装置的安装
将小鼠用呼吸麻醉机麻醉后，把头部背侧皮毛剪干净；从中间剪开大约1.5cm的切口；用小鼠耳杆左右尖端卡住小鼠的耳蜗，两端的上下和左右的标尺保持一致，前端卡口扣住小鼠的牙齿和头部，固定完成后小鼠头部不能移动；小鼠头部以前囟bregma为零点，进行调整，保持和lambda在同一水平，即Z轴为0，前后平整；然后调Y轴为-2.5，X轴为1和-1，左右平整；在体视显微镜下，用牙科钻轻轻打磨前囟左右的区域，范围AP：1mm，LM(-1.5mm，1.5mm)，注意不要把颅骨磨穿，磨到颅骨变软，大脑的血管清晰可见(达到做双光子标准)为止，把构建好的LED光遗传装置用立体定位仪的持针夹固定住，然后用义齿基托树脂涂在装置周围，固定好整个装置，待义齿基托树脂变硬后再将持针夹撤去。
3.LED光遗传装置的刺激效果的检测
(1)电生理
用转基因小鼠麻醉后取材其大脑，用人工脑脊液浸泡着在震荡切片机上将其切成300μm厚度的脑片，复苏30min后，采用电生理仪用膜片钳技术记录大脑皮层锥体神经元在光刺激下动作电位的爆发情况。将LED光遗传装置安装在电生理仪旁边，将头部无限接近脑片，按照上述程序给光，同时记录，参数同步骤1。
(2)免疫荧光检测C-fos的表达情况
将安装好LED光遗传装置的小鼠用相同程序刺激30min，刺激的同时观察行为学变化。刺激90min后灌注取材小鼠大脑，后固定后浸泡在30％脱水，1周后冰冻切片机进行切片，再进行免疫组织化学荧光染色。先PBS清洗3次，每次10min，用10％的山羊血清在37C封闭30min，加上一抗C-fos在4℃冰箱孵育过夜，第二天用PBS清洗3次，每次10min，再加上二抗Alex-555在37℃孵育1h，再用PBS清洗3次，每次10min，然后用90％甘油封片，荧光显微镜下拍照观察。
4.小鼠脊髓全横断模型的构建
购买JAX实验室转基因小鼠(B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J)和中山大学动物实验中心的野生型小鼠，术前小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(0.64mg/10g)进行麻醉。经固定体位、备皮消毒后，在无菌条件下切开皮肤、浅筋膜，用器械沿T8～T10两侧棘突顺腰棘肌群走向钝性分离肌肉和韧带，用自制拉钩固定手术区域，清晰暴露T9棘突和椎弓，有齿镊轻提T9棘突，用眼科持针钳沿T9～T10椎弓间隙轻轻咬开椎弓根部，并逐渐咬下T9椎弓，暴露T10段脊髓。用直尖小梁剪剪开硬脊膜后，将一侧刀脚插到底部，快速全横断整个脊髓，充分止血后，依肌层、皮下组织、皮肤顺序逐层缝合。术后做好标记，每只动物肌肉注射青霉素16万单位1mL/d，连续3天，在膀胱区用手适度按压进行人工排尿，每日1～2次。为防止未长好的伤口被咬开，术后单笼喂养。此后，依据膀胱功能恢复情况，可逐渐减少排尿次数，动物饲养一个月后取材检测，期间给以保温，自然光照时间，以及充分的饮食。
5.LED光遗传装置刺激脊髓全横断小鼠大脑皮层
上述小鼠脊髓横断3周以后，按照2的同样的方法将LED光遗传装置安装在脊髓全横断的小鼠头部。每天将波形发生器的夹子导线连接上小鼠头部的LED光遗传装置，一台仪器同时控制两只小鼠。刺激程序：1min*10个刺激，每个刺激间隔3min，总时长40min，每天一次，刺激两周。
6.活化大片脑区对脊髓损伤后小鼠皮质脊髓束再生的效果检测
LED光遗传刺激2周后，采用BDA顺行示踪皮质脊髓束，观测其再生效果。将其头部固定于立体定位仪上，去除LED光遗传装置，用小型牙科钻前囟后1mm，旁开矢状缝1mm处打开颅骨，形成两个直径约3mm的圆形骨窗，即显露出两侧小鼠脑皮质体感运动区，在体视镜下，用微量注射器吸入需要量的10％BDA溶液(分子量10,000)，进行BDA注射。每侧脑选择4个注射点，注射点选择在前囟后1mm、2mm，旁开矢状缝1mm和2mm处，并避开血管。每个注射点的剂量为0.5μl，在距大脑皮层表面深度为1mm和0.5mm时，分别注入0.25μl和0.25μl，每次注射后针头要滞留5min，然后再缓慢的退针。总的说来，每只动物要接受4个注射点(光刺激侧)，BDA总量为4μl。注射完后逐层缝合头皮，继续常规饲养1周。术后肌肉注射青霉素16万U/ml/天，连续3天。期间给以保温，自然光照时间，以及充分的饮食，常规人工排尿。7天后动物灌注取材，荧光镜下拍照，评估CST的再生情况。
实验结果显示：
1.构建的LED光遗传装置可以在体外激活脑片产生动作电位
采用电生理仪记录在LED光遗传装置的光刺激下，转基因小鼠大脑皮层第五层锥体神经元动作电位爆发的情况，结果显示每1秒给5个光刺激，同时也记录到相应的动作电位爆发，频率为5HZ(图2)，这说明我们构建的LED光遗传装置可以达到光遗传刺激的效果。
2.构建的LED光遗传装置可以在体内激活大脑皮层的第五层锥体神经元
