CN109589120A - 利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于神经科学技术领域的一种利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，包括正常小鼠ABR测试；耳聋小鼠造模；致聋小鼠模型的ABR测试验证；对耳聋小鼠进行经颅超声刺激；对耳聋小鼠进行经颅磁声刺激；电生理信号的采集分析与作用效果的评价。本发明提出的一种利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，可以区分小鼠在进行经颅磁声刺激过程中，声场与磁场两种物理刺激在刺激过程中所起的作用效果，并可进一步探究经颅磁声刺激过程中声场与磁场如何进行复合进而形成对神经组织的协同调控作用，为更好的理解经颅磁声刺激的作用机制与经颅磁声刺激技术的应用提供了指导。

Description

利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法

技术领域

本发明属于神经科学技术领域，特别涉及一种利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法。

背景技术

经颅磁声刺激是一种新型的无创神经刺激技术，具有非侵入性、高时空分辨率、可实现脑深部刺激、可对神经电活动进行直接调控等特点，引起广泛关注，在神经科学研究领域中具有重要价值。与基于超声的力学效应进行神经调控的经颅超声刺激不同，经颅磁声刺激的原理是基于导电神经组织的霍尔效应：置于静磁场中的神经组织在外加超声波的作用下，组织中的离子产生与声波振动方向一致的运动，切割磁感线产生耦合感应电流与电场，进而可以对神经电活动进行直接调控。经颅磁声刺激利用声场与磁声的耦合产生感应电场，具有电场刺激的特点。同时，由于经颅磁声刺激实施中需要引入超声激励，该过程还包含超声场刺激的特性。但是经颅磁声刺激对神经组织或细胞的作用主要是声场与磁场耦合所形成的电场作用，还是基于超声的声场对细胞的力学作用，或者是声场与电场协同调控、共同发挥作用还尚不可知。已有研究表明，听觉通路的完整是小鼠能够进行经颅超声传导进而进行超声神经调控的必要条件，因此破坏听觉通路的完整可以去除经颅磁声刺激过程中声场对神经的影响作用。需要一种简便易行的方法来区分小鼠经颅磁声刺激中电场与声场作用效果，进而有效去除经颅磁声刺激作用中声场的影响，区分经颅磁声刺激过程中不同物理激励对神经调控的影响作用及影响占比，探究经颅磁声刺激的作用效果与潜在机制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，进而可以探究经颅磁声刺激技术中不同物理因子对神经活动的影响。

利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，包括如下步骤：

1）对正常小鼠进行听性脑干反应（Auditory brainstem response, ABR）测试；

2）物理/化学方法致聋小鼠，制作耳聋小鼠模型；

3）对致聋后的小鼠模型进行ABR测试；

4）将成功致聋的小鼠随机分成两组，每组数目相同；

5）对一组小鼠进行经颅超声刺激，并对刺激过程中的生理信号进行采集；

6）对另一组小鼠进行经颅磁声刺激，并对刺激过程中的生理信号进行采集；

7）另取听力正常的小鼠随机分成两组，每组数目与实验组相同，作为对照组，重复步骤5）和6）；

8）对采集到的生理信号进行分析并对刺激的作用效果进行评价。

步骤1）所述对正常小鼠进行听性脑干反应ABR测试，包括如下步骤：

（1）水合氯醛腹腔注射 (4%，0.1 mg／10g)麻醉；

（2）麻醉后，将记录电极插入头正中皮下，参考电极插入左乳突皮下，地极插入鼻尖；

（3）进行短声诱发的ABR 测试，设置刺激频率、时程、重复频率，确定衰减间隔，并依据强声刺激下ABR各波的出现率（出现率最高的波）判断阈值。至少重复2次，取平均值作为阈值；与标准阈值相比，判断听力是否正常。

