CN109701024B - Bk通道开放剂的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，尤其涉及BK通道开放剂的新用途。所述BK通道开放剂选自NS1619和BMS191011中的一种或者两者的组合。本发明经过对动物模型给与BK通道开放剂NS1619和BMS191011干预后的生化指标检测，离体细胞研究，蛋白印迹及数据分析等实验方法显示，所述BK通道开放剂NS1619和BMS191011具有抑制肾纤维化作用，包括抑制ECM积累的作用，抑制肾纤维化标志物产生的作用，抑制TGF/Smad信号通路的作用。本发明为抑制肾纤维化等药理作用的机制提供了理论基础，也为BK通道开放剂作为制备治疗慢性肾脏病的药物奠定了试验基础，具有重要的意义。

Description

BK通道开放剂的新用途

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及BK通道开放剂的新用途。

背景技术

近年来慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)在国内外都呈逐年上升趋势，其中我国成年人群中慢性肾脏病的患病率为10.8％，主要病因包括慢性肾小球肾炎、高血压肾病、糖尿病肾病、肾间质疾病、肾小管性疾病、先天性获得性肾脏疾病以及不合理服用肾毒性药物等。慢性肾脏病(CKD)的进展不仅导致终末期肾衰竭(end-stage renaldisease,ESRD)，也是全因死亡的高危因素。各种原因引起的慢性肾脏病(CKD)发展到肾衰竭(ESRD)的共同通路是肾纤维化，包括肾小球纤维化、肾间质纤维化以及肾脏小血管的透明变性和硬化，是细胞外基质(ECM)在肾组织异常聚集的结果。肾纤维化病因和发病机制尚不清楚，目前在预防和治疗上均缺乏有效的方法。然而，在临床上尽管采用了昂贵的免疫抑制、血液透析等治疗方式，也不能真正阻止肾纤维化进程。因此，深入研究肾纤维化的病理机制，研究并发现药物靶标及安全有效的药物治疗方式，从而尽早采取防治措施，对于延缓和治疗肾纤维化具有重大意义。

大电导钙激活钾通道(BK通道)，又名MaxiK/KCa1.1通道，由KCNMA1基因编码并在大多数细胞和组织中广泛表达。BK通道的特点是不仅受到电压调控，对细胞内Ca²⁺变化也十分敏感(nM级)，通常与电压依赖性钙通道相偶联，对调节细胞内钙平衡和膜兴奋性起着重要作用。BK通道的激活、失活或变异与多种疾病的发生和发展有关，例如，作为血管平滑肌上的优势离子通道，BK通道的激活和表达增加能够平衡高血压是冠状动脉张力的上升，增加平滑肌细胞舒张功能适应。有关BK通道在兴奋性组织中的作用已有广泛研究，但其在非兴奋性组织如肾脏、骨骼、肿瘤细胞和免疫细胞中的研究近年来才引起关注，如，BK通道可调节脂肪细胞分化；在肿瘤发生及免疫过程中，BK通道能够抑制肿瘤细胞增殖，影响其迁移，表现出抗肿瘤的特性；在固有免疫中，阻断BK通道是微生物杀伤和消化过程受到抑制。

NS1619和BMS191011是都是BK通道的开放剂，目前尚未见有关BK通道开放剂抑制肾纤维化作用的报道。

发明内容

本发明公开了一种BK通道开放剂的新用途，为BK通道开放剂抑制肾纤维化等药理作用机制提供了理论基础，具体技术方案如下：

本发明一方面公开了BK通道开放剂在用于制备抑制肾纤维化产品中的应用。

肾脏纤维化，是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。

优选的，所述BK通道开放剂选自NS1619和BMS191011中的一种或者两者的组合。

应当理解，所述BK通道开放剂并不限于NS1619或BMS191011，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的BK通道开放剂，并且本发明的保护范围之内。

优选的，所述BK通道开放剂具有如下任意一项作用：

(1)抑制细胞外基质的积累；

(2)抑制肾纤维化标志物的产生；

(3)抑制TGF/Smad信号通路。

更优选的，所述肾纤维化标志物包括纤连蛋白(Fibronectin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(vimentin)。

应当理解，所述肾纤维化标志物并不限于纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白，在本发明的教导之下，本领域技术人员能够选择任何其他合适的肾纤维化标志物，并且本发明的保护范围之内。

更优选的，BK通道开放剂能够降低TGF-β1、p-smad2、p-smad2、TGF-β受体TGRⅠ和TGRⅡ的蛋白水平。

在本发明的一具体实施例中，BK通道开放剂通过降低TGF-β1、p-smad2、p-smad2、TGF-β受体TGRⅠ和TGRⅡ的蛋白水平以减轻肾纤维化过程中对肾功能单位的损害。

