CN109628326B - 一种促进菌丝球快速形成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进菌丝球快速形成的方法，属于环境微生物领域。本发明通过分阶段控制菌丝球培养过程中的转速条件，比目前传统方法控制恒定转速培养菌丝球，其不仅具有操作简单、成球率高、重复利用率高等优点，还有效地缩短菌丝球的成球时间，提高菌丝球的产量，增强菌丝球的吸附能力。本发明不仅为Talaromyces flavus S1菌丝球的扩大培养提供依据，还为其应用于污水处理提供了方法。

Description

一种促进菌丝球快速形成的方法
技术领域
本发明涉及一种促进菌丝球快速形成的方法，属于环境微生物领域。
背景技术
丝状真菌广泛存在于空气、土壤等各种物品上，其在农业、食品和环保等方面发挥着重要的作用，其可生产众多有经济价值的代谢产物，如抗生素，有机酸等，具有较大的工业和社会价值。
菌丝球是丝状真菌在发酵过程中自发形成的生物颗粒。当丝状真菌在营养物质充分、剪切力适当、溶解氧合适等条件下，萌发的丝状真菌孢子形成菌丝体，在剪切的作用下，彼此差绕，形成表面致密、内部疏松的菌丝聚集体。其因较大的表面积、网状结构，而有利于营养物质的传质和传氧。良好的沉降性能，独特的内部结构，安全无毒的同时，菌丝球也具有较强的抗冲击负荷能力。且菌丝球的生产成本低。因此，菌丝球是一种典型的环境友好型的生物材料。但是，在工业化应用中，菌丝球的快速培养是制约其广泛应用的主要瓶颈。
在摇瓶发酵中，丝状真菌的生长条件受人为调控，其菌丝体形态会随培养基组成、培养条件等的不同而出现不同形态，可能出现无分支的菌丝、有分支且结构复杂的菌丝、菌丝团块、菌丝球等形态，表现出不同大小、密度及表面结构，其直接影响着菌丝球的吸附能力。因此，控制好菌丝球的形态对菌丝球的投入应用至关重要。
菌丝球的成球时间一般为5天左右，其经过孢子发生凝聚后的孢子团，形成孢子晶核，再发芽长出菌丝，菌丝以晶核为中心向四周发射状生长，在外力作用下形成菌丝球。这时，一个成熟的菌丝球即完成。外力在菌丝球的形成过程中扮演着重要的角色。不同的转速对菌属的生长速率有着很大的影响，影响着菌丝形态。较低的转速，形成的菌丝球结构疏松，外表结构不光滑，菌丝球之间易形成菌丝团。较高的转速产生较大的剪切力，但形成的菌丝球虽然结构致密，但直径较小。因此，转速的合适与否，影响着菌丝球的成球形态。
传统的培养菌丝球方法为采用合适的温度、pH和转速，让其在菌属的自我生长过程中形成所需的菌丝球，一般需要5～7天左右，且成球率较低，难以得到快速获得的目的，影响菌丝球在实际生活中的应用。本发明采用改变转速方法(三步法)，让菌属在生长前期获得最大程度地快速生长，在生长期增加晶核的形成机率，最后高转速剪切菌丝球周围的多余菌毛，以快速获得成熟菌丝球。
发明内容
基于上述问题，本发明针对缩短菌丝球形成时间提出来一种更为高效的菌丝球培养方式，该方法以丝状真菌Talaromyces flavus S1(蓝状菌属)为例，通过调控培养过程中的转速，达到有效缩短菌丝球形成时间的目的。
本发明的第一个目的是提供一种促进菌丝球快速形成的方法，所述的方法是在真菌细胞培养过程中，分阶段控制转速；所述分阶段控制转速是前20～36h控制转速为180～220rpm，之后调整转速为140～160rpm维持24～48h，再控制转速为180～220rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述真菌细胞是蓝状菌属的孢子细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述真菌细胞是蓝状真菌(Talaromyces flavus)的孢子细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述真菌是Talaromyces flavus S1的孢子悬浮液；所述Talaromyces flavus S1已公开于2017年的论文《丝状真菌Talaromyces flavus S1在污泥中的成球特性及改善脱水性能的研究》中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)制备孢子悬液；