步骤2）所述采用物理或化学致聋小鼠，制作耳聋小鼠造模，方法如下：

所述物理致聋方法为对小鼠进行外科手术，抽出小鼠耳蜗中的流体或者切断耳部的听觉神经通路，破坏听觉通路的完整；

所述化学致聋方法为选用适龄小鼠，联合注射卡那霉素与呋塞米。按1g/kg的剂量皮下注射卡那霉素，30-45min按0.4g/kg的剂量腹腔注射呋塞米剂量。

步骤3）所述对致聋后的小鼠对模型进行ABR测试方法同步骤1），判断听觉是否完全丧失，验证造模是否成功，对比阈值的变化，判断听觉系统是否被破坏；物理致聋可在致聋后直接进行ABR测试，化学致聋可在注射后12h、24h、36h、48h分别进行ABR测试。

步骤4）所述分组需先对耳聋小鼠进行编号，然后采用随机数字表进行随机分组。

步骤5）所述对造模成功的其中一组小鼠进行经颅超声刺激，并采集刺激诱发的电生理生理，观察记录刺激诱发的运动反馈，具体包括：

（1）刺激系统可采用经颅超声刺激与经颅磁声刺激一体化装置；

（2）刺激靶区可选取小鼠的运动皮层，视觉皮层以及躯体感觉皮层；

（3）刺激过程中的电生理信号包括肌电运动阈值、肌电成功率与局部场电位，进一步还可包括神经离子通道电信号及相关蛋白的变化。

步骤6）所述对造模成功的另一组小鼠进行经颅磁声刺激，并采集刺激诱发肌电信号，观察记录刺激诱发的运动反馈，步骤同5）。

步骤7）所述将听力正常的小鼠分为两组，分组方法同步骤4），对照组不仅可以用于区分经颅磁声刺激中电场与声场两种物理激励对神经组织的不同作用，也可验证听觉通路的完整对经颅超声刺激过程中声场的影响。

步骤8）所述对步骤5）、步骤6）和步骤7）四组小鼠采集到的电生理信号采集的肌电信号进行分析，评估刺激中声场与电场的作用效果，具体包括：

（1）对正常经颅超声刺激，正常经颅磁声刺激，耳聋经颅超声刺激，耳聋经颅磁声刺激四组小鼠采集到的电生理信号首先进行滤波处理；

（2）对处理后的电生理信号及运动反馈结果进行统计分析；

（3）根据电生理特征信号指标评价经颅超声刺激与经颅磁声刺激对小鼠脑区的作用效果，进而区分经颅磁声刺激中电场与声场两种物理激励对神经组织的不同作用。

听觉通路的完整是小鼠能够进行经颅超声传导进而进行超声神经调控的必要条件，因此破坏听觉通路的完整可以去除经颅磁声刺激过程中声场对神经的影响作用。本发明利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，是基于经颅超声刺激是通过小鼠的听觉通路进行声波的传导进而完成调控神经的依据，因此破坏听觉神经的完整可以阻断声场对小鼠神经活动的影响，进而可以区分出同时包含超声声场与耦合电场的经颅磁声刺激中声场与磁场两种物理刺激在刺激过程中所起的作用效果，并进一步探究经颅磁声刺激过程中声场与磁场如何进行复合进而形成对神经组织的协同调控作用。

有益效果：本发明提出的利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法,可以区分小鼠在进行经颅磁声刺激过程中，声场与磁声耦合电场两种物理因子在刺激过程中所起的作用效果，并可进一步探究经颅磁声刺激过程中声场与耦合电场如何进行复合进而形成对神经组织的协同调控作用，为更好的理解经颅磁声刺激的作用机制与经颅磁声刺激技术的应用提供了指导。

附图说明

图1为本发明的结构框图。

图2为本发明的实验装置图，其中1-信号发生器1、2-信号发生器2、3-功率放大器、4-超声换能器、5-声准直器、6-静磁铁、7-移动支架、8-旋转槽、9-立体定位仪、10-4通道肌电记录仪、11-计算机。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法做出详细说明，实施例选取运动皮层作为刺激靶点，选取肌电信号作为评价指标，需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比率，仅用于方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