优选的，所述抑制肾纤维化产品为治疗慢性肾脏病的药物。

优选的，所述肾纤维化为单侧输尿管结扎引起的肾小管间质纤维化。

优选的，所述肾纤维化为叶酸诱导肾损伤引起的肾小管间质纤维化。

本发明第二个方面公开了一种产品，其活性成分为BK通道开放剂，所述产品至少具备以下用途中的一种：

(1)抑制细胞外基质(ECM)的积累；

(2)抑制肾纤维化标志物的产生；

(3)抑制TGF/Smad信号通路。

本发明第三个方面公开了BK通道开放剂在用于建立肾纤维化模型中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明首次公开了BK通道开放剂在抑制肾纤维化过程中的应用，进行了动物试验和细胞试验，使用了组织形态学分析和蛋白印迹试验等实验方法，为抑制肾纤维化等药理作用的机制提供了理论基础，也为BK通道开放剂作为制备治疗慢性肾脏病的药物奠定了试验基础。此外，该BK通道开放剂还可用于建立肾纤维化模型。

附图说明

图1是BMS191011干预UUO小鼠肾脏HE染色和Sirius red染色(200X)。

图2是BMS191011减少UUO引起的肾纤维化标志蛋白的生成且降低TGF/Smad信号通路蛋白的表达水平。

图3是NS1619干预UUO小鼠肾脏Masson和Sirius red染色(200X)。

图4是BMS191011干预叶酸诱导肾损伤小鼠肾脏HE染色、Masson染色和Sirius red染色(200X)。

图5是BMS191011与NS1619干预TGF-β1诱导NRK-49F细胞纤维化蛋白表达。

图6是NS1619干预TGF-β1诱导NRK-52细胞纤维化蛋白表达。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明进行了动物实验和细胞实验，经对建立的动物模型和细胞模型，给予BK通道开放剂进行干预，使用了组织形态学分析，蛋白印迹实验等实验方法。本发明的实施例中，对建立的动物模型给与NS1619和/或BMS191011干预，结果显示，所述NS1619和/或BMS191011均能实现对病理环境诱导的纤维化的抑制；所述NS1619和/或BMS191011通过抑制TGF/smad信号通路减轻纤维化过程中对肾单位的损害，所述NS1619和/或BMS191011进一步可用于制备治疗肾纤维化。

本发明所述的NS1619和/或BMS191011均是BK通道开放剂，通过市售的渠道获得。

本发明实施例中，具体进行了包括以下步骤的干预实验：

(1)小鼠单侧输尿管阻塞手术

(2)小鼠叶酸诱导肾纤维化实验

(3)组织形态学分析

(4)离体细胞研究

(5)蛋白印迹实验

(6)数据分析

在以下实施例中，给与动物BK通道开放剂NS1619或BMS191011，腹腔注射，给药剂量分别是4mg/kg和10mg/kg。

实施例1

1.1试验材料：甲醇(国药集团化学试剂有限公司)，多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，细胞培养液：RPMI 1640培养基、DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，PBS磷酸盐缓冲液，胰蛋白酶(Gibco)，TGF-β1(R&D)，DMSO(Sigma)，Page Ruler^TM Prestmned Protein Ladder(Fermen tas)Mouse monoclonal toalpha muscle Actin(Abcam)，E-cadhefin rabbit monoclonal antibody(Epitomics)，PAl-1rabbit monoclonal antibody(Epitomics)，HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(明睿生物)，beta-Actin antibody(Sigma)，BSA(Sigma)，双氧水(国药集团化学试剂有限公司)，苏木素染液(武汉谷歌生物科技有限公司)，盐酸，氨水(国药集团化学试剂有限公司)，中性树胶(谷歌生物)。

1.2主要仪器和设备：超净工作台苏州净化装备有限公司，C0₂细胞培养箱(ThermoFisher)、冷冻离心机(Thermo Fisher)、培养皿(Thermo Fisher)、Millipore水纯化系统、凝胶电泳装置Bio Rad，转印装置Bio Rad，CA及高压灭菌锅Thermo(美国)，凝胶图像处理系统Alpha Innotech Corporation，倒置显微镜(Laica，DMIL，Wetzlar，德国)

1.3主要实验方法：

一、BK通道开放剂BMS191011抑制单侧输尿管结扎(unilateral ureteralocclusion，UUO)诱导小鼠肾纤维化实验

所有实验经过复旦大学上海医学院动物关爱和使用委员会核准。本发明采用雄性成年C57小鼠(复旦大学药学院动物实验中心提供，上海，中国)。

1.3.1分组：取8周龄C57小鼠，40只，体重20-22g，小鼠分为假手术组和UUO组，其中假手术组(sham组)又分为：赋形剂对照组(vehicle组)和BMS191011组；UUO组分为：UUO+赋形剂对照组和UUO+NS1619组，每组5只小鼠。

