CN104862343A - 一种以木质纤维素同步糖化发酵制取燃料乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

一种以木质纤维素同步糖化发酵制取燃料乙醇的方法属于生物资源循环利用和生物质能源技术领域，包括以下步骤：(1)生物质以固体形态经过辐照预处理；(2)预处理后的生物质进行粉碎，并采用水洗、有机溶剂/水双相萃取、氢氧化钠溶液、或者硼氢化钠溶液等工艺“原位”脱毒；(3)脱毒后的生物质再进行同步糖化发酵制备乙醇。本发明工艺技术的优点在于耦合辐照预处理和同步糖化发酵技术，操作简单、高效，克服了目前稀酸预处理、离子液体预处理、蒸汽爆破预处理等传统工艺中存在的能耗高、水用量大、易造成“二次污染“等不足。

Description

一种以木质纤维素同步糖化发酵制取燃料乙醇的方法

技术领域

本发明属于生物资源循环利用和生物质能源技术领域，具体涉及一种辐照预处理木质纤维素同步糖化发酵制取乙醇的方法。

背景技术

随着人类社会的进步和经济的快速发展，人们对各种燃料和化学品的需求与日俱增，地球上现有的化石资源，如煤、石油、天然气等已经无法满足人类社会可持续发展的需求；另一方面，化石燃料燃烧所造成的环境污染和气候变暖等环境问题也日显凸现；加之，能源安全问题也是影响一个国家政治局势的重要因素。因此，寻找可再生的清洁生物质能源代替传统的化石能源已经迫在眉睫。生物质是地球上储量最丰富的可再生有机能源库，可用于生产各种生物燃料和生物基化学品，由此衍生出“生物炼制”的概念，逐渐成为世界各国可持续发展的重要战略研究方向。研究表明，生物质能源是目前最有可能成为化石能源替代资源。

生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素是葡萄糖单体经过β 1-4糖苷键聚合而成，可用于生产葡萄糖、乙醇、羟甲基糠醛等化学品。半纤维素主要成分是木聚糖，还包含葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等，被广泛用于生产糠醛、木糖醇等。木质素是地球上最丰富的芳香类聚合物，可用于生产苯酚、香草醛、愈创木酚、苯二酚等高价值的化学品。目前，已有诸多专利公开了生物质能源和化学品的生产工艺技术。例如，专利(CN101857885A，2010)公开了以竹子生物质废弃物为原料，经稀酸水解后发酵生产燃料乙醇工艺技术。专利(CN104072450A，2014)公开了以固体磷酸盐为催化剂，利用生物质原料制备5-羟甲基糠醛与糠醛的方法。专利(CN104177447A，2014)公开了以碳基固体酸为催化剂，水为溶剂降解木质素制备酚类化合物的方法，主要成分为愈创木酚基芳香类产物。

然而，自然界中的纤维素、半纤维素和木质素往往是紧密结合在一起，同时，生物质表面还包裹着果胶质，使得生物质结构具有一定的“顽固性”，微生物和生物酶难以降解生物质，水解得率低。因此，开发简洁高效、清洁、低成本的预处理技术是实现木质纤维素生物炼制的关键前提。据报道，木质纤维素预处理技术归纳起来大致有物理法、化学法和生物法，其作用在于破坏生物质致密结构，利于酶水解，提高转化效率。专利(CN 103497982A，2013)公开了一种组合预处理麦草秸秆方法，该方法将麦草秸秆用热水浸泡后进行螺旋挤压，加入H₂SO₄或NaOH，然后加入蒸馏水，蒸煮、螺旋挤压机挤压、恒温水浴后，进行两段磨解处理和筛选，实现了生物质的高效酶水解。但是，该方法存在操作繁琐、工艺控制难、且有酸碱废液排放等不足。专利(CN103849665A，2014)公开了一种羧基功能化离子液体溶液预处理木质纤维素的方法，该方法用羧基功能化离子液体与溶剂组成的混合溶液，在一定条件下对木质纤维素进行预处理，选择性水解原料中的半纤维素，实现了原料中纤维素、半纤维素、木质素的有效分离，其中富含纤维素部分酶解糖化效率高，达到了环保、高效分离木质纤维素各组份，以及从木质纤维素材料中高效制备可发酵糖溶液的目的。但是，该方法所用离子液体成本较高、回收重复利用困难。专利(CN102180994A，2011)公开了一种蔗渣生物质组分高效分离的组合预处理方法，该方法中蔗渣依次经过稀硫酸预浸、汽爆处理、热水洗涤和抽提，剩余物为高纤维素含量的残渣，其在较低的酶添加浓度下，酶解率显著增加，提高了蔗渣资源的转化和综合利用率。但是，该方法存在酸废液排放、水用量大、产生有机酸和羟甲基糠醛等抑制物等不足。