实施例1

如图1所示，利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，以C57BL/6J小鼠为样品，结合图2的系统装置图，包括以下操作步骤：

（1）取健康小鼠12只，腹腔注射水合氯醛(4%，0.1 mg／10g)麻醉，麻醉后，将记录电极插入头正中皮下，参考电极插入左乳突皮下，地极插入鼻尖；

（2）采用美国Nicolet公司Compass系统，对小鼠进行刺激，刺激声为短纯音(2、4及8kHz)，时程0.1 ms，重复速率11.1次／s，滤波带宽 150—2000 Hz，叠加1000次，扫描周期10ms。刺激声首先以声压级10 dB递减，接近阈值时以5 dB递减，以能分辨出ABR I波的刺激强度确定为阈值，并至少重复2次，取平均值作为阈值；

（3）对听力测试正常的小鼠按1g/kg的剂量皮下注射卡那霉素，30~45min按0.4g/kg的剂量腹腔注射呋塞米，进行化学致聋；

（4）在注射后12h、24h、36h、48h分别重复步骤（1）（2）（3），进行ABR测试，看阈值改变是否具有统计学差异（P<0.001）；

（5）将成功致聋的12只小鼠随机分成两组，每组6只，首先对其中一组小鼠进行经颅超声刺激；

（6）将小鼠经腹腔注射水合氯醛(4%，0.1 mg／10g)麻醉后剃除头部毛发并固定在脑立体定位仪的固定垫9上；

（7）使用针式电极接入4通道肌电记录仪10，型号为RM6240E/EC，针型电极的三个电极分别置于小鼠的右前肢（正极）和后肢（负极与接地），4通道肌电记录仪10的输出端接入主机11，实现肌电信号的采集与实时显示；

（8）打开信号发生器1，设定用于触发信号发生器2的波形、重复频率、重复周期等参数；打开信号发生器2，设定刺激所需的基波频率、电压幅值等，产生的超声信号输出到功率放大器；打开功率放大器3，设定放大倍数为100，将放大后的激励信号输出到超声换能器4，电信号经换能器转换为声信号；

（9）将声准直器5注满超声耦合剂，与超声换能器4耦合，调整声准直器5的位置，使之对准小鼠头部的运动皮层作为刺激靶区，在小鼠头部与准直器5相接触的靶区涂上超声耦合剂，减小超声传播过程中的衰减；

（10）在小鼠接受注射麻醉10-15min钟后，以足底反射判定小鼠是否处于浅麻醉状态；

（11）对浅麻醉状态下的小鼠进行经颅超声刺激，并同时采集刺激诱发的肌电信号，观察记录刺激诱发的运动反馈；

（12）对另一组小鼠进行经颅磁声刺激：将静磁铁6装载到旋转槽8中，旋转移动支架7，使静磁铁置于小鼠的一侧，可实现经颅磁声刺激，并可通过调整旋转槽的角度改变磁场相对于超声波的方向，步骤同（6）-（10） ；

（13）对浅麻醉状态下的小鼠进行经颅磁声刺激，并同时采集刺激诱发的肌电信号，观察记录刺激诱发的运动反馈；

（14）取听力正常的健康小鼠12只，随机分为两组，每组6只，作为经颅超声刺激与经颅超声刺激的对照组，分别两对照组进行如上步骤的经颅超声刺激（步骤6-10）与经颅磁声刺激（12-13）；

（15）对记录与采集的四组数据进行分析及滤波处理，分别获得肌电成功率、运动阈值、肌电幅值参数，对这三项参数进行分组统计分析。根据运动阈值，肌电成功率、肌电幅值三种指标评价经颅超声刺激与经颅磁声刺激对小鼠运动皮层的作用效果，进而区分经颅磁声刺激中电场与声场两种物理激励对神经组织的不同作用。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）对正常小鼠进行ABR测试；

