CN109690613B - 邻近影响补偿 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在至少一个数字图像中的多个对象之间进行邻近影响补偿的方法，其中所述至少一个数字图像包含关于多个对象的图像信息。多个对象中的每一个被配置为接收包括遗传信息的至少一个分子，其中所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物，并且所述至少一个数字图像是在由至少一个分子接收的荧光化合物的电磁辐射的发射期间由光学成像系统获取的。

Description

邻近影响补偿

技术领域

本发明涉及用于邻近影响补偿的系统和方法。更具体地，本发明涉及由在不同颜色通道中的不同荧光化合物发射的电磁辐射的邻近影响补偿，优选用于DNA测序。

背景技术

生物技术、医学和相关技术领域是基于分子的分析。电子设备能够以高精度和特异性地分析分子。特别是在过去几年中，已经开发出用于通过常规方法分析大量样品的自动电子设备。例如，用于大量DNA探针的常规分析的现代DNA测序装置。能够通过高通量筛查和相关方法分析蛋白质样品。经常，这种电子设备检测从样品探针发射的荧光信号。当用荧光化合物(诸如，染料)标记分子(例如核酸或蛋白质)时，这是可能的。

市售的测序装置能够平行地对大量标记有荧光染料的样品进行测序。最近开发的方法，称为“新一代测序”，NGS，已经彻底改革了测序。NGS允许在流动池中或通过油-水乳液的产生空间分离的克隆扩增或单个DNA分子的大规模平行测序。NGS允许同时执行数千甚至数百万至数十亿的测序反应。

在NGS中，通过重复循环聚合酶介导的核苷酸延伸、或以一种形式通过寡核苷酸结扎的迭代循环执行测序。作为大规模平行的过程，具体取决于平台，NGS在单个仪器运行中产生数百兆碱基到千兆碱基的核苷酸序列输出。与传统方法相比，廉价生产大量序列数据是主要优点。

用于NGS技术的NGS平台和通用应用/领域在Voelkerding等人于2009年在《临床化学》的55：4 641-658、Metzker于2010年1月在《Nature Reviews/Genetics》第11卷的第31-46页和Sara Goodwin等人于2016年6月在《Nature Reviews Genetics》的第17卷的第333-351页中加以评论。

在NGS中，各种感兴趣的寡核苷酸共价地附接于支持物。随后，用DNA聚合酶将用荧光染料标记的核苷酸附接到生长的寡核苷酸链上。当用不同的荧光染料标记四个核苷酸时，能够检测从探针发射的荧光信号并且能够确认与寡核苷酸附接的核苷酸的类型。检测后，切下荧光染料并执行下一个合成循环，其中新的标记的核苷酸附接到生长链。通过执行多个循环，能够以逐步的方式确定生长的寡核苷酸链的序列。工作步骤在自动测序装置中执行。

US 2010/0323350 A1和WO 2009/117119 A1涉及使用例如通过合成方法测序获得的数据来确定核苷酸序列中核酸的身份的方法和组合物。

WO 2008/097455 A1涉及一种用于激发和测量包含荧光材料，例如，荧光标记、染料或颜料，的样品上或样品中的荧光的成像系统，特别是检测核酸上的荧光标记。此外，公开了一种被配置为使得同时检测多个不同DNA模板中的荧光标记的装置。

WO 2014/020137 A1涉及一种从测序文库富集靶序列以提供靶富集测序文库的方法，其中所述测序文库适合于大规模平行测序并且包括多个双链核酸分子。

具有标记的分子的样品探针发出的荧光信号弱，但必须以高精度和特异性检测该信号。因此，这种过程需要精确的光学设备，尤其是照相机和扫描技术。

此外，例如，在FASTQ中，由测序装置的光学成像系统捕获的数字图像的广泛评估对于获得精确和可靠的测序结果是必要的。

发明内容

除其它外，本发明基于用光学系统(例如，显微镜)观察到的对象的认识，例如，由于光学系统的光衍射可以是模糊的。因此，从两个邻近但物理上分离的对象发出的光能够在检测器平面，例如，引起邻近对象的信号的混合或组合中相当重叠。在本发明的上下文中，该重叠可以被称为邻近影响。