(2)将步骤(1)制备的孢子悬液进行分阶段控制转速培养；所述分阶段控制转速是在接种后20～28h内控制转速为180～220rpm，之后调整转速为140～160rpm维持24～48h，再控制转速为180～220rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：
(1)制备Talaromyces flavus S1的孢子悬浮液：将Talaromyces flavus S1用灭菌水重悬至孢子浓度为6.4×107～7.5×107个/L，得到Talaromyces flavus S1的孢子悬浮液；
(2)培养Talaromyces flavus S1菌丝球：按体积计，将步骤(1)的孢子悬液按8～12％的体积比接种到PDB培养基中，第0～24h控制转速为180～220rpm，之后调整转速为140～160rpm维持24～36h；再控制转速为180～220rpm，获得成熟菌丝球。
在一种实施方式中，所述孢子悬浮液按下述步骤制备：将保藏的Talaromycesflavus S1于28±2℃，pH为3的条件下培养24h，用灭菌水重悬至孢子浓度为6.4×107～7.5×107个/L。
在一种实施方式中，所述步骤(2)中的孢子悬浮液接种量为10％的体积比。
在一种实施方式中，所述步骤(2)中的PDB培养基的制备方法为：将土豆按200g/L去皮煮熟，与终浓度20g/L葡萄糖混合均匀，121℃，20min高压灭菌。
在一种实施方式中，所述步骤(2)的培养温度控制为26～30℃。
在一种实施方式中，所述步骤(2)中的成熟的菌丝球判断标准为：数量≥50％的颗粒状小球直径≥2mm。
本发明的第二个目的是提供一种应用上述任一方法制备的菌丝球。
本发明的第三个目的是提供一种废水的处理方法，所述方法是应用所述菌丝球降低废水中NO3 --N或NH4 +-N含量。
在本发明的一种实施方式中，所述菌丝球按5～15％的体积比投加至待处理的废水中。
在本发明的一种实施方式中，所述废水包括硝酸盐废水或氨氮废水。
本发明还要求保护所述方法在环境领域污水处理方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过分阶段控制转速使菌丝球能更快地去除菌丝球表面多余的菌丝，菌丝球表面光滑，外部结构致密，不易松散，提高了菌丝球的吸附效率。其不仅具有操作简单、成球率高等优点，还可有效地缩短菌丝球的成球时间，提高菌丝球的产量，菌丝球形成时间由5～6天缩短到3.5天，平均直径达2.2mm，成球率由70％提高至90％以上。应用本发明制备的菌丝球进行废水处理，结果显示，其对硝酸盐废水中的硝酸盐和COD的吸附能力分别为17.47％和24.92％，明显高于传统培养方法得到的菌丝球吸附能力，且经过5次循环利用后，其对硝酸盐的吸附能力仍保持为14.02％。将本发明制备的菌丝球进行高氨氮废水处理，结果表明：其对废水中的氨氮和COD去除效果依次为25.31％和29.41％，明显高于传统培养方式的12.47％和14.58％，且经过5次利用，对氨氮的处理效果仍达20％以上
附图说明
图1为不同转速条件的菌丝球的成球情况；
图2为实施例2中菌丝球的NO3 --N去除情况；
图3为实施例2中菌丝球的COD去除情况；
图4为实施例2中菌丝球的循环利用能力变化情况；
图5为实施例3中菌丝球的NH4 +-N去除情况；
图6为实施例3中菌丝球的COD去除情况；
图7为实施例3中菌丝球的循环利用能力变化情况。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实验案例对本发明进行进一步的说明。本领域的技术人员应当理解，下面所做的具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
具体实施方式中，硝酸盐废水主要指标为：NO3 --N 135.48mg/L，COD 1036.5mg/L，pH为7.9。氨氮废水主要指标为：NH4 +-N 1236.62mg/L，COD 5026.9mg/L，pH为4.3。
平均直径的测定方法：随机选择50个菌丝球，将其挨个排成一排，测出总直径，平均直径为总直径/50。
实施例1：
(1)制备Talaromyces flavus S1的菌悬液：取保藏在斜面培养基上的Talaromyces flavus S1，接种于装有玻璃珠的灭菌水中，放于摇床中于28±2℃振荡培养，进行血球计数，得到浓度为6.7×107个/L的Talaromyces flavus S1的孢子悬浮液。
(2)培养Talaromyces flavus S1菌丝球：取适量孢子悬浮液，按10％的体积比分别接种到12个PDB培养基中，均分为四组，分别为空白组，对照组1，对照组2和试验组1。每组有三个摇瓶视为三个平行。将四组分别置于四个摇床中培养。其中空白组转速为0，对照组1转速为150rpm，对照组2转速为200rpm，试验组1的转速设为200rpm，于28℃培养1天(24h)。
(3)将空白组、对照组1和对照组2摇床转速保持原样，试验组1摇床的转速调为150rpm，于28℃摇床培养1.5天(36h)；
(4)继续保持空白组、对照组1和对照组2的摇床转速不变，试验组1摇床的转速调为200rpm，于28℃摇床培养1～2天(24～48h)；
(5)收获成熟的菌丝球，拍照对比(图1)，测其平均直径(表1)；当转速为0时，形成的小颗粒为0.2mm。当转速为150rpm时，菌丝球的平均直径为2.0mm。当转速为200rpm时，菌丝球的平均直径为1.4mm。当试验组进行转速条件改变时，菌丝球的平均直径明显增大，为2.2mm。
表1
Figure BDA0001939056480000041
图1为不同转速条件下的菌丝球成球情况。当摇床转速为0时，其难以形成菌丝球(图1a)。当转速为150rpm时，在第5天形成菌丝球，菌丝球的表面带有绒毛，成球率约为70％左右(图1b)。当摇床转速为200rpm时，菌球在第4.5天形成菌丝球，成球率约为85％左右，菌丝球表面光滑(图1c)。当转速为200rpm-150rpm-200rpm时，在第3.5天即可形成菌丝球，且菌丝球表面光滑，成球率约为90％(图1d)。
实施例2
(1)取10ml实施例1中各组制备的菌丝球，将其按10％的体积比投加到NO3 —N135.48mg/L、COD 1036.5mg/L、pH 7.9的100ml硝酸盐废水(表2)中，观察菌丝球对硝酸盐废水的吸附能力。每隔6h测一次COD和NO3 --N的去除率，结果如图2，3所示。
表2
Figure BDA0001939056480000051
图2为实施例1制备的菌丝球对NO3 --N的去除情况。转速为0的菌丝球(空白组)，其NO3 --N去除率为2.04％。当转速为150rpm时(对照组1)，其形成的菌丝球NO3 --N去除率为8.15％。当转速为200rpm时(对照组2)，其形成的菌丝球NO3 --N去除率为12.04％。但在培养过程中，将摇床转速依次调为200rpm-150rpm-200rpm(试验组1)，其菌丝球对NO3 --N的去除率达到17.47％，明显高于传统培养方法得到的菌丝球(对照组1和对照组2)。
图3为实施例1制备的菌丝球对COD的去除情况。当转速为0时(空白组)，其COD的去除率仅为4.74％。由转速为150rpm形成的菌丝球(对照组1)，其COD去除率为12.46％，同时，由转速为200rpm形成的菌丝球(对照组2)，其COD去除率达到13.23％，与转速在150rpm形成的COD去除率相当。但当摇床转速依次调整为200rpm-150rpm-200rpm(试验组1)，其COD的吸附能力有着明显的提升，其COD去除率达到了24.92％。
(2)取实施例1中(1)使用后的菌丝球，用磷酸盐缓冲液(pH为7)进行冲洗，冲洗3～4次，以去除菌丝球中多余的培养液。将其按10％的体积比投入到100mL硝酸盐废水中，以2天为一周期，实验一周期结束后，循环重复清洗——投加步骤5次，测其最终的NO3 --N去除率。
图4为菌丝球在硝酸盐废水中的循环利用情况。当转速为0时(空白组)，其形成的菌丝球NO3 --N去除能力保持不变，基本为2.04％。在转速为150rpm条件下(对照组1)，形成的菌丝球NO3 --N去除能力有所减少，由最初的8.15％下降到6.58％。在转速为200rpm条件下(对照组2)，其形成的菌丝球NO3 --N去除率由12.04％降为9.78％，而经过转速200rpm-150rpm-200rpm调整后形成的菌丝球(试验组1)，其经过五次循环利用后，NO3 --N去除率为14.02％，仍高于一直维持150rpm和200rpm形成的菌丝球的去除能力。
综合上述，本发明采用分阶段控制转速(试验组1)制备的菌丝球，在硝酸盐废水中对NO3 --N和COD的去除率明显高于传统方法培养(对照组1和对照组2)得到的菌丝球，且经过5次循环利用后，其仍保持较高的可利用能力。
实施例3