为了消除生物质预处理后产生的抑制物对后续发酵影响，专利(CN102191279A，2011)公开了一种生物脱毒预处理木质纤维素的方法，该方法采用真菌分别对蒸汽爆破和稀酸预处理后的木质纤维素进行脱毒，预处理过程产生的抑制物发生了降解作用，提高了同步糖化发酵产乙醇效率。但是，生物脱毒方法效率低、耗时长。

综上所述，目前公开的生物质预处理专利往往存在工艺过程较繁琐、反应条件苛刻，均需高温高压条件下进行反应，耗水量大、随着大量的副产物生成，如乙酸、甲酸、乙酰丙酸、糠醛、羟甲基糠醛、芳香类化合物等，这些副产物往往会影响后续酶解和发酵产乙醇效率。

研究发现，高能射线作用于生物质高分子时，能够打断分子间的连接键，破坏分子链有序排列的结晶结构，使生物质发生降解。易锦琼等报道了辐照预处理玉米秸秆，显著提高酶解糖化率。蒋怡乐等报道了以芦苇为原料，比较了不同预处理方法产生的副产物成分，结果表明，辐照预处理产生的副产物主要是芳香类化合物和脂肪酸，呋喃类化合物的含量极低。截止目前，辐照预处理-耦合同步糖化发酵制备燃料乙醇还未见报道。因此，为克服目前专利公开的生物质预处理技术存在的不足，本发明采用伽玛射线直接作用于固态生物质进行预处理，同时对预处理过程产生的少量抑制物进行“原位”化学法脱毒处理，耦合同步糖化发酵，提高了酶解效率和乙醇产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用伽玛射线直接作用于固态生物质进行预处理，同时对预处理过程产生的少量抑制物进行“原位”化学法脱毒处理，耦合同步糖化发酵制备乙醇的方法。