2）物理或化学方法致聋小鼠，制作耳聋小鼠模型；

3）对致聋后的小鼠模型进行ABR测试；

4）将成功致聋的小鼠随机分成两组，每组数目相同；

5）对一组小鼠进行经颅超声刺激，并对刺激过程中的生理信号进行采集；

6）对另一组小鼠进行经颅磁声刺激，并对刺激过程中的生理信号进行采集；

7）另取听力正常的小鼠随机分成两组，每组数目与实验组相同，作为对照组，重复步骤5）和6）；

8）对采集到的生理信号进行分析并对刺激的作用效果进行评价。

2.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤1）所述对正常小鼠进行听性脑干反应ABR测试，包括如下步骤：

（1）水合氯醛腹腔注射麻醉，注射剂量为4%，0.1 mg／10g；

（2）麻醉后，将记录电极插入头正中皮下，参考电极插入左乳突皮下，地极插入鼻尖；

（3）进行短声诱发的ABR 测试，设置刺激频率、时程、重复频率，确定衰减间隔，并依据强声刺激下ABR各波的出现率判断阈值，至少重复2次，取平均值作为阈值；与标准阈值相比，判断听力是否正常。

3.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤2）所述采用物理或化学致聋小鼠，制作耳聋小鼠造模，方法如下：

所述物理致聋方法为对小鼠进行外科手术，抽出小鼠耳蜗中的流体或者切断耳部的听觉神经通路，破坏听觉通路的完整；

所述化学致聋方法为选用适龄小鼠，联合注射卡那霉素与呋塞米，按1g/kg的剂量皮下注射卡那霉素，30-45min按0.4g/kg的剂量腹腔注射呋塞米剂量。

4.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤3）所述对致聋后的小鼠对模型进行ABR测试方法同步骤1），判断听觉是否完全丧失，验证造模是否成功，对比阈值的变化，判断听觉系统是否被破坏；物理致聋可在致聋后直接进行ABR测试，化学致聋可在注射后12h、24h、36h、48h分别进行ABR测试。

5.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤4）所述分组需先对耳聋小鼠进行编号，然后采用随机数字表进行随机分组。

6.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤5）所述对造模成功的其中一组小鼠进行经颅超声刺激，并采集刺激诱发的电生理生理，观察记录刺激诱发的运动反馈，具体包括：

（1）刺激系统可采用经颅超声刺激与经颅磁声刺激一体化装置；

（2）刺激区域可选取小鼠的运动皮层，视觉皮层以及躯体感觉皮层；

（3）刺激过程中的电生理信号包括肌电运动阈值、肌电成功率与局部场电位、神经离子通道电信号及相关蛋白的变化。

7.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤6）所述对造模成功的另一组小鼠进行经颅磁声刺激，并采集刺激诱发肌电信号，观察记录刺激诱发的运动反馈，步骤同5）。

8.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤7）所述将听力正常的小鼠分为两组，分组方法同步骤4），对照组不仅可以用于区分经颅磁声刺激中电场与声场两种物理激励对神经组织的不同作用，也可验证听觉通路的完整对经颅超声刺激过程中声场的影响。

9.根据权利要求1所述利用耳聋鼠区分经颅磁声刺激中电场与声场作用的方法，其特征在于，步骤8）所述对步骤5）、步骤6）和步骤7）四组小鼠采集到的电生理信号采集的肌电信号进行分析，评估刺激中声场与电场的作用效果，具体包括：

（1）对正常经颅超声刺激，正常经颅磁声刺激，耳聋经颅超声刺激，耳聋经颅磁声刺激四组小鼠采集到的电生理信号首先进行滤波处理；

（2）对处理后的电生理信号及运动反馈结果进行统计分析；

（3）根据电生理特征信号指标评价经颅超声刺激与经颅磁声刺激对小鼠脑区的作用效果，进而区分经颅磁声刺激中电场与声场两种物理激励对神经组织的不同作用。