(1)取10mL实施例1各组制备获得的菌丝球，将其10％的体积比投加到100mL氨氮废水(表3)中，观察菌丝球对硝酸盐废水的吸附能力。每隔6h测一次COD和NH4 +-N的去除率(图5，6)。
表3
Figure BDA0001939056480000061
如图5所示，当转速为0时(空白组)，其形成的菌丝球对氨氮废水中的氨氮去除率仅为4.26％，可忽略不计。当转速为150rpm时(对照组1)，其形成的菌丝球的氨氮去除效果达到了12.47％；当转速为200rpm时(对照组2)，其形成的菌丝球的氨氮去除率为17.58％，比150rpm形成的菌丝球吸附能力强。而在培养过程中改变转速条件，其形成的菌丝球对氨氮的去除效果明显强于保持同一转速条件下形成的菌丝球。经过200rpm-150rpm-200rpm调节形成的菌丝球(试验组1)，其对氨氮的去除率为25.31％，明显好于传统培养方法条件下得到的菌丝球。
如图6所示，当转速为0时(空白组)，其菌丝球的COD去除率仅为5.26％，在转速为150rpm条件下(对照组1)，其形成的菌丝球COD去除率为14.58％，与此同时，在200rpm转速条件下的菌丝球(对照组2)，其COD去除率为14.29％。采用三步法形成的菌丝球(试验组1)，其COD去除效果达到明显的提升，COD去除率为29.41％。
(2)取实施例2(1)各组使用后的菌丝球，用磷酸盐缓冲液(pH为7)冲洗3～4次，以去除菌丝球中多余的培养液。将其按10％的体积比投入到100mL氨氮废水中，以2天为一周期，实验一周期结束后，循环重复清洗——投加步骤5次，测其最终的NH4 +-N去除率。
如图7所示，菌丝球的循环利用能力。当转速为0时(空白组)，其菌丝球经过5次循环后，其对氨氮的去除效果从4.26％变成2.08％。在转速为150rpm条件下(对照组1)，形成的菌丝球，其菌丝球的去除氨氮能力略有下降，从12.47％下降至9.46％。而较200rpm转速下形成的菌丝球(对照组2)，其去除效果由17.58％下降至12.56％。相比传统培养方法得到的菌丝球，改变三步法培养的菌丝球(试验组1)，其经过5次循环利用后，氨氮去除效果仍保持在20.00％以上，明显高于对照组。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种促进菌丝球快速形成的方法，其特征在于，在真菌细胞培养过程中，分阶段控制转速；所述分阶段控制转速是前20～36h控制转速为180～220rpm，之后调整转速为140～160rpm维持24～48h，再控制转速为180～220rpm；
所述真菌细胞是蓝状真菌(Talaromycesflavus)S1的孢子细胞；
所述真菌细胞培养过程为：
(1)制备孢子悬液：将TalaromycesflavusS1用灭菌水重悬至孢子浓度为6.4×107～7.5×107个/L，得到TalaromycesflavusS1的孢子悬浮液；
(2)培养TalaromycesflavusS1菌丝球：按体积计，将步骤(1)的孢子悬液按8～12％的体积比接种到PDB培养基中，培养温度控制为26～30℃，进行分阶段控制转速，获得成熟菌丝球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：
(1)制备TalaromycesflavusS1的孢子悬浮液：将TalaromycesflavusS1用灭菌水重悬至孢子浓度为6.4×107～7.5×107个/L，得到TalaromycesflavusS1的孢子悬浮液；
(2)培养TalaromycesflavusS1菌丝球：按体积计，将步骤(1)的孢子悬液按8～12％的体积比接种到PDB培养基中，前20～24h控制转速为180～220rpm，之后控制转速为140～160rpm维持32～36h；再控制转速为180～220rpm，获得成熟菌丝球。
3.应用权利要求1～2任一所述方法制备的菌丝球。
4.权利要求3所述的菌丝球或权利要求1～2任一所述的方法在环境领域污水处理方面的应用。
5.一种废水的处理方法，其特征在于，将权利要求3所述的菌丝球按5～15％的比例投加至待处理的废水中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述废水包括硝酸盐废水或氨氮废水。
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