将LED光遗传装置安装在转基因小鼠头部，用相同的参数刺激小鼠，90min后灌注取材，免疫荧光结果显示，大片脑区的第五层锥体神经元表达C-fos(图3)，这说明我们构建的LED光遗传装置在体内可以达到刺激到大脑皮层第五层锥体神经元的效果。
3.采用光遗传技术活化大片皮层神经元可以提高脊髓损伤后小鼠皮质脊髓束的再生能力
构建小鼠脊髓全横断模型，在3周以后将LED光遗传装置安装在小鼠头部，每天进行光遗传刺激，刺激时长1min，每个刺激间隔3min，总时长40min，每天一次，刺激两周。注射BDA标记CST，一周以后灌注观察。结果显示对比对照组，光刺激转基因小鼠组的CST能够更近地到达损伤区(图4)。这说明这种活化大范围脑皮层的方法可以促进脊髓损伤后的皮质脊髓束的再生。
参考文献：
[1]Liu K，Lu Y，Lee JK，Samara R，Willenberg R，Sears-Kraxberger I，etal.PTEN deletion enhances the regenerative ability of adult corticospinalneurons.Nature neuroscience.2010；13：1075-81.
[2]Deumens R，Koopmans GC，Joosten EA.Regeneration of descending axontracts after spinal cord injury.Progress in neurobiology.2005；77：57-89.
[3]Thallmair M，Metz GA，Z′Graggen WJ，Raineteau O，Kartje GL，SchwabME.Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recoveryfollowing corticospinal tract lesions.Nature neuroscience.1998；1：124-31.
[4]Cafferty WB，Strittmatter SM.The Nogo-Nogo receptor pathway limitsa spectrum of adult CNS axonal growth.The Journal of neuroscience：theofficial journal of the Society for Neuroscience.2006；26：12242-50.
[5]Carmel JB，Kimura H，Berrol LJ，Martin JH.Motor cortex electricalstimulation promotes axon outgrowth to brain stem and spinal targets thatcontrol the forelimb impaired by unilateral corticospinal injury.The Europeanjournal of neuroscience.2013；37：1090-102.
[6]Benito J，Kumru H，Murillo N，Costa U，Medina J，Tormos JM，et al.Motorand gait improvement in patients with incomplete spinal cord injury inducedby high-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation.Topics inspinal cord injury rehabilitation.2012；18：106-12.
[7]Zareen N，Dodson S，Armada K，Awad R，Sultana N，Hara E，etal.Stimulation-dependent remodeling of the corticospinal tract requiresreactivation of growth-promoting developmental signalingpathways.Experimental neurology.2018；307：133-44.
[8]Yizhar O，Fenno LE，Davidson TJ，Mogri M，Deisseroth K.Optogenetics inneural systems.Neuron.2011；71：9-34.
[9]Zhang F，Gradinaru V，Adamantidis AR，Durand R，Airan RD，de Lecea L，etal.Optogenetic interrogation of neural circuits：technology for probingmammalian brain structures.Nature protocols.2010；5：439-56.
