CN109609573B - 一种提高木质纤维素的酶水解效率的方法 - Google Patents

一种提高木质纤维素的酶水解效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高木质纤维素的酶水解效率的方法。本发明提供了一种提高纤维素酶对底物的水解效率的方法：对底物进行预处理。本发明还提供了一种以底物为原料生产还原糖的方法，包括如下步骤：对底物进行预处理，然后采用纤维素酶进行水解。预处理为采用12C6+离子束进行辐照处理。底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。本发明采用重离子(12C6+离子束)进行辐照预处理，提高了纤维素酶对底物的可及度从而提高生物质材料的水解产率。本发明对于木质纤维素的利用具有重大的应用价值，对于以木质纤维素为原料制备相关产品具有重大的推广价值。

Description

一种提高木质纤维素的酶水解效率的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高木质纤维素的酶水解效率的方法，更具体涉及一种通过物理方式的预处理提高木质纤维素的酶水解效率的方法。
背景技术
木质纤维素原料来源广泛，是储量丰富的可再生资源。近年来，利用木质纤维素制备燃料乙醇新能源备受国内外专家学者的关注。发展木质纤维素生产燃料乙醇的能源技术，对于降低成本和保护环境是一个“双赢”的模式，与当今世界的低碳环保主题一致，有利于人类社会的可持续发展。
天然木质纤维素材料的结构与性质非常复杂，半纤维素通过氢键与纤维素相连，其侧链通过阿魏酸或醛酸与木质素相连，半纤维素与木质素将纤维素包裹起来，形成了难以被微生物所降解的聚合体。预处理过程就是促进木质纤维素的天然高分子结构分解成为易被微生物利用的结构。利用预处理方法可以破坏木质素、半纤维素对纤维素的包裹，去除木质素，降解半纤维素，改变纤维素的结晶结构，提高纤维素酶的可及度和木质纤维素的疏松性，从而形成易损结构，促进酶与底物的接触，提高后续酶解的效率和糖得率。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高木质纤维素的酶水解效率的方法。
本发明提供了一种提高纤维素酶对底物的水解效率的方法，包括如下步骤：对底物进行预处理；所述预处理为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。
本发明还提供了一种对底物的预处理方法，为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。
本发明还提供了一种以底物为原料生产还原糖的方法，包括如下步骤：对底物进行预处理；所述预处理为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。
本发明还提供了一种以底物为原料生产还原糖的方法，包括如下步骤：对底物进行预处理，然后采用纤维素酶进行水解；所述预处理为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。纤维素酶与预处理产物的配比可为2-3IU纤维素酶：1g预处理产物，具体可为2.4IU纤维素酶：1g预处理产物。采用纤维素酶进行水解的条件可为：50℃、150rpm振荡孵育6-36小时。所述方法中，在“对木质纤维素进行预处理”和“采用纤维素酶进行水解”之间可包括如下步骤：将预处的产物用水浸泡。所述浸泡具体可为：2℃浸泡24小时。
以上任一所述采用12C6+离子束进行辐照处理，辐照剂量为300Gy-900Gy，具体可为300Gy-600Gy或600Gy-900Gy或550Gy-650Gy，更具体可为300Gy或600Gy或900Gy，优选为600Gy。
以上任一所述采用12C6+离子束进行辐照处理，剂量率为70Gy/min。
以上任一所述采用12C6+离子束进行辐照处理，辐照能量为80MeV。
以上任一所述采用12C6+离子束进行辐照处理，，传能线密度为50keV/μm。
本发明还保护一种用于制备还原糖的系统，包括12C6+离子束发生装置、底物和纤维素酶；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。
本发明还保护一种用于制备还原糖的系统，包括12C6+离子束发生装置、底物和产纤维素酶的微生物；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。