为实现上述目的，本发明以木质纤维素为原料，经由辐照预处理-“原位”脱毒-同步糖化发酵制取燃料乙醇。包括以下步骤：

(1)木质纤维素切碎后，以固态形式进行辐照预处理，破坏木质纤维素晶体结构，以提高后续酶解效率。

(2)辐照预处理后的生物质粉碎后，进行水洗、有机溶剂/水双相萃取、氢氧化钠溶液或硼氢化钠溶液中任何一种化学法进行“原位”脱毒处理，除去发酵抑制物。

(3)经上述处理后的木质纤维素进行同步糖化发酵，从而获得燃料乙醇。

所述方法，其中的木质纤维素涉及到富含纤维素的生物质，包含农林废弃物、草类、微晶纤维素等。

所述方法，其中的辐照预处理技术的能量源包括电子、γ-辐射、中子、微波等任何一种。

所述方法，其中的辐射剂量范围为50-2000kGy，在辐照剂量891kGy时，产还原糖和乙醇效果最佳。

所述方法，其中的的木质纤维素辐照预处理后，经“原位”脱毒，去除发酵抑制物，脱毒方法包括水洗、有机溶剂/水双相萃取、氢氧化钠溶液或硼氢化钠溶液中任何一种。

所述方法，其中的有机溶剂/水双相萃取脱毒方法，有机溶剂包含乙酸乙酯，有机溶剂与水的体积比5∶5～8∶2。

所述方法，其中的氢氧化钠溶液pH＝9.0～11.0。

所述方法，其中的硼氢化钠溶液的物质量浓度为10～20mM。

所述方法，其中使用的酶为纤维素酶，纤维素酶用量是5-150FPU/g底物。

相比目前公开的生物质预处理专利而言，本发明具有预处理操作简单、节水节能、无“三废”排放、抑制物少等优势，提高了同步糖化酶解效率和乙醇产量。具体优势如下：

(1)本发明首次提出将温和、高效的辐照预处理生物质，“原位”脱毒后，耦合同步糖化发酵技术制取乙醇，工艺过程简单。

(2)本发明预处理过程无需外加能源、能耗低。不需要添加任何化学试剂和水洗，无“三废”排放。预处理效果明显，降低了纤维素结晶度，增加了木质纤维素比表面积，提高了酶解效率。且不产生或很少产生乙酸、甲酸、糠醛、羟甲基糠醛等酶解和发酵抑制物。

(3)本发明“原位”脱毒方法操作简单、成本低、效率高，能够有效地提高乙醇产率。

附图说明

图1微晶纤维素辐照预处理前后表面结构的变化SEM图

图2微晶纤维素辐照预处理前后官能团变化的FT-IR图

图3不同预处理技术对酶解糖化的影响

图4辐照预处理对芦苇纤维素晶体结构的影响(PCT0-未处理的芦苇纤维素晶体SEM图；PCT2000-经2000kGy辐照预处理后芦苇纤维素晶体形态SEM图)

图5芦苇辐照预处理降解产物GC/MS总离子流图。

图6芦苇辐照预处理-“原位“脱毒-酶解的实验结果

图7工艺流程图。

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

案例1：微晶纤维素辐照预处理-同步糖化发酵制备乙醇实例，实验步骤和主要结果如下：

(1)在每支具塞试管(13mm(直径)×13cm(长度))中分别加入15g微晶纤维素(PH-101，购于美国西格玛公司)，用⁶⁰Co-γ辐照处理不同时间，得到辐照剂量为150，321，507，681，891，1057，1285，1467和1846kGy的预处理微晶纤维素。

(2)采用扫描电镜、红外光谱、X射线衍射和比表面仪，分别测定辐照预处理前后微晶纤维素表观结构、结晶度和比表面积变化，以确定辐照预处理后纤维素的外观形态和晶体结构发生了变化(见图1、图2和表1)。

(3)将0.5g不同剂量辐照预处理的微晶纤维素分别加入50ml锥形瓶，加入20ml0.05M pH 5.0的乙酸缓冲液和纤维素酶(购于美国sigma公司，编号C9748，30FPU/g底物)，酶解在50℃，150rpm/min的摇床中反应52小时，采用DNS法测定酶解液中还原糖含量，在891kGy条件下，还原糖含量22.13g/L，比对照组提高了近1.5倍(见表1)。

(4)将0.5g不同剂量辐照预处理的微晶纤维素分别加入50ml锥形瓶，加入10ml营养液(10mg/ml的酵母提取物和20mg/ml的蛋白胨，购于北京奥博星生物技术有限责任公司)、纤维素酶(30FPU/g底物)和0.3g干酵母(购于湖北宜昌安琪酵母有限公司)，同步糖化发酵在37℃，150rpm/min的摇床中进行108小时，采用HPLC测定发酵液中乙醇的浓度，在891kGy条件下，乙醇产率为19g/L，比对照组提高了近1.9倍(见表1)。

(5)为了进一步说明本发明的积极作用，还比较了辐照预处理、稀酸预处理、酸化离子液体预处理等不同预处理技术对酶解效果的影响，结果表明，辐照预处理后，还原 糖产率最高，为22g/L(见图3)。

表1 辐照预处理对微晶纤维素结构、酶解和同步糖化发酵的影响

案例2：芦苇生物质的辐照预处理-“原位”脱毒-同步糖化发酵制备燃料乙醇，实验操作与主要结果如下：

(1)将干燥的芦苇秸秆切成5-15cm的小段，对芦苇秸秆进行辐照预处理，辐照剂量为800kGy，经辐照预处理后，芦苇秸秆表面变得更加粗糙，结构受到很大破坏(见图4)，将有助于后续酶解和发酵产乙醇。将辐照预处理前后的芦苇秸秆粉碎，过筛60目，备用。