[10]Zhang F，Wang LP，Boyden ES，Deisseroth K.Channelrhodopsin-2andoptical control of excitable cells.Nature methods.2006；3：785-92.
[11]Ordaz JD，Wu W，Xu XM.Optogenetics and its application in neuraldegeneration and regeneration.Neural regeneration research.2017；12：1197-209.
[12]Wahl AS，Buchler U，Brandli A，Brattoli B，Musall S，Kasper H，etal.Optogenetically stimulating intact rat corticospinal tract post-strokerestores motor control through regionalized functional circuitformation.Nature communications.2017；8：1187.
Claims (7)
1.一种光遗传学刺激大范围大脑皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的方法，其特征是：(1)只在大脑皮层表面进行光照刺激，不侵入脑组织；(2)采用蓝光发光二极管(light emitting diode，LED)作为光刺激的光源；(3)皮层第五层锥体神经元特异性表达光敏离子通道蛋白(channelrhodopsin 2，ChR2)；(4)单个LED灯光照范围大于0.5×0.5平方厘米；(5)蓝光特异性地活化第五层锥体神经元；(6)脊髓损伤后，光活化第五层锥体神经元促进其轴突，即皮质脊髓束出芽或者再生；(7)光活化促进皮质脊髓脊髓束出芽或者再生能促进脊髓损伤后神经功能修复。
2.根据权利要求1所述的促进神经元轴突出芽或者再生的方法所使用的刺激装置具有以下特征：(1)使用蓝光LED灯，作为光遗传刺激的光源以扩大光照面积，从而活化大片脑区，包括运动皮层、感觉皮层、视皮层、听皮层等浅表脑区；(2)LED灯的光强、频率以及波宽以达到需要的光刺激参数可实现精确调控。
3.根据权利要求1所述的此种光刺激大范围皮层的方法，其皮层第五层锥体神经元可特异性表达阳离子和阴离子的光敏离子通道蛋白，包括：ChR1，ChR2，NpHR以及基因改造的eNpHR3.0，Arch，ArchT，eBR，Mac以及基因改造的eArch3.0，eArchT3.0和eMac3.0，Jaws，NsXeR等。
4.根据权利要求1所述的促进皮质脊髓束再生的方法，其特征是：(1)在不损伤脑组织的情况下进行光刺激，增强神经元电活动，促进脊髓损伤后皮质脊髓束的出芽或再生。(2)进行大范围的光刺激，增强大片脑区的神经元电活动，促进脊髓损伤后大量皮质脊髓束的出芽或再生。(3)特异性针对神经元的光刺激，避免了对胶质细胞及其他细胞的影响，从而特异地增强神经元电活动。
5.根据权利要求1所述的此种光刺激大范围大脑皮层促进皮质脊髓束再生的方法，此方法可应用于促进包括人类，非人灵长类，犬类，猪类，羊类，兔类及鼠类等哺乳动物的脊髓损伤后皮质脊髓束的再生。
6.根据权利要求1所述的光刺激大范围大脑皮层促进皮质脊髓束再生修复脊髓损伤的方法，刺激方法还可包括电刺激和电磁刺激等大范围对皮层的刺激来促进脊髓损伤后皮质脊髓束的再生。
7.根据权利要求2所述的刺激装置特征，此装置还可以使用黄光、橙光、红光等LED灯，作为光刺激的光源扩大光照面积，从而抑制大片脑区的活动，包括运动皮层、感觉皮层、视皮层、听皮层，从而减少神经元轴突出芽或者再生，达到调控神经元轴突或突触过度生长的目的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910103715.2A CN109701166B (zh) | 2019-02-02 | 2019-02-02 | 一种光遗传刺激促进皮质脊髓束再生修复脊髓损伤的装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910103715.2A CN109701166B (zh) | 2019-02-02 | 2019-02-02 | 一种光遗传刺激促进皮质脊髓束再生修复脊髓损伤的装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109701166A true CN109701166A (zh) | 2019-05-03 |
| CN109701166B CN109701166B (zh) | 2023-08-25 |
Family
ID=66264051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910103715.2A Active CN109701166B (zh) | 2019-02-02 | 2019-02-02 | 一种光遗传刺激促进皮质脊髓束再生修复脊髓损伤的装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109701166B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110125078A1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-05-26 | Medtronic, Inc. | Optical stimulation therapy |
| US20120295376A1 (en) * | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Method for manufacturing a led array device, and led array device manufactured thereby |
| CN104436447A (zh) * | 2014-10-11 | 2015-03-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种用于脊髓功能调控的闭环光刺激系统 |
| US20170065828A1 (en) * | 2014-05-09 | 2017-03-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Autofocus wireless power transfer to implantable devices in freely moving animals |
| US20180311506A1 (en) * | 2008-04-23 | 2018-11-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
-
2019
- 2019-02-02 CN CN201910103715.2A patent/CN109701166B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180311506A1 (en) * | 2008-04-23 | 2018-11-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
| US20110125078A1 (en) * | 2009-11-25 | 2011-05-26 | Medtronic, Inc. | Optical stimulation therapy |