由于叠加属性，邻近影响可以相互地增加空间上接近的珠子的检测光强度。这能够劣化特定碱基是否处于指定位置的决策的质量。此外，它能够导致将原始暗淡的珠子错误地分类为活珠，并且能够导致不正确的碱基调用。此外，邻近影响可能降低暗珠和活珠之间的对比度，潜在地阻碍它们辨别的适当阈值的确定。此外，由于邻近对象的信号的重叠或混合，该对象可能看起来如好像多个不同的DNA链附接到一个对象上(多克隆性)。

进一步，由于原始序列可能丢失的邻近影响，明亮对象可能支配实际信号。反而，可以读出光学复制，这在后面的处理步骤中可能在统计上是不利的。

在任何情况下，这种邻近效应都可能导致数据丢失。

因此，本发明的目的是在其他方法和系统中，提供一种克服了现有技术的上述问题的方法和系统。特别地，一个目的是补偿邻近影响。

该目的通过独立权利要求的特征实现。从属权利要求涉及本发明的其他方面。

根据本发明的方法是计算机实现的。然而，本领域技术人员应当理解的是，还存在实现根据本发明的方法的其他方式。

本发明涉及一种在至少一个数字图像中的多个对象之间的邻近影响补偿的方法，其中所述至少一个数字图像包含关于多个对象的图像信息。多个对象中的每一个被配置为接收包括遗传信息的至少一个分子，其中所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物。此外，至少一个数字图像在由至少一个分子接收的荧光化合物的电磁辐射的发射期间由光学成像系统获取。该方法包括，优选地按以下顺序的以下步骤：

a)提供描述由光学系统对对象成像的模型，该模型定义方程，该方程将已经穿过光学系统的电磁辐射的确定的强度与电磁辐射的原始强度相关联；

b)基于至少一个数字图像确定多个对象的强度值；以及

c)通过求解原始强度的方程，基于确定的强度值和模型确定多个对象的补偿的强度值。

换句话说，根据本发明的方法可以适用于通过找到由描述光学系统中对象的成像过程的模型定义的方程的解来确定补偿的强度值，该补偿的强度值可能对应由荧光化合物发射的电磁辐射的原始强度值。因此，补偿的值可能对应于方程的原始值的解。例如，补偿的值可以等于原始值的解。补偿的强度值也可以表示为重建的强度值。换句话说，邻近影响补偿算法可以近似恢复成像过程的基础的原始荧光强度，以减弱上述邻近影响的结果。

以这种方式，可以补偿由于穿过光学系统的光导致对象模糊的效果。

所述至少一个对象可以是珠子。这种珠子是市售的，例如，Thermo Fisher的磁珠(Dynabeads)。例如，图像可以包含大约400000或更多珠子的图像信息。

所述对象也可以是已经接收至少一条DNA/RNA链的活珠。DNA/RNA链可以是单链DNA/RNA片段。然而，至少一个对象也可以是未接受DNA/RNA链的珠子。换句话说，邻近影响效应可以独立于DNA/RNA的存在，因为每个信号贡献可能是相关的，例如，因为用于邻近影响补偿的模型可能仅取决于单独信号贡献的总和。

本文描述的邻近影响补偿方法也可以在无珠测序方法中执行。因此，可以理解的是，多个对象中的每一个包括至少一个分子。

每条DNA链可以被配置来接收分子，优选核苷酸。核苷酸可包括一个可分裂的荧光化合物和可分裂的帽。此外，分子可以是多个四个不同的分子，每个分子对四个不同的分子中的每一个具有特异的荧光化合物。因此，每个对象可以以一定强度辐射电磁辐射。此外，由对象接收的每条DNA/RNA链可能已经接收了这样的分子。由对象辐射的电磁辐射的强度可以称为原始强度。另一方面，由光学成像系统确定的强度可以称为确定的强度或原始强度。