(2)然后，用乙酸乙酯萃取辐照预处理和未处理的芦苇秸秆，芦苇质量/乙酸乙酯体 积比为1∶10，萃取后离心，取上清，过0.22μm膜，进行气质联用(GC/MS)分析辐照预处理产生的抑制物种类与含量(见表2和图5)。

(3)接着，对上述抑制物进行“原位”脱毒，比较水洗、有机溶剂/水双相萃取、氢氧化钠溶液和硼氢化钠溶液等化学法脱毒技术的去除抑制物效果，固液质量/体积比为1∶10，超声震荡1.5h，其中所使用水为去离子水，有机溶剂/水体积比为8∶2，氢氧化钠溶液的pH＝11.0，硼氢化钠溶液的物质量浓度为20mM。脱毒后芦苇经抽滤和水洗3次后，自然条件风干，装入自封袋中保存，待用。

(4)最后，比较未辐照预处理前后的芦苇原料、脱毒前后的芦苇原料进行酶解和同步糖化发酵产乙醇效果。酶解条件：料液比60mg/ml葡聚糖，30mg酶蛋白/g葡聚糖，50℃，150rpm/min的摇床中进行酶解72小时。每24小时取样，离心，取上清，采用HPLC测定水解液中葡萄糖的浓度。从图6中可以看出，辐照预处理显著提高了酶解的葡萄糖得率，是未辐照的2.83倍，脱毒能提高葡萄糖的产率，其中氢氧化钠溶液和硼氢化钠溶液脱毒效果最好，葡萄糖产率分别是未辐照的3.41和3.99倍，是辐照预处理的1.21和1.41倍。发酵培养基组成为：0.5g芦苇，5ml营养液(10mg/ml的酵母提取物和20mg/ml的蛋白胨，购于北京奥博星生物技术有限责任公司)，纤维素酶(60FPU/g芦苇)，0.3g的干酵母。发酵条件：37℃，150rpm/min的摇床中进行108小时。发酵结束后，离心，取上清，采用HPLC测定发酵液中乙醇的浓度。从表2可以看出，辐照预处理后生物质转化乙醇产率略低于对照组，原因是因为辐照处理后产生抑制物。经脱毒处理后，乙醇产率明显提高，其中硼氢化钠溶液脱毒效果最好(见表3)。

表2 芦苇辐照预处理降解产物GC/MS分析抑制物种类与含量。

备注：NA-not available，未检出。

表3芦苇辐照预处理-“原位”脱毒-同步糖化发酵制取乙醇的实验结果

Claims (8)

1.一种以木质纤维素同步糖化发酵制取燃料乙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)木质纤维素切碎后，以固态形式进行辐照预处理，破坏木质纤维素晶体结构，以提高后续酶解效率；

(2)辐照预处理后的生物质粉碎后，进行水洗、有机溶剂/水双相萃取、氢氧化钠溶液或硼氢化钠溶液中任何一种方法进行“原位”脱毒处理，除去发酵抑制物；

(3)经上述处理后的木质纤维素进行同步糖化发酵，从而获得燃料乙醇。

2.根据权利要求1所述方法，其中木质纤维素包含农林废弃物、草类、藻类或微晶纤维素。

3.根据权利要求1所述方法，其中的辐照预处理技术的能量源包括电子、γ-辐射、中子、微波任何一种。

4.根据权利要求1所述方法，其中的辐射剂量范围为50～2000kGy。

5.根据权利要求1所述方法，其中的有机溶剂/水双相萃取脱毒方法，机溶剂为乙酸乙酯，有机溶剂与水的体积比5:5～8:2。

6.根据权利要求1所述方法，其中的氢氧化钠溶液pH＝9.0～11.0。

7.根据权利要求1所述方法，其中的硼氢化钠溶液的物质量浓度为10～20mM。

8.根据权利要求1所述方法，其中使用的酶为纤维素酶，纤维素酶用量是5-150FPU/g底物。