本发明还保护一种用于制备还原糖的系统，包括12C6+离子束发生装置、底物、产纤维素酶的微生物、种子培养基和发酵培养基；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料。
本发明还保护一种用于通过发酵产纤维素酶的微生物制备纤维素酶的培养基组合，包括种子培养基和发酵培养基。
以上任一所述纤维素酶具体可为如下方法制备的纤维素酶：将产纤维素酶的微生物依次进行种子培养和发酵培养。所述种子培养采用的培养基为种子培养基。所述发酵培养采用的培养基为发酵培养基。所述种子培养的条件可为：30℃、200rpm振荡培养20h。所述发酵培养的条件可为：30℃、200rpm振荡培养240h。
以上任一所述纤维素酶更具体可为如下方法制备的纤维素酶：
(1)用生理盐水悬浮产纤维素酶的微生物，得到1×106cfu/ml的菌液；
(2)将菌液接种至种子培养基(每1mL菌液配比25mL种子培养基)，30℃、200rpm振荡培养20h，得到种子液；
(3)取种子液，接种至发酵培养基(每1mL种子液配比20mL发酵培养基)，30℃、200rpm振荡培养240h；
(4)取整个培养体系，过滤并收集滤液；
(5)取滤液，离心收集上清液。
以上任一所述产纤维素酶的微生物具体可为绿色木霉突变株My。
以上任一所述含有木质纤维素的生物材料为秸秆，例如高粱秸秆。
以上任一所述种子培养基的原料包括：微晶纤维素、麸皮和玉米浆。
每1000ml种子培养基中，微晶纤维素的加入量为10g-50g，麸皮的加入量为5g-20g，玉米浆的加入量为10g-30g。
每1000ml种子培养基中，微晶纤维素的加入量为20g，麸皮的加入量为10g，玉米浆的加入量为17g。
种子培养基的原料包括：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4或其水合物、CaCl2、Tween80、FeSO4或其水合物、MnSO4或其水合物、ZnSO4或其水合物、CoCl2或其水合物。种子培养基的原料由如下物质组成：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4或其水合物、CaCl2、Tween80、FeSO4或其水合物、MnSO4或其水合物、ZnSO4或其水合物、CoCl2或其水合物、水。
种子培养基的原料包括：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2、Tween80、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O。种子培养基的原料由如下物质组成：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2、Tween80、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、水。每1000ml种子培养基中，微晶纤维素的加入量为20g、麸皮的加入量为10g、玉米浆的加入量为17g、(NH4)2SO4的加入量为1.4g、KH2PO4的加入量为2g、尿素的加入量为0.3g、MgSO4·7H2O的加入量为0.3g、CaCl2的加入量为0.3g、Tween80的加入量为2mL、FeSO4·7H2O的加入量为0.005g、MnSO4·H2O的加入量为0.0016g、ZnSO4·7H2O的加入量为0.0014g、CoCl2·6H2O的加入量为0.002g。
种子培养基的pH具体可为4.7-4.9。
以上任一所述发酵培养基的原料包括：微晶纤维素、麸皮和玉米浆。
每1000ml发酵培养基中，微晶纤维素的加入量为10g-50g，麸皮的加入量为5g-20g，玉米浆的加入量为10g-30g。
每1000ml发酵培养基中，微晶纤维素的加入量为20g，麸皮的加入量为10g，玉米浆的加入量为17g。
发酵培养基的原料包括：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4或其水合物、CaCl2、Tween80。发酵培养基的原料由如下物质组成：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4或其水合物、CaCl2、Tween80、水。