光学成像系统优选地包括照明装置，例如LED，来激活/刺激一个或多个荧光化合物以激发电磁辐射，和检测系统，例如CCD检测器，来检测一个或多个荧光化合物的发射光谱(电磁辐射)。

该方法可以被执行经过多个循环，并且可以在限定的循环范围上实施。多个循环中的每一个的特征可以在于四个分子中的一个与DNA链中的一条附接，其中可分裂的帽确保在一个循环期间仅一个分子与一条DNA链附接。在每个循环后，可以除去可分裂的帽，使得另一个分子可以在下一个循环中与所述DNA链附接。同时，可以从至少一个分子中除去荧光化合物。

对于每个循环，可以获取多个，优选地四个数字图像，例如照片，一个图像为附接于分子的四个荧光化合物中的每一个。例如，可以用不同的滤色器获取多个数字图像中的每一个。此外，四个荧光化合物中的每一个可以具有红色、蓝色、黄色或绿色光谱区域中的主发射光谱之一。

这里描述的模型可以被理解为描述和/或定义通过光学系统对多个对象的图像形成。换句话说，该模型可以描述光学系统对荧光化合物发射的电磁辐射的影响。此外，该模型还可以包括关于发射电磁辐射的对象的信息。在本发明的上下文中，电磁辐射可以理解为波长在380nm和780nm之间，优选地在445nm和720nm之间的光。可以理解，对对象成像指的是对附接至对象上的荧光化合物发射的电磁辐射进行成像。

例如，在模型中，辐射电磁辐射的每个对象可以用描述具有指定半径R的均匀盘的盘函数来描述。因此，该盘函数可以取决于描述辐射对象的半径的参数R。此外，该模型还可以包括描述穿过光学系统的电磁辐射的衍射的函数。盘函数R的参数可以，例如是预定的。例如，可以在该方法的执行之前提供参数R。可替换地，也可以在本文描述的方法期间确定参数R。

优选地，该模型包括光学系统的点扩散函数。

该点扩散函数可以是，例如通过取决于描述光学系统中对象的模糊的参数σ的二维高斯函数来近似。描述模糊度的参数σ可以是，例如预定的。例如，可以在该方法的操作之前提供描述模糊度的参数σ。可替换地，也可以在本文描述的方法期间确定描述模糊度的参数σ。

优选地，数字图像被划分为域，每个域包含一个对象，其中该模型根据原始强度和权重描述所确定的强度，并且其中单独的权重与每对对象和域相关联。

换句话说，可以根据权重w_ij来描述模型，其中权重表示第j个珠子对第i个域Ω_i的影响。在本文中，第i个域可以指代其中测量第i个珠子的检测器的区域，该检测器确定用于获取数字图像的强度。因此，在数学意义上，Ω_i可以被理解为定义权重的函数的定义域。

优选地，该方法还包括以下步骤，优选在步骤b)之前：

d)确定权重；

优选地，该方法被执行经过多个循环，并且在多个循环之前执行步骤d)。

由于权重可能只需要确定一次，因此可以降低执行该方法所需的计算能力。

例如，权重可以通过数值积分来确定。为了确定权重w_ij，可以提供关于域Ω_i的信息以及关于第j个珠子的位置的信息。

优选地，模型仅通过权重来描述，其中对象与与权重相关联的域之间的距离低于预定的截止距离。

换句话说，可以仅通过考虑权重w_ij来近似方程，其中对象i和j之间的距离低于指定的截止距离。因此，可以假设第一对象的原始或确定的强度基本上仅受到第一对象附近的其他第二对象的影响。以这种方式，可以减少方程的复杂性，使得可以简化求解方程并且可以降低计算能力。

优选地，在步骤c)中，通过利用迭代算法确定近似解来确定方程的解。

例如，在第一迭代中，可以找到原始强度的第一近似解，其中第一近似解仅取决于描述珠子对其自身测量的影响的权重，即，其中第一近似解仅包括权重W_ii。在第二迭代中，所述第一近似解可以用于确定包括邻近影响效应的第二近似解。通常，第(n-1)个近似解可以用于确定第n个近似解。

以这种方式，可以找到由方程定义的逆问题族的解。

优选地，该方法进一步包括以下步骤，优选为步骤c)的子步骤：

f)如果超过预定的最大迭代次数，则停止步骤c)的迭代算法。

最大迭代次数可以达到20次迭代，优选地达到15次迭代，更优选地达到10次迭代。已经发现的是，这种最大迭代次数产生良好的结果。

优选地，该方法还包括以下步骤，优选在步骤c)期间：

g)确定补偿的强度值的误差；

其中，如果超过预定的最大迭代次数或者如果确定的误差低于指定阈值，则停止步骤c)的迭代算法。

以这种方式，可以确保以预定或期望的精确度确定补偿的强度值。

优选地，该模型取决于至少一个参数，其中，优选地，所述至少一个参数包括多个对象的半径和/或至少一个数字图像中的至少一个对象的模糊度。

例如，多个对象的半径可以对应于在本发明的上下文中描述的盘函数的参数R，并且模糊度可以对应于点扩散函数的高斯函数的参数σ。

优选地，该方法进一步包括以下步骤，优选在步骤a)和步骤b)之间：

e)通过处理至少一个数字图像确定至少一个参数。

优选地，该方法被执行多个循环，其中步骤e)针对多个循环被执行一次，优选地在多个循环之前。

因此，在每个循环中，可以确定强度，其中新核苷酸附接于每个对象。在执行步骤b)和步骤c)的循环操作之前可以确定参数。

优选地，该方法被执行多个循环，其中步骤b)和步骤c)在多个循环的每个循环中被执行。

因此，在每个循环中，可以确定强度，其中新核苷酸附接于每个对象。在用光学系统确定强度之前可以确定权重。由于权重可能不会及时变化，因此在步骤b)和步骤c)的循环操作期间可能没有必要重新确定权重。

优选地，至少一个数字图像包括多个数字图像，其中多个数字图像中的每个数字图像是用不同的过滤器获取的，该不同的过滤器优选地是不同的滤色器。此外，针对多个数字图像的每个数字图像，分开地执行步骤b)、步骤c)和步骤d)。

可以获取第一图像使得其包含第一频率范围中的图像信息，并且可以获取第二图像使得其包含第二频率范围中的图像信息。例如，第一图像可以用第一滤色器获取，第二图像可以用第二滤色器获取。

本发明的另一方面涉及一种用于在至少一个数字图像中的多个对象之间的邻近影响补偿的系统，其中至少一个数字图像包含关于多个对象的图像信息。此外，多个对象中的每一个接收到包括基因信息的至少一个分子，其中至少一个分子被配置为接收荧光化合物。更进一步，在由至少一个分子接收的荧光化合物的电磁辐射的发射期间，光学成像系统获取所述至少一个数字图像。该系统包括：

i)存储器单元，其包含描述由光学系统对对象成像的模型，该模型定义方程，该方程将已经穿过光学系统的电磁辐射的确定的强度与电磁辐射的原始强度相关联；

ii)强度确定单元，其被配置为针对多个对象从数字图像确定强度值；

iii)处理单元，其被配置为通过求解原始强度的方程，基于确定的强度值和模型来确定多个对象的补偿的强度值。

换句话说，该系统可以涉及一种用于，例如，DNA/RNA测序的评估系统。

应当理解的是，本文所公开的涉及方法的实施方式，也涉及包括适于执行相应方法步骤的方法的系统。因此，关于该方法给出的定义、解释、效果和、示例也描述对应的系统。

本发明的另一方面涉及一种计算机程序产品，其包括具有用于执行本文所述方法的步骤的计算机可执行指令的一个或多个计算机可读介质。

例如，描述对对象成像的模型、由模型定义的方程和/或用于求解方程的算法可以如下描述。

从焦平面中的点穿过光路的光可以以特有的方式在检测器上扩散。该特有的扩散可以表示为脉冲响应，或者更具体地，成像系统的点扩散函数(PSF)。因为可以假设叠加原理适用于线性光学系统(诸如光学显微镜)，所以可以通过对象空间(由其强度分布Q给出)与PSF的卷积来描述图像形成：

通常，PSF可以将光分布在超过对象的物理尺寸的区域上。因此，从两个邻近但物理上分离的对象发出的光可以在检测器平面中显着重叠。这种重叠被称为邻近影响。

这里，对象空间可以由诸如微珠子，即具有相似半径的非重叠球体组成。此外，可以假设均匀盘是用于将珠子的投影到构成焦平面的二维空间上的足够精确的模型。因此，盘函数

可以建模具有半径R的珠子的投影，其以原点为中心并归一化，即

因此，对象空间Q可以形式上写为在位置p_i处具有强度q_i的N个盘形珠子投影的总和：

类似地，可以假设二维高斯函数足够好地近似PSF并定义

和c＝1/2σ²。与盘函数一样，高斯的积分也可以归一化为1。将方程(3)和(4)代入方程(1)，可以得到图像的模型：

因为积分是线性运算，所以可以重写方程(5)以读取

因此，图像可以被视为通过它们的对应强度加权的N个单独珠子图像的总和。此外，积分仅取决于珠子位置，但与珠子强度无关。对于位置p处的孤立珠子，总和从方程(6)消失并且假设单位强度，方程(6)导致更简单的表达式

为了确定这个孤立的珠子对检测器的一定区域Ω上记录的强度有多大贡献，可以在区域Ω上对方程(7)进行积分。因此，区域Ω可以被理解为方程(7)中的积分的域。该积分可以根据权重函数来定义

权重函数可以被视为记录在样本域Ω内的第n个珠子的强度分数的模型。

为了从图像中提取第i个珠子的强度的估计，可以测量包含第i个珠子的小的域Ω_i的强度。该测量M_i可以被称为原始强度。然后可以通过q_if_i(Ω_i)给出第i个珠子对其自身测量的贡献。类似地，第j个珠子对相同测量的贡献可以是q_jf_j(Ω_i)。

比较方程(8)和(6)，可以发现第i个珠子的原始强度由总和确定

权重函数可以仅取决于珠子的相对定位，因为珠子可以被系在流动池上该相对定位可以保持恒定。因此，确定权重

w_ij＝f_j(Ω_i) (10)

一次可能就足够，并在每个测序循环中重复使用它们。

方程(9)和(10)描述了具有系数w_ij的非均匀线性系统。然而，当N＞300000个珠子时，直接求解线性系统代价高昂。由于权重函数可能快速衰减使得能够忽略来自远处珠子的影响，可以通过仅考虑其附近的珠子来确定第i个珠子的原始强度

φ_i＝{j：||p_i-p_j||＜d_max∧i≠j} (11)

，其中d_max是截止距离。因此，来自方程(9)的原始强度可近似地写为

能够通过

求解方程(12)的第i个珠子的强度。从方程(13)，可以导出迭代方案。

可以通过考虑误差的上限来找到可能在每次迭代中改进的该方案的修改，误差的上限可以由最后序列元素与其前任的差的绝对值确定：

即使ε_i ^(k-1)≈0，ε_i ^(k)也能够可能地大。算术平均值可能恰好位于q_i ^(k-1)和q_i ^(k)所界定的间隔的中间。因此，/>可能是对真实q_i的更好的估计，而不是最后两个序列元素，或者/>的数学地更差的估计。

因此，强度的更快和更健壮的近似方案可以是：

附图说明

现在参考附图描述一些示例性实施例。出于解释的目的，在不脱离本发明所要求保护的范围的情况下，阐述了各种具体细节。

图1示出了根据本发明的示例性实施例的方法。

图2示出了根据本发明的示例性实施例的系统。

图3示出了根据本发明的示例性实施例的邻近影响的效果和权重的定义。

图4A示出了根据本发明的示例性实施例的表明原始强度的合成图像和表明通过邻近影响补偿的原始强度的重建的图像。

图4B示出了根据本发明的示例性实施例的邻近影响补偿之前和之后的合成图像和重建的相对误差的重叠。

图5示出了根据本发明的实施例的在不同循环中获取的图像。

具体实施方式

图1示出了根据本发明的示例性实施例的一种在至少一个数字图像中的多个对象之间的邻近影响补偿的方法。根据该方法，所述至少一个数字图像包含关于多个对象的图像信息，其中多个对象中的每一个被配置为接收包括遗传信息的至少一个分子，并且其中所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物。此外，至少一个数字图像在由至少一个分子接收的荧光化合物的电磁辐射的发射期间由光学成像系统获取。该方法包括，优选地按以下顺序的以下步骤：