1.3.2造模：用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定；剪掉腹部毛发，碘伏消毒腹部皮肤，腹部正中切口2cm，止血钳固定，分离左侧输尿管，用4-0丝线双重结扎，缝合切口，消毒；假手术组(sham组)所有操作相同，但不结扎输尿管。

造模第一天开始BMS191011组和UUO+BMS191011组腹腔注射10mg/kg的BMS191011，其他两组腹腔注射相同体积的生理盐水，每天一次，持续7天。

1.3.3造模7天分别取肾。3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开腹经腹主动脉取血，静置离心取血清，液氮中速冻后-80℃保存；同时取肾脏组织PBS洗涤，放到液氮中速冻后-80℃保存。

1.3.4肾脏病理学指标：肾脏组织置于4％福尔马林固定，石蜡包埋，切为4μm厚度的切片，进行HE染色和Masson染色，在光镜下观察并进行分析，检测肾纤维化程度。结果如图1所示，BK通道开放剂BMS19101可减少UUO诱导肾损伤引起的肾细胞外基质和胶原蛋白的产生，减少肾细胞的坏死。

1.3.5蛋白印迹实验：按照实验步骤使用RIPA裂解液进行肾组织裂解。使用BCA蛋白定量试剂盒对组织裂解液进行蛋白定量。调整蛋白裂解液浓度，加入适量5×SDS PAGE上样缓冲液，混匀，100℃煮沸5分钟。运用SDS-PAGE电泳和蛋白印迹法，检测各组小鼠肾组织中蛋白表达水平。结果如图2所示，BK通道开放剂BMS191011可减少UUO引起的肾纤维化标志蛋白Fibronectin、α-SMA、vimentin的产生。并且，BK通道开放剂BMS191011可降低UUO引起的TGF/Smad信号通路蛋白TGF-β1、p-smad2、p-smad2、TGF-β受体TGRⅠ和TGRⅡ的水平。

二、BK通道开放剂NS1619抑制单侧输尿管结扎(unilateral ureteralocclusion，UUO)诱导小鼠肾纤维化实验

所有实验经过复旦大学上海医学院动物关爱和使用委员会核准。本发明采用雄性成年C57小鼠(复旦大学药学院动物实验中心提供，上海，中国)。

1.3.6分组：取8周龄C57小鼠，40只，体重20-22g，小鼠分为假手术组和UUO组，其中假手术组(sham组)又分为：赋形剂对照组和NS1619组；UUO组分为：UUO+赋形剂对照组和UUO+NS1619组，每组5只小鼠。

1.3.7造模：用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定；剪掉腹部毛发，碘伏消毒腹部皮肤，腹部正中切口2cm，止血钳固定，分离左侧输尿管，用4-0丝线双重结扎，缝合切口，消毒；假手术组(sham组)为所有操作相同，但不结扎输尿管。

造模第一天开始NS1619组和UUO+NS1619组腹腔注射4mg/kg的NS1619，其他两组腹腔注射相同体积的生理盐水，每天一次，持续7天。

1.3.8造模7天分别取肾。3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开腹经腹主动脉取血，静置离心取血清，液氮中速冻后-80℃保存；同时取肾脏组织PBS洗涤，放到液氮中速冻后-80℃保存。

1.3.9肾脏病理学指标：肾脏组织置于4％福尔马林固定，石蜡包埋，切为4μm厚度的切片，进行Masson染色和Sirius red染色(天狼腥红染色)，在光镜下观察并进行分析，检测肾纤维化程度。结果如图3所示，BK通道开放剂NS1619可减少UUO诱导肾损伤引起的肾细胞外基质和胶原蛋白的产生，减少肾细胞的坏死。

实施例2BK通道开放剂BMS191011抑制叶酸诱导小鼠肾纤维化实验

本实施例公开了BK通道开放剂BMS191011抑制叶酸诱导小鼠肾纤维化实验，具体步骤如下：

所有实验经过复旦大学上海医学院动物关爱和使用委员会核准。本发明采用雄性成年C57小鼠(复旦大学药学院动物实验中心提供，上海，中国)。

2.1分组：取8周龄C57小鼠，体重20-22g，小鼠分为对照组(CON组)、FAN组、BMS191011组和FAN+BMS191011组，每组5只小鼠。

2.2造模：FAN组和FAN+BMS191011组腹腔注射25mg/kg叶酸，造模。造模第一天开始BMS191011组和FAN+BMS191011组腹腔注射10mg/kg的BMS191011，其他两组腹腔注射相同体积的生理盐水，每天一次，持续4周。

2.3造模28天分别取肾,3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开腹经腹主动脉取血，静置离心取血清，液氮中速冻后-80℃保存；同时取肾脏组织PBS洗涤，放到液氮中速冻后-80℃保存。