发酵培养基的原料包括：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2、Tween80。发酵培养基的原料由如下物质组成：微晶纤维素、麸皮、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2、Tween80、水。每1000ml发酵培养基中，微晶纤维素的加入量为20g、麸皮的加入量为10g、玉米浆的加入量为17g、(NH4)2SO4的加入量为1.4g、KH2PO4的加入量为2g、尿素的加入量为0.3g、MgSO4·7H2O的加入量为0.3g、CaCl2的加入量为0.3g、Tween80的加入量为2mL。
发酵培养基的pH具体可为4.7-4.9。
本发明还保护以上任一所述方法在制备还原糖中的应用。
本发明还保护以上任一所述系统在制备还原糖中的应用。
本发明还保护以上任一所述培养基组合在制备还原糖中的应用。
本发明还保护以上任一所述方法在制备乙醇中的应用。
本发明还保护以上任一所述系统在制备乙醇中的应用。
本发明还保护以上任一所述培养基组合在制备乙醇中的应用。
本发明中：首次采用重离子(12C6+离子束)辐照对木质纤维素生物质材料进行改性，并探讨了辐照预处理木质纤维素的机理；发现适当辐照剂量的重离子束可以显著提高秸秆的生物转化效率和还原糖的产量；通过AFM可视化追踪了纤维素酶对不同剂量辐照处理的秸秆的酶水解转化过程，并在600Gy预处理下，秸秆水解6小时后，首次观察到秸秆表面成对分布的突起物。本发明的核心方案：借助重离子对秸秆进行辐照预处理，提高了纤维素酶对底物的可及度从而提高生物质材料的水解产率。
12C6+离子束辐照处理使纤维素Iα中氢键断裂逐步形成Iβ。秸秆多糖表面的超微结构的破坏是辐照处理提高水解产率的主要原因。600Gy预处理下，秸秆酶解36h得到7.23mg/mL的还原糖，与未处理对照相比，酶解水解产率提高46.7％。然而,高剂量的重离子辐照(≥900Gy)可以将纤维素Iα完全变成Iβ，反而不利于酶的水解。
12C6+离子束辐照处理可作为一种木质纤维素前处理的有效手段，这填补了一项在离子束辐照前处理生物质材料提高酶解水解产率领域的空白。本发明对于木质纤维素的利用具有重大的应用价值，对于以木质纤维素为原料制备相关产品具有重大的推广价值。
附图说明
图1为实施例1中完成步骤二的各处理组和对照组的样本的XRD衍射图。
图2为实施例1中完成步骤二的各处理组和对照组的样本的FTIR光谱图。
图3为纤维素同质异形体(α→β)的转化模型。
图4为实施例3的步骤二中还原糖浓度的结果。
图5为实施例3的步骤二中水解产率的结果。
图6为秸秆的表面形态(对照组)。
图7为秸秆的表面形态(300Gy处理组)。
图8为秸秆的表面形态(600Gy处理组)。
图9为秸秆的表面形态(900Gy处理组)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。微晶纤维素(MCC)：湖州市菱湖新望化学有限公司，批号20170611。麸皮：甘肃省兰州市城关区粮油市场。玉米浆：天津市利发隆化工科技有限公司，批号2018030601。
实验数据用SPSS21.0进行单因素方差分析，并用Origin8.0进行图表处理，每个处理组设置三个平行处理，对照组设置三个平行处理，结果用平均值±标准误表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
绿色木霉突变株My记载于如下文献：Addition of aluminum oxidemicroparticles to Trichoderma viride My preculture enhances cellulaseproduction and influences fungal morphology，Eng.Life Sci.2018,0,1–6。在文献中的名称为T.viride My,T.viride My为T.viride strain GSTCC 62010(NM01)进行12C6+离子辐射得到的突变株。T.viride即Trichoderma viride的缩写。
实施例1、对秸秆进行重离子辐照预处理
一、秸秆粉的制备
种植于中国科学院近代物理研究所武威现代产业园的甜高粱，待其成熟后刈割收获秸秆，105℃烘箱烘干至恒质量(约48h)，粉碎后过60目筛。
二、对秸秆粉进行重离子辐照预处理
取步骤一制备的秸秆粉，平铺于直径35mm的辐照皿里，采用12C6+离子束进行辐照处理。辐照能量为80MeV，剂量率为70Gy/min，传能线密度(LET)为50keV/μm。设置三个处理组：300Gy处理组的辐照剂量设置为300Gy；600Gy处理组的辐照剂量设置为600Gy；900Gy处理组的辐照剂量设置为900Gy。
设置不进行辐照处理的对照组(0Gy组)，又称辐照前样本。
三、X射线粉末衍射(XRD)表征重离子辐照后的秸秆