S1：提供描述由光学系统对对象成像的模型，该模型定义方程，该方程将已经穿过光学系统的电磁辐射的确定的强度与电磁辐射的原始强度相关联；

S2：基于至少一个数字图像确定多个对象的强度值；以及

S3：通过求解原始强度的方程，基于确定的强度值和模型确定多个对象的补偿的强度值。

根据示例性实施例，该模型包括描述光学系统对穿过光学系统的电磁辐射的影响的点扩散函数和/或描述辐射电磁辐射的对象的盘函数。根据示例性实施例，该模型和因此所述方程取决于至少一个参数，优选地取决于由光学系统引起的模糊度和/或多个对象中的每一个的半径。根据示例性实施例，通过处理至少一个数字图像来确定所述一个或多个参数，优选地在方法的开始处。

根据示例性实施例，由模型定义的方程包括描述对象j关于域i的影响的权重w_ij。因此，理论上，该域可以涉及光学系统的检测器的区域，其中检测到第i个对象的电磁辐射。根据示例性实施例，优选地在循环地确定强度之前，以数字方式确定权重。

根据另一示例性实施例，在方程中仅考虑这样的权重，其中对象j与域i(即，与第i域相关联的第i个对象)之间的距离低于截止距离。

根据另一示例性实施例，迭代地求解方程。换句话说，首先确定用于确定第1阶解的第0阶解。随后，使用第1阶解来确定第2阶解。通常，使用第(n-1)阶解来确定第n阶解。根据示例性实施例，如果达到预定的最大迭代次数和/或如果最后一次迭代的解的误差低于指定(例如，预定)阈值，则停止迭代算法。

图2示出了根据本发明的示例性实施例的一种用于在至少一个数字图像中的多个对象之间的邻近影响补偿的系统。所述至少一个数字图像包含关于多个对象的图像信息，其中所述多个对象中的每一个已经接收包括遗传信息的至少一个分子，并且其中所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物。此外，在由至少一个分子接收的荧光化合物的电磁辐射的发射期间，所述至少一个数字图像由光学成像系统获取。

该系统包括存储器单元201，其包含描述由光学系统对对象成像的模型，该模型定义方程，该方程将已经穿过光学系统的电磁辐射的确定的强度与电磁辐射的原始强度相关联。换句话说，描述对穿过光学系统的光的影响的模型。此外，该系统包括强度确定单元202，其被配置为用于针对多个对象从数字图像确定强度值。进一步，该系统包括处理单元203，其被配置为通过求解原始强度的方程，基于确定的强度值和模型来确定多个对象的补偿的强度值。处理单元203进一步可以被配置为用于执行在本发明的上下文中描述的其他方法步骤。

图3示出了邻近影响的效果。图3的部分301示例性地示出了多个对象的图像。各个对象，即珠子，都是强烈模糊的。除其它外，这是由于使得各个对象的辐射在检测器处重叠的成像系统的模糊效果。根据示例性实施例，该效果由图3的部分302和部分306中所示的权重w_ij描述。在部分302中，描绘了第i个对象305和第j个对象303。第i个对象305定义域Ω_i304，其对应于其中检测到第i个对象305的检测器的区域。由于光学系统的效果，在第i个域304中不仅接收和检测第i个对象的电磁辐射。相反，由于成像系统的效果，在第i个域304中还检测到第j个对象303的辐射。该效果由权重w_ij 306描述。理论上，对每对i和j存在权重w_ij。然而，根据本发明的示例性实施例，认识到通过假设第j个对象303仅对邻近307内的域具有效果，即使得第j个对象和第i个对象之间的距离低于截止距离，可以简化方程。

图4A示出了根据本发明的示例性实施例的示出原始强度的合成图像401和示出通过邻近影响补偿的原始强度的重建的图像402。在合成图像401中，各个对象的图像模糊，并且各个对象的强度可能重叠，部分是由于邻近影响。原始强度可以基于对应于合成图像401的图像来确定。为了说明的目的，已经基于合成图像401确定了原始强度。然而，例如，由于如本文所述的邻近影响，如此确定的原始强度可能是有缺陷的。

根据示例性实施例，通过处理从用邻近影响补偿方法的合成图像401确定的原始强度来获得重建图像402。换句话说，重建图像402包含补偿强度，该补偿的强度与对象发射的电磁辐射的原始强度紧密对应。

图4B示出了根据本发明示例性实施例的邻近影响补偿之前和之后的合成图像和重建的相对误差的重叠403、404。因此，重叠403示出了邻近影响补偿之前/无邻近影响补偿的重建对象的相对误差，该相对误差由重建对象的亮度指示。类似地，重叠404示出了邻近影响补偿之后的重建对象的相对误差。可以清楚地看到，在应用邻近影响补偿之后，重建对象的相对误差明显较小。因此，邻近补偿可以增加所确定的位置的精确度和/或对象的强度。

图5示出了在该方法的多个循环10-50中获取的图像11-14、21-24、31-34、41-44和51-54。该示例图不应被解释为限制在对应的循环中获取的图像量或循环量。如从图5中可以看出，在这个示例中，在每个循环10-50中，获取，即，获得、捕获等，四个图像11-14、21-24、31-34、41-44和51-54。特别地，一个循环10-50中的四个图像11-14、21-24、31-34、41-44和51-54中的每一个对应于光学成像系统的一个通道，即红色、绿色、黄色和蓝色。例如，每个第一图像可以用第一滤色器获取，每个第二图像可以用第二滤色器获取，每个第三图像可以用第三滤色器获取，每个第四图像可以用第四滤色器获取。通过由附接至不同对象(珠子)的DNA链接收的不同分子携带的荧光化合物发出不同的颜色。更具体地，每种不同的荧光化合物代表特定DNA碱基，即胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)之一。例如，荧光化合物与DNA碱基如下相关：T＝绿色；A＝黄色；C＝蓝色；和G＝红色。

在每个循环10-50中，第一图像11、21、31、41和51对应于四个通道T、A、C和G中的一个，例如，G。然后，第二图像12、22、32、42和52对应于第二个剩余的三个通道T，A，C中的一个，例如，C。然后，第三图像13、23、33、43和53对应于第三个剩余的两个通道T，A中的一个，例如，A。然后，第四图像14、24、34、44和54对应于第四个剩余通道的一个，例如，T。

已经如涉及DNA/RNA测序，描述了示例性实施例的前述方法步骤和系统。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，本发明不限于该技术领域。显然，本发明的解决方案可以应用于分析包括不同类型的对象的荧光图像的许多其他技术领域。也就是说，对象不必是珠子，也可以是任何种类的荧光发射对象。

由于本发明可以不脱离其范围或本质特征以若干形式加以实施，因此，应该理解，除非另有说明，否则上述实施例不受前述描述的任何细节的限制，而应当是在所附权利要求限定的范围内广泛地理解，因此，落入本发明范围内的所有变化和修改都应被包含在所附权利要求中。

此外，在权利要求中，词语“包括”不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。单个单元可以实现权利要求中记载的若干特征的功能。与属性或值相关的术语“基本上”、“约”和“近似”等特别地、分别地也定义确切地属性或确切地值。

Claims (13)

1.一种在至少一个数字图像中的多个对象之间进行邻近影响补偿的方法，

所述至少一个数字图像包含关于多个对象的图像信息，

所述多个对象中的每个对象被配置为接收包括遗传信息的至少一个分子，

所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物，

所述至少一个数字图像是在由所述至少一个分子接收的所述荧光化合物的电磁辐射的发射期间由光学成像系统获取的，

其中，

所述方法包括以下步骤，所述步骤是按以下顺序：

a)提供描述由所述光学成像系统对所述对象所执行的成像的模型，所述模型定义方程，所述方程将已经穿过所述光学成像系统的所述电磁辐射的确定的强度与所述电磁辐射的原始强度相关联；

b)基于所述至少一个数字图像，确定所述多个对象的强度值；以及

c)通过求解所述原始强度的所述方程，基于确定的强度值和所述模型，确定所述多个对象的补偿的强度值，

其中，所述数字图像被划分为域，每个域包含一个对象，

其中，所述模型根据原始强度和权重来描述所述确定的强度，

其中，将单独的权重与每对对象和域相关联，以及

其中，所述模型仅通过权重来被描述，其中，在所述对象与关联于所述权重的域之间的距离低于预定的截止距离。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述模型包括所述光学成像系统的点扩散函数。

3.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤，该步骤是在步骤b)之前：

d)确定所述权重；

其中，所述方法被执行经过多个循环，并且步骤d)是在所述多个循环之前被执行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，

在步骤c)中，通过用迭代算法确定近似解来确定所述方程的解。

5.根据权利要求4所述的方法，包括以下步骤，该步骤为步骤c)的子步骤：

f)如果超过迭代的预定最大次数，则停止步骤c)的所述迭代算法。

6.根据权利要求5所述的方法，还包括以下步骤，该步骤是在步骤c)期间：

g)确定所述补偿的强度值的误差；

其中，如果超过迭代的所述预定最大次数或者如果确定的误差低于指定阈值，则停止步骤c)的所述迭代算法。

7.根据权利要求1所述的方法，

其中，所述模型取决于至少一个参数；

其中，所述至少一个参数包括所述至少一个数字图像中的所述多个对象的半径和/或所述至少一个对象的模糊度。

8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括以下步骤，该步骤是在步骤a)和b)之间：

e)通过处理所述至少一个数字图像，确定所述至少一个参数。

9.根据权利要求8所述的方法，

其中，所述方法被执行多个循环；

其中，针对所述多个循环执行一次步骤e)，是在所述多个循环之前执行步骤e)。

10.根据权利要求1所述的方法，

其中，所述方法被执行多个循环；

其中，在所述多个循环的每个循环中执行步骤b)和c)。

11.根据权利要求3所述的方法，

其中，所述至少一个数字图像包括多个数字图像；

其中，用不同的过滤器获取所述多个数字图像中的每个数字图像，所述不同的过滤器为不同的滤色器；

其中，针对所述多个数字图像中的每个数字图像，单独地执行所述步骤b)、所述步骤c)和所述步骤d)。

12.一种用于在至少一个数字图像中的多个对象之间进行邻近影响补偿的系统，

所述至少一个数字图像包含关于多个对象的图像信息，

所述多个对象中的每个对象接收包括遗传信息的至少一个分子，

所述至少一个分子被配置为接收荧光化合物，

所述至少一个数字图像是在由所述至少一个分子接收的所述荧光化合物的电磁辐射的发射期间由光学成像系统获取的，

所述系统包括：

i)存储器单元，所述存储器单元包含描述由所述光学成像系统对所述对象所执行的成像的模型，所述模型定义方程，所述方程将已经穿过所述光学成像系统的所述电磁辐射的确定的强度与所述电磁辐射的原始强度相关联；

ii)强度确定单元，所述强度确定单元被配置为针对所述多个对象来从所述数字图像确定强度值；

iii)处理单元，所述处理单元被配置为：通过求解所述原始强度的所述方程，基于确定的强度值和所述模型，确定所述多个对象的补偿的强度值，

其中，所述数字图像被划分为域，每个域包含一个对象，

其中，所述模型根据原始强度和权重来描述所述确定的强度，

其中，将单独的权重与每对对象和域相关联，以及

其中，所述模型仅通过权重来被描述，其中，在所述对象与关联于所述权重的域之间的距离低于预定的截止距离。

13.一种计算机可读介质，所述计算机可读介质具有用于执行权利要求1至11中的一项所述的方法的步骤的计算机可执行指令。