2.4肾脏病理学指标：肾脏组织置于4％福尔马林固定，石蜡包埋，切为4μm厚度的切片，进行HE染色、Masson染色和天狼腥红染色，在光镜下观察并进行分析，检测肾纤维化程度，结果如图4所示。

2.5蛋白印迹实验:按照实验步骤使用RIPA裂解液进行肾组织裂解。使用BCA蛋白定量试剂盒对组织裂解液进行蛋白定量。调整蛋白裂解液浓度，加入适量5×SDS PAGE上样缓冲液，混匀，100℃煮沸5分钟。运用SDS-PAGE电泳和蛋白印迹法，检测各组小鼠肾组织中蛋白表达水平。

实施例3BK通道开放剂NS1619或BMS191011抑制TGF-β1诱导肾成纤维细胞NRK-49F肾纤维化细胞实验

一、NS1619抑制TGF-β1诱导大鼠肾成纤维细胞NRK-49F肾纤维化

试验步骤如下：

将大鼠肾成纤维细胞NRK-49F接种于孔板，6孔板中每孔细胞种植密度为30％，细胞铺板过夜后，使用无血清培养基进行细胞培养，细胞分为对照组，纤维化组(TGF-β1为10ng/ml)，极低剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+NS1619 5μM)，低剂量给药组(TGF-β110ng/ml+NS1619 10μM)，中剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+NS1619 20μM)，高剂量给药组(TGF-β110ng/ml+NS1619 30μM)，细胞培养24小时之后，加入细胞裂解液，提取细胞蛋白，采用western blot法检测细胞中Fibronectin、α-SMA、p-smad2和GAPDH蛋白含量，结果如图5所示，BK通道开放剂NS1619可减少TGF-β1诱导NRK-49F诱导的肾纤维化标志蛋白Fibronectin、α-SMA的产生。BK通道开放剂BMS191011或NS1619可降低TGF-β1诱导NRK-49F诱导的p-smad2蛋白的磷酸化水平。

二、BMS191011抑制TGF-β1诱导肾成纤维细胞NRK-49F肾纤维化

试验步骤如下：

将大鼠肾成纤维细胞NRK-49F接种于孔板，6孔板中每孔细胞种植密度为30％，细胞铺板过夜后，使用无血清培养基进行细胞培养，细胞分为对照组，纤维化组(TGF-β1为10ng/ml)，极低剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+BMS1910115μM)，低剂量给药组(TGF-β110ng/ml+BMS191011 10μM)，中剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+BMS191011 20μM)，高剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+BMS19101130μM)，细胞培养24小时之后，加入细胞裂解液，提取细胞蛋白，采用western blot法检测细胞中Fibronectin、α-SMA、p-smad2和GAPDH蛋白含量，结果如图5所示，BK通道开放剂BMS191011可减少TGF-β1诱导NRK-49F诱导的肾纤维化标志蛋白Fibronectin、α-SMA的产生。BK通道开放剂BMS191011或NS1619可降低TGF-β1诱导NRK-49F诱导的p-smad2蛋白的磷酸化水平。

实施例4NS1619抑制TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E肾纤维化

本实施例试验步骤如下：

将大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E接种于孔板中，6孔板中每孔细胞种植密度为30％，细胞铺板过夜后，使用无血清培养基进行细胞培养，细胞分为对照组，纤维化组(TGF-β1为10ng/ml)，极低剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+NS1619 5μM)，低剂量给药组(TGF-β110ng/ml+NS1619 10μM)，中剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+NS1619 20μM)，高剂量给药组(TGF-β1 10ng/ml+NS1619 30μM)，细胞培养48小时之后，加入细胞裂解液，提取细胞蛋白，采用western blot法检测细胞中Fibronectin、α-SMA、p-smad2和GAPDH蛋白含量。试验结果如图6所示，BK通道开放剂NS1619减少TGF-β1诱导NRK-52E诱导的肾纤维化标志蛋白Fibronectin、α-SMA的产生。BK通道开放剂NS1619可降低TGF-β1诱导NRK-52E诱导的p-smad2蛋白的磷酸化水平。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.BK通道开放剂在用于制备抑制肾纤维化产品中的应用，其特征在于，所述BK通道开放剂选自NS1619和BMS191011中的一种或者两者的组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BK通道开放剂具有如下任意一项作用：

抑制细胞外基质的积累；

抑制肾纤维化标志物的产生；

抑制TGF/Smad信号通路。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肾纤维化标志物包括纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，BK通道开放剂能够降低TGF-β1、p-smad2、TGF-β受体TGRⅠ和TGRⅡ的蛋白水平。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肾纤维化产品为治疗慢性肾脏病的药物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾纤维化为单侧输尿管结扎引起的肾小管间质纤维化。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾纤维化为叶酸诱导肾损伤引起的肾小管间质纤维化。

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