结晶结构作为纤维素的结构特性，其结晶度在生物转化过程中发挥着主要作用，而且是和水解转化最相关的参数，因此对预处理后木质纤维素结晶度的研究极有必要。XRD的原理是X射线沿着结晶平面的衍射，衍射图像可以测得结晶度，XRD常用于评价纤维素的结晶度等理化指标。具体操作：XRD衍射扫描角度2θ＝10到40°，以每3s 0.05°间隔扫描，得到的XRD的衍射图案基于“Segal法”根据晶体强度的高度比值计算结晶度指数(CrI)，CrI由除去底物背景信号结晶峰强度(I200-IAM)和总强度(I200)计算，d(晶格距离)使用布拉格公式计算，晶粒大小使用Scherrer公式计算。
CrI(％)＝(I200-IAM)×100/I200；
nλ＝2d sinθ；
L＝0.9λ(H cosθ)；
n是整数，本次实验n＝1；λ是入射波长度的波长；d是原子晶格中平面之间的间距，θ是入射光线与散射面之间的夹角；L是垂直于斜面的晶体大小；H是半峰的弧度的全宽度。
完成步骤二的各处理组和对照组的样本的XRD衍射图见图1，样本的结晶度指数、晶格距离和晶粒大小见表1。XRD衍射图最强峰均出现在2Theta＝22°附近。结晶度越高其被酶水解的能力越强，与辐照前样本相比，各处理组样本的结晶指数(CrI)均升高，其中600Gy处理组样本的结晶指数最高。与辐照前样本相比，各处理组样本的晶格间距(d)和晶粒大小(L)无显著性变化。结晶指数增加的原因可能是重离子束破坏无定形区以及移除了木质素、半纤维素等物质，使得结晶指数增加，因为非结晶区不仅仅存在于木质纤维素中的纤维素中，同时也存在于木质纤维素的木质素，半纤维素以及果胶中，而预处理正是为了处理木质纤维素中的木质素以及半纤维素，从而增加酶对木质素的可及性，提高酶水解产率。
表1XRD测量的结晶指数(CrI)、晶格间距(d)以及晶粒大小(L)
2Theta CrI(％) d(nm) L(nm)
0Gy组 22.03 51.39±1.34 4.10±0.06 3.60±0.82
300Gy处理组 22.07 52.65±3.85 4.05±0.01 3.14±0.09
600Gy处理组 22.14 56.66±2.63* 4.04±0.01 3.15±0.09
900Gy处理组 22.09 52.73±0.89 4.05±0.01 3.02±0.11
注：同一列中的*表示和辐照前样本相比有显著差异。
四、傅里叶变换红外光谱(FTIR)表征重离子辐照后的秸秆
对于晶体纤维素有四种不同的模型，包括纤维素I、纤维素II、纤维素III和纤维素VI。纤维素I是天然纤维素的形态，包括纤维素Iα和纤维素Iβ两种结晶形式，在木质纤维素中主要以纤维素Iβ的形式存在，并且处于亚稳态的纤维素Iα比处于稳态的纤维素Iβ有更高的结晶度。纤维素II、纤维素III和纤维素VI均是对天然木质素经过各种不同的处理所得到的，纤维素II比纤维素I热力学性质更加稳定。
FTIR的原理是与红外光相关的化学键的震动，IR的吸收光谱可以反映出功能团和分子内的化学键的连接信息。FTIR操作简单，不仅可以反应结晶区和无定形区，而且能反应出纤维素晶体的类型，因此FTIR可作为纤维素结构研究的有效手段。
在FTIR光谱图中，纤维素Iα和纤维素Iβ分别会在3231cm-1和3429cm-1附近出峰，根据纤维素II、III和VI在不同的位置表现出特征峰，亦或是同一位置峰的强弱和峰形变化实现对各种纤维素的晶体类型的区分，Nelson等人在FTIR图中1429、1163和893cm-1的出峰位置和峰形及峰强度对不同的晶型纤维素做了详细的研究：1429cm-1是CH2的剪切振动峰，纤维素Ⅰ在1429cm-1处出峰，纤维素Ⅱ在1420cm-1处出峰且峰较弱，纤维素III的出峰位置转移到了1425cm-1且峰强度中等；1163cm-1是C-O的伸缩振动或O-H或C-OH的弯曲振动峰，纤维素Ⅰ和纤维素III的出峰位置为1163cm-1，纤维素Ⅱ的峰移动至1156cm-1，这几种峰强度基本不变；893cm-1是β异头物或β-连接的葡萄糖聚合物的特征峰，在纤维素I中897cm-1处有弱且宽的峰，纤维素II中893cm-1处有强且尖的峰，纤维素III中897cm-1处会有稍弱的峰。
具体操作：取完成步骤二的样本，与光谱级纯的KBr(样品/KBr＝1/100，质量比)完全混合，制作KBr压片，并在红外光谱仪(Bruker Tensor 27,德国)下以4cm-1的分辨率记录4000-400cm-1之间的红外光谱，每个样品16次扫描，得到FTIR光谱图。
完成步骤二的各处理组和对照组的样本的FTIR光谱图见图2。利用OPUS 7.2的单峰检索函数分别获得了3429、3231、1429、1163和893cm-1附近的红外吸收峰，见表2。在3435、3295、1435、1164和898cm-1处的出峰位置表明，对照组的样本是纤维素Ⅰ的同质异形体(α和β)的混合物。在3467、3293、1420、1164和898cm–1出峰位置表明,300Gy处理组的样本属于纤维素Ⅰ同质异形体(α和β)的混合物。在3448、3274、1406、1165和897cm–1的条带表明,600Gy处理组的样本同样是纤维素Ⅰ同质异形体(α和β)的混合物。在3423、1430、1164和898cm–1处的出峰位置表明，900Gy处理组的样本中仅有纯的纤维素Iβ。
天然的木质纤维素中纤维素Iβ是占主导地位，Iα是纤维素三斜晶胞，其包含一条链和Iβ。同质异形体(α和β)的晶体结构的差异主要是由氢键模型的不同造成。FTIR光谱图表明，随着重离子辐照预处理中辐照剂量的增加，纤维素同质异形体由Iα转化为Iβ，在900Gy辐照剂量时完全生成稳定的Iβ，这可能是由于在重离子辐照剂量增大的过程中，Iα逐渐被破坏。纤维素同质异形体(α→β)的转化模型见图3，结构式中的箭头表示重离子辐照预处理过程中断裂的氢键。天然木质纤维素中同质异形体Iα和Iβ的共存状态将决定天然纤维素的脆弱程度，这是因为同质异形体中Iα比Iβ更加脆弱，更容易受到酶和微生物攻击。
表2完成步骤二的各处理组和对照组的样本在特征峰位置的出峰情况
Figure BDA0001963324180000071
注：N表示在该特征峰位置未出峰。
实施例2、纤维素酶的制备的方法的优化
一、培养方法A
种子培养基A(pH5.7-5.8)：50g蔗糖、5g蛋白胨、0.3g MgSO4·7H2O、4g(NH4)2SO4、2gKH2PO4、0.3g CaCl2·2H2O、0.005g FeSO4·7H2O、0.0016g MnSO4·H2O、0.0014g ZnSO4·7H2O、0.002g CoCl2·6H2O，蒸馏水定容至1000mL。
发酵培养基A(pH5.7-5.8)：50g蔗糖、3g蛋白胨、0.4g MgSO4·7H2O、5g(NH4)2SO4、2gKH2PO4，蒸馏水定容至1000mL。
1、用生理盐水悬浮绿色木霉突变株My，得到1×106cfu/ml的菌液。
2、取步骤1得到的菌液，接种至种子培养基A(每1mL菌液配比25mL种子培养基)，30℃、200rpm振荡培养16h，得到种子液。
3、取步骤2得到的种子液，接种至发酵培养基A(每1mL种子液配比20mL发酵培养基)，30℃、200rpm振荡培养168h。
4、完成步骤3后，取整个培养体系，用6层纱布过滤并收集滤液。
5、取步骤4得到的滤液，4℃、4000rpm离心10min，收集上清液。
6、取步骤5得到的上清液，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，即为无菌纤维素酶液A。
二、培养方法B
种子培养基B(pH4.7-4.9)：20g微晶纤维素(MCC)、10g麸皮、17g玉米浆、1.4g(NH4)2SO4、2g KH2PO4、0.3g尿素(Urea)、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2mL Tween80、0.005gFeSO4·7H2O、0.0016g MnSO4·H2O、0.0014g ZnSO4·7H2O、0.002g CoCl2·6H2O，蒸馏水定容至1000mL。
发酵培养基B(pH4.7-4.9)：20g微晶纤维素(MCC)、10g麸皮、17g玉米浆、1.4g(NH4)2SO4、2g KH2PO4、0.3g尿素(Urea)、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2mL Tween80，蒸馏水定容至1000mL。
1、用生理盐水悬浮绿色木霉突变株My，得到1×106cfu/ml的菌液。
2、取步骤1得到的菌液，接种至种子培养基B(每1mL菌液配比25mL种子培养基)，30℃、200rpm振荡培养20h，得到种子液。
3、取步骤2得到的种子液，接种至发酵培养基B(每1mL种子液配比20mL发酵培养基)，30℃、200rpm振荡培养240h。
4、完成步骤3后，取整个培养体系，用6层纱布过滤并收集滤液。
5、取步骤4得到的滤液，4℃、4000rpm离心10min，收集上清液。
6、取步骤5得到的上清液，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，即为无菌纤维素酶液B。
三、其他酶液的制备
种子培养基D1(pH4.7-4.9)：8g微晶纤维素(MCC)、3g麸皮、8g玉米浆、1.4g(NH4)2SO4、2g KH2PO4、0.3g尿素(Urea)、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2mL Tween80、0.005gFeSO4·7H2O、0.0016g MnSO4·H2O、0.0014g ZnSO4·7H2O、0.002g CoCl2·6H2O，蒸馏水定容至1000mL。
发酵培养基D1(pH4.7-4.9)：8g微晶纤维素(MCC)、3g麸皮、8g玉米浆、1.4g(NH4)2SO4、2g KH2PO4、0.3g尿素(Urea)、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2mL Tween80，蒸馏水定容至1000mL。
种子培养基D2(pH4.7-4.9)：55g微晶纤维素(MCC)、22g麸皮、35g玉米浆、1.4g(NH4)2SO4、2g KH2PO4、0.3g尿素(Urea)、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2mL Tween80、0.005g FeSO4·7H2O、0.0016g MnSO4·H2O、0.0014g ZnSO4·7H2O、0.002g CoCl2·6H2O，蒸馏水定容至1000mL。
发酵培养基D2(pH4.7-4.9)：55g微晶纤维素(MCC)、22g麸皮、35g玉米浆、1.4g(NH4)2SO4、2g KH2PO4、0.3g尿素(Urea)、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2mL Tween80，蒸馏水定容至1000mL。
用种子培养基D1代替种子培养基B并且用发酵培养基D1代替发酵培养基B，其他同步骤二，得到无菌纤维素酶液D1。
用种子培养基D2代替种子培养基B并且用发酵培养基D2代替发酵培养基B，其他同步骤二，得到无菌纤维素酶液D2。
四、酶活测定方法
式1为OD540nm值和还原糖量的线性回归线方程。
y＝3.4485x-0.1311(式1)
式1中，y为还原糖的质量(mg)，x是OD540nm值，R2＝0.998。
式2为纤维素酶酶活计算公式。纤维素酶酶活包括滤纸酶酶活(FPA)、纤维素内切酶(EG)酶活、β-葡萄糖苷酶(BGL)酶活、纤维素外切酶(CBH)酶活。酶活力单位定义：以每毫升酶制剂在每分钟内水解反应体系中的底物生成每微克葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位(U)。
Figure BDA0001963324180000091
式2中，Δy为还原糖的生成量(mg)，df为稀释倍数，t为酶和底物作用时间(min)，v为待测液体积(mL)。
待测液为酶制剂或稀释后酶制剂，稀释用溶剂为pH4.8、0.05M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
1、滤纸酶(FPA)酶活的测定方法
实验组：将滤纸剪成宽1cm、长6cm的长方形(重约50±0.5mg)，折成M型，置于25mL具刻度试管中，加入0.5mL待测液和1.5mL pH4.8、0.05M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，50℃水浴60min，然后加入3mL DNS试剂，沸水浴煮沸5min，然后迅速冷却至室温，用蒸馏水定容到25mL，然后用酶标仪在540nm波长下测OD值。
空白组：去除了“50℃水浴60min”的步骤，其他同实验组。
根据OD540nm值、式1和式2计算滤纸酶酶活。滤纸酶(FPA)酶活单位为U。
FPU是国际单位表示方法,单位为IU。1IU的计算方式：滤纸酶酶活(U)除以180。
2、纤维素内切酶(EG)酶活的测定方法
实验组：取25mL具刻度试管，加入0.5mL待测液和1.5mL CMC-Na溶液(CMC-Na溶液：溶剂为pH4.8、0.05M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，CMC-Na浓度为2g/100ml)，50℃水浴30min，然后加入3mL DNS试剂，摇匀，沸水浴煮沸5min，然后迅速冷却至室温，用蒸馏水定容到25mL，然后用酶标仪在540nm波长下测OD值。
空白组：去除了“50℃水浴30min”的步骤，其他同实验组。
根据OD540nm值、式1和式2计算纤维素内切酶酶活。
3、β-葡萄糖苷酶(BGL)酶活的测定方法
实验组：取25mL具刻度试管，加入1mL待测液和1mL水杨素溶液(水杨素溶液：溶剂为pH4.8、0.05M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，水杨素浓度为1g/100ml)，50℃水浴30min，然后加入3mL DNS试剂，摇匀，沸水浴煮沸5min，然后迅速冷却至室温，用蒸馏水定容到25mL，然后用酶标仪在540nm波长下测OD值。
空白组：去除了“50℃水浴30min”的步骤，其他同实验组。
根据OD540nm值、式1和式2计算β-葡萄糖苷酶酶活。
4、纤维素外切酶(CBH)酶活的测定方法
实验组：取25mL带有刻度的具塞试管，加入1mL微晶纤维素溶液(微晶纤维素溶液：溶剂为pH4.8、0.1M的乙酸-乙酸钠缓冲液，微晶纤维素的浓度为1g/100mL)和1mL待测液，50℃反应2h，离心取上清，加入3mL DNS试剂，摇匀，沸水浴煮沸5min，然后迅速冷却至室温，用蒸馏水定容到25mL，然后用酶标仪在540nm波长下测OD值。
空白组：去除了“50℃反应2h”的步骤，其他同实验组。
根据OD540nm值、式1和式2计算纤维素外切酶酶活。
五、酶活测定结果
无菌纤维素酶液A、无菌纤维素酶液B、无菌纤维素酶液D1以及无菌纤维素酶液D2的酶活测定结果见表3。
表3
Figure BDA0001963324180000101
Figure BDA0001963324180000111
实施例3、重离子辐照预处理对秸秆水解产率的影响以及机理分析
一、重离子前处理后秸秆的酶水解实验
采用实施例2的步骤二制备的无菌纤维素酶液B(FPU为0.94IU/ml)。
纤维素酶水解秸秆木质纤维素时，作为液相的纤维素酶分子先吸附到固相的纤维素表面上，然后酶和底物形成不稳定的复合物，并在固相表面上进行酶水解反应从而产生还原糖，通过测定一定时间内水解液中还原糖的生成量计算纤维素酶对秸秆的水解产率。
具体操作：准确称取1g供试样本(供试样本分别为完成实施例1的步骤二的各处理组和对照组的样本)，加30mL去离子水，2℃浸泡24小时，随后用去离子水清洗2-3次，然后将固相与20mL去离子水封装于50mL的三角瓶中，121℃灭菌30min然后冷却至室温，然后加入无菌纤维素酶液B(酶负载量为2.4IU/g供试样本)，然后50℃、150rpm振荡孵育，分别于0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h和48h取样0.5mL；将取样样本4000rpm离心5min，收集上清液得到上清样本，收集沉淀用去离子水洗净后于在真空冷冻干燥机中干燥得到残渣样本。
二、用DNS法测还原糖的含量并计算水解产率
水解产率(％)＝生成的还原糖量(g)×0.9×100÷初始纤维素的量(g)。
秸秆粉中初始纤维素的含量通过酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)减去酸性洗涤木质素(Acid detergent lignin,ADL)计算得到。
步骤一的不同时间点得到的上清样本中的还原糖浓度见图4。不同时间点的水解产率见图5。0h上清样本中无还原糖存在。加入负载量为2.4IU/g的纤维素酶液后，首先纤维素内切酶(EG)会结合到纤维素的非结晶区域切割纤维素产生还原性末端，急剧降低纤维素的聚合度，紧接着纤维素外切酶(CBH)从还原性末端和非还原性末端水解低聚纤维素从而产生纤维二糖，纤维二糖水解酶(β-葡萄糖苷酶)最终分解纤维二糖从而释放出葡萄糖。0h至6h阶段，还原糖产量迅速提高，酶水解速率极快，6h以后反应速度变慢，这与产物的积累和底物的急剧降低有关(生成的还原糖和未被β葡萄糖苷酶(BGL)及时分解的纤维二糖均会对纤维素酶产生抑制，导致酶水解效率降低)。
天然木质纤维素主要由纤维素与半纤维素和其他多糖以及木质素紧密相连组成，这种致密的结构严重阻碍了纤维素酶和纤维素的相互作用。恰当的前处理方法几乎不会破坏初始材料中纤维素，会致使木质纤维素在酶的作用下糖的产量接近理论水平。秸秆经过重离子辐照预处理后，还原糖的得率大幅增加，水解产率显著提高。在同一酶解时间下，各处理组样本生成的还原糖和秸秆纤维素的水解产率均显著高于对照组样本。辐照剂量为600Gy处理组产生的还原糖含量和秸秆中纤维素的水解产率显著高于300Gy处理组和900Gy处理组。36h后水解体系中还原糖的量和水解产率不再增加，36h时辐照剂量为600Gy的处理组的水解产率是34.43％，较对照组的水解产率提高46.7％，36h时辐照剂量为600Gy的处理组的水解体系中还原糖的浓度为7.23mg/ml。在整个过程中，重离子辐照处理过的秸秆中纤维素的水解产率显著高于未辐照处理的对照组，600Gy处理组秸秆的水解产率最高。
三、原子力显微镜(AFM)可视化追踪秸秆水解过程
木质纤维素是一种三维的纳米复合材料，是多功能组分的动态混合体，通常对于其组份的分析不足以研究预处理对木质纤维素的影响。因此，对木质纤维素显微和纳米级的分析并和前处理样品进行比较，可以定性预测和了解前处理后木质纤维素材料对后续水解的敏感程度，故而，采用高效的表面成像技术对重离子束前处理前后和酶解过程中的表面结构的研究意义重大。
取步骤二中得到的残渣样本(初始时刻0h，反应速率最快时刻6h、反应结束时刻36h)，反复用去离子水轻微冲洗多次，随后用无水乙醇固定到硅片上，用原子力显微镜进行表面结构观察。酶水解过程中秸秆的表面形态见图6至图9，图6对应对照组，图7对应300Gy处理组，图8对应600Gy处理组，图9对应900Gy处理组。
初始时刻0h：对照组的秸秆表面完好无损；300Gy处理组秸秆表面出现不同程度地破坏；600Gy处理组秸秆表面严重破坏，明显有重离子击穿的孔洞；900Gy处理组秸秆表面结构比较特殊，好比一张比较完整的平面上散落的突起物，这可能是在高剂量下，秸秆表面的一些物质被重离子打落了下来。反应速率最快时刻6h：对照组的秸秆表面在酶的作用下出现了孔隙；300Gy处理组秸秆表面在酶的作用下出现既有孔洞出现，而且还有小的突起，但这些突起并没有600Gy剂量下分解6h时明显，这些突起很有可能就是纤维丝被纤维素酶分解留下的未被分解的部分；600Gy处理组秸秆表面很规则，在AFM下清晰地观察到了小的突起，这些突起均是沿着同一条直线基本等距离地成对分布，这可能是因为秸秆中的纤维丝沿着某一个方向成束分布，纤维在纤维素酶的作用下，易分解的部分已完成分解，而难以分解的部分就形成了图中的小突起；900Gy处理组秸秆表面被纤维素酶分解产生孔洞。反应结束时刻36h：对照组秸秆表面在酶的作用下出现了类似于在6h时600Gy的酶分解表面，只不过36h的未辐照的秸秆表面的突起较少，说明此时未辐照的秸秆水解基本结束，只不过水解程度明显低于辐照组，这也是酶水解毕其水解产率低于辐照组的直接证据；300Gy处理组秸秆表面在酶的作用下出现既有孔洞出现，而且还有小的突起，但突起不是很清晰，这和酶解的程度有关；600Gy处理组酶对秸秆表面破坏比较严重，表面不仅穿孔，而且在表面空间存在网状结构，木质纤维素结构在酶的作用下破坏更加彻底；900Gy处理组秸秆表面由于高能量离子束的破坏和纤维素酶分解从而产生更大地孔洞，木质纤维素的表面结构基本面目全非。
通过AFM对重离子辐照前处理的秸秆可视化地表面形态分析可知，相比于未辐照的对照组，重离子辐照处理对木质纤维素的表面结构有显著的破坏，不仅增加了木质纤维素表面的孔隙，而且在秸秆表面造成易损状态，这样不但增加了酶对底物的可及度，而且也增加了酶对底物的水解程度。从以上实验数据可知，低剂量的重离子束会破坏木质纤维素的表面结构，但并非辐照剂量越高越好，辐照剂量越高，木质纤维素严重破坏，反而不利于糖的产生，只有最佳剂量的重离子束辐照才能最大限度地提高酶解糖的产生和水解产率。

Claims (6)

1.一种提高纤维素酶对底物的水解效率的方法，包括如下步骤：对底物进行预处理；所述预处理为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料；所述辐照处理的辐照剂量为550Gy-650Gy。
2.一种对底物的预处理方法，为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料；所述辐照处理的辐照剂量为550Gy-650Gy。
3.一种以底物为原料生产还原糖的方法，包括如下步骤：对底物进行预处理；所述预处理为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料；所述辐照处理的辐照剂量为550Gy-650Gy。
4.一种以底物为原料生产还原糖的方法，包括如下步骤：对底物进行预处理，然后采用纤维素酶进行水解；所述预处理为采用12C6+离子束进行辐照处理；所述底物为木质纤维素或含有木质纤维素的生物材料；所述辐照处理的辐照剂量为550Gy-650Gy。
5.权利要求1至4中任一所述方法在制备还原糖中的应用。
6.权利要求1至4中任一所述方法在制备乙醇中的应用。
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