| US20120295376A1 (en) * | 2011-05-16 | 2012-11-22 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Method for manufacturing a led array device, and led array device manufactured thereby |
| US20170065828A1 (en) * | 2014-05-09 | 2017-03-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Autofocus wireless power transfer to implantable devices in freely moving animals |
| CN104436447A (zh) * | 2014-10-11 | 2015-03-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种用于脊髓功能调控的闭环光刺激系统 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "健康新知", 《中国新闻周刊》 * |
| 李飞等: "以LED为光源的生命医疗前沿技术进展", 《生命科学仪器》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109701166B (zh) | 2023-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Tetherless near-infrared control of brain activity in behaving animals using fully implantable upconversion microdevices | |
| Aravanis et al. | An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology | |
| JP6189381B2 (ja) | 標的細胞を光刺激するためのシステム、方法、および組成物 | |
| Bellardita et al. | Spatiotemporal correlation of spinal network dynamics underlying spasms in chronic spinalized mice | |
| Katz et al. | Optopatcher—an electrode holder for simultaneous intracellular patch-clamp recording and optical manipulation | |
| Zheng et al. | A shape-memory and spiral light-emitting device for precise multisite stimulation of nerve bundles | |
| AU2016200322A1 (en) | Apparatus and methods for controlling cellular development | |
| CA2587522A1 (en) | Stimulation of neural tissue with light | |
| JP2009524480A (ja) | 独立型の電磁気によるセレブロフェイシャル領域の治療装置及びこれを利用する方法 | |
| Sheng et al. | Activation of ventrolateral orbital cortex improves mouse neuropathic pain–induced anxiodepression | |
| CN112168420A (zh) | 一种癫痫动物模型及其构建方法和应用 | |
| CN102784010A (zh) | 大鼠初级听皮层微电极阵列植入固定手术方法 | |
| CN106073772A (zh) | 一种基于光遗传学‑电生理技术的动物神经功能检测平台 | |
| Zhao et al. | GABAergic neurons in the rostromedial tegmental nucleus are essential for rapid eye movement sleep suppression | |
| Ward et al. | Optical stimulation and electrophysiological analysis of regenerating peripheral axons | |
| Heiney et al. | Single-unit extracellular recording from the cerebellum during eyeblink conditioning in head-fixed mice | |
| CN109701166A (zh) | 一种光遗传学刺激活化大范围皮层促进皮质脊髓束再生以修复脊髓损伤的方法 | |
| Katsuta et al. | Release from GABAA receptor-mediated inhibition unmasks interlaminar connection within superior colliculus in anesthetized adult rats | |
| Leighton et al. | Lightweight, wireless LED implant for chronic manipulation in vivo of spontaneous activity in neonatal mice | |
| Clark et al. | Selective, high-optrode-count, artifact-free stimulation with infrared light via intrafascicular utah slanted optrode arrays | |
| Chen et al. | Encode the “STOP” command by photo-stimulation for precise control of rat-robot | |
| Bourdet et al. | Distribution of visual callosal neurons in normal and strabismic cats | |
| Cayce et al. | Relating optical signals induced by infrared neural stimulation to electrophysiology | |
| Masuda et al. | Comparison of cell-type specific optogenetic cortical stimulation targeting distinct neural populations for the restoration of vision | |
| Zhou | Syringe-injectable mesh electronics: Seamless integration with the central nervous system and biomedical applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |