CN109580758B - 一种铜离子电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种铜离子电化学传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜离子电化学传感器及其制备方法和应用，属于分析化学、生命科学领域，该电化学传感器由枝状聚乙烯亚胺修饰的工作电极、巯基二茂铁修饰的内参比单元组成，所述枝状聚乙烯亚胺修饰的工作电极用于Cu2+的识别单元。本发明提供一种可再生、高灵敏、高选择性、可实现在线监测脑内Cu2+水平的铜离子电化学传感器及其制备方法和应用，采用识别单元枝状聚乙烯亚胺和内参比单元巯基二茂铁制备了可再生的比率型电化学传感器，与微透析活体取样技术相结合，该传感器可以实现在线再生‑检测循环。且该传感器对Cu2+检测具有良好的灵敏度、选择性和稳定性，成功应用于脑缺血/再灌注事件进展过程中连续测定大鼠脑内Cu2+水平。

Description

一种铜离子电化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分析化学、生命科学以及医学等技术领域，具体涉及一种铜离子电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
Cu2+是生物体必需的微量营养素之一，在生理和病理事件中起着至关重要的作用。Cu2+是多种金属酶关键的辅助因子，起着产生细胞能量，减少分子氧，激活信号转导的作用。Cu+/Cu2+的失衡可导致与阿尔茨海默病、帕金森病等多种严重的神经退行性疾病密切相关的活性氧产生。越来越多的证据表明，脑缺血是老年人死亡和神经退行性疾病的主要原因之一。因此，开发高效的Cu2+分析方法对研究全脑缺血/再灌注病理事件中Cu2+的水平，具有重要意义。
目前，已经发展起来的检测Cu2+的分析方法很多，如电感耦合等离子体质谱仪和原子吸收光谱法等。然而，这些方法不适合实时检测和在体检测。另外，由于电化学方法成本低、简单、具有实时和原位检测的潜力，被认为是最有前景的分析技术之一。为此，一些有效的电化学分析方法用于检测活体内的Cu2+水平已经建立起来。然而，这些均为一次性电化学传感器，不具备再生的能力，很难获得在病理事件中活体内Cu2+水平持续变化的信息。因此，设计新的再生电化学生物传感器，并满足生理和病理事件下连续监测Cu2+水平的要求，仍是十分必要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可再生、高灵敏、高选择性、可实现在线监测脑内Cu2+水平的铜离子电化学传感器及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种铜离子电化学传感器，由枝状聚乙烯亚胺修饰的工作电极、巯基二茂铁修饰的内参比单元组成，所述枝状聚乙烯亚胺修饰的工作电极用于铜离子的识别单元，与巯基二茂铁修饰的内参比单元共同组成可再生比率型传感器。
本发明还提供所述铜离子电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、以枝状聚乙烯亚胺为可再生识别单元，采用逐步化学反应将其共价修饰到GC电极1上，标记为GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极；
步骤二、以6-(二茂铁)六硫醇(FcHT)为内置参比单元，采用逐步化学反应将其共价修饰到GC电极2上，标记为GC/Cys/Au/FcHT电极；
步骤三、将步骤一、步骤二中制备的电极共同组建可再生的比率型铜离子电化学传感器。
作为优选，所述步骤一中，具体为：
1.1)将GC电极1用0.01～0.1μm的氧化铝在抛光布上抛光，并依次置于丙酮、硝酸(3:1～1:3，v/v)、氢氧化钠(20％～60％，w/w)和蒸馏水依次超声1～10min；
1.2)将步骤1.1)制备的电极在0.1～5M的H2SO4中采用循环伏安法扫描至电流稳定，扫描电压范围从-1V至+1V，扫描速度0.1V/s，用蒸馏水清洗；
1.3)将步骤1.2)制备的电极依次浸泡于0.01～100mM的半胱氨酸、0.5～100mM的EDC、0.5～100mM的NHS溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
1.4)将步骤1.3)制备的电极浸泡于用柠檬酸三钠合成的金纳米颗粒溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
1.5)将步骤1.4)制备的电极浸泡于0.01～100mM的巯基丙酸溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
1.6)将步骤1.5)制备的电极浸泡于0.1～100mM的枝状聚乙烯亚胺、0.5～100mM的EDC、0.5～100mM的NHS溶液中2～24h，用蒸馏水清洗。
作为优选，所述步骤二中，具体为：
2.1)将GC电极2用0.01～0.1μm的氧化铝在抛光布上抛光，并依次置于丙酮、硝酸(3:1～1:3，v/v)、氢氧化钠(20％～60％，w/w)和蒸馏水依次超声1-10min；
2.2)将步骤2.1)制备的电极在0.1～5M的H2SO4中采用循环伏安法扫描至电流稳定，扫描电压范围从-1V至+1V，扫描速度0.1V/s，用蒸馏水清洗；
2.3)将步骤2.2)制备的电极依次浸泡于0.01～100mM的半胱氨酸、5～100mM的EDC、5～100mM的NHS溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
2.4)将步骤2.3)制备的电极浸泡于用柠檬酸三钠合成的金纳米颗粒溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
2.5)将步骤2.4)制备的电极浸泡于0.1～100mM的巯基二茂铁溶液中1～12h，用蒸馏水清洗；
2.6)将步骤2.5)制备的电极浸泡于0.01～100mM的六巯基已硫醇溶液中1～12h，用蒸馏水清洗。
作为一个总的发明构思，本发明还提供所述铜离子电化学传感器的应用，将铜离子电化学传感器用于高灵敏高选择性地检测Cu2+。
作为优选，所述铜离子电化学传感器用于检测人工模拟脑脊液或者磷酸缓冲溶液中Cu2+浓度，包括以下步骤：
S1.将铜离子电化学传感器置于含有4μM Cu2+的人工模拟脑脊液中，采用DPV方法进行扫描，扫描要求为：GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极(0.35V至-0.10V)；GC/Cys/Au/FcHT电极(0.55V至0V)，GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极于100mV处获得一个对应铜离子的还原峰，GC/Cys/Au/FcHT电极于360mV处获得一个对应巯基二茂铁的还原峰；
S2.将铜离子电化学传感器置于含有一系列浓度Cu2+的人工模拟脑脊液中，100mV处的峰电流密度(J)随着Cu2+浓度的增加而增加，360mV处的峰电流密度(JR)保持不变，通过计算，J与JR的比值与Cu2+的浓度成正比，以此为依据，定量地实现对Cu2+的检测。
进一步，所述铜离子电化学传感器对其他金属离子(Cu+，Ni2+，Ca2+，Mg2+，Co2+，Pb2+，Cd2+，Mn2+，Fe3+，Fe2+，Zn2+)，各种氨基酸(组氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，缬氨酸，蛋氨酸,甘氨酸,酷氨酸,色氨酸,苯丙氨酸,丝氨酸,精氨酸)，和几种生物活性物质(多巴胺，抗坏血酸，尿酸，氧气，乳酸，葡萄糖和过氧化氢)有较强的抗干扰能力。
进一步，将所述铜离子电化学传感器与微透析活体取样系统联用，形成在线微透析活体取样-电化学传感器系统，实现在线再生-检测循环。
进一步，将所述在线微透析活体取样-电化学传感器系统用于大鼠在全脑缺血-再灌注病理事件中的Cu2+水平的连续检测。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
本发明提供一种可再生、高灵敏、高选择性、可实现在线监测脑内Cu2+水平的铜离子电化学传感器及其制备方法和应用。采用识别单元枝状聚乙烯亚胺和内参比单元巯基二茂铁制备了可再生的比率型电化学传感器，与微透析活体取样技术相结合，该传感器可以实现在线再生-检测循环。且该传感器对Cu2+检测具有良好的灵敏度、选择性和稳定性，成功应用于脑缺血/再灌注事件进展过程中连续测定大鼠脑内Cu2+水平。
本发明的应用表明Cu2+水平可作为全脑缺血的重要指标，可能成为诊断早期神经退行性疾病的潜在生物标志物。本发明不仅为构建基于大分子的再生电化学传感器提供了良好的策略，而且为连续监测重要生物标志物建立了可靠的在线分析平台。同时，这项工作为连续监测各种重要标志物在生理和病理过程中的水平变化提供可能，可成为探究生理和病理过程中小分子机制的重要平台。
附图说明
图1为铜离子电化学传感器的结构示意图；
其中：1—GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极；2—GC/Cys/Au/FcHT电极。
图2为本发明铜离子电化学传感器的制备过程示意图。
图3为在线微透析活体取样-电化学传感器系统的设备连接示意图。
图4为实施例1制备的电极表面的金颗粒组装边缘图。
图5为图4中a，b，c，d所标示表面的高度示意图。
图6为不同的电极在4μM Cu2+的溶液中扫描得到的差示脉冲伏安图，其中：
a)裸GC1；裸GC2；b)活化GC1；活化GC2；c)GC1/Cys；GC2/Cys；d)GC1/Cys/Au；GC2/Cys/Au；e)GC1/Cys/Au/MPA；GC2/Cys/Au/FcHT；f)GC1/Cys/Au/MPA/hPEI；GC2/Cys/Au/FcHT。
图7为铜离子电化学传感器在系列浓度的Cu2+溶液中扫描得到的差示脉冲伏安图，a至p分别为0.05,0.1,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12μM。
图8为铜离子电化学传感器分别在Cu2+和各种金属离子(Cu+，Ni2+，Ca2+，Mg2+，Co2+，Pb2+，Cd2+，Mn2+，Fe3+，Fe2+，Zn2+)溶液中测得的差示脉冲伏安响应图，Cu2+浓度为4μM，各金属离子的浓度均为10μM。(第一个响应为铜离子的响应)
图9为铜离子电化学传感器分别在Cu2+和各种氨基酸(组氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，缬氨酸，蛋氨酸,甘氨酸,酷氨酸,色氨酸,苯丙氨酸,丝氨酸,精氨酸)溶液中测得的差示脉冲伏安响应图，Cu2+浓度为4μM，各氨基酸的浓度均为10μM。(第一个响应为铜离子的响应)
图10为铜离子电化学传感器在分别在Cu2+和各种生物活性物质(多巴胺，抗坏血酸，尿酸，氧气，乳酸，葡萄糖和过氧化氢)溶液中测得的差示脉冲伏安响应图，Cu2+浓度为4μM，各活性物质的浓度为多巴胺：10μM，抗坏血酸：100μM，尿酸：10μM，氧气：0.25mM，乳酸：1mM，葡萄糖：1mM，过氧化氢：1μM。(第一个响应为铜离子的响应)
图11为铜离子电化学传感器分别在五次在线再生-检测循环和五次重复检测计算得到的J/JR对比图，Cu2+浓度为4μM，J为100mV处的峰电流密度，JR为360mV处的峰电流密度。
图12为铜离子电化学传感器在测定大鼠1全脑缺血-再灌注病理事件中测得的差示脉冲伏安响应图。三次测量分别为大鼠在正常状态、全脑缺血60分钟、再灌注60分钟时，灌流液为空白人工脑脊液。
图13为铜离子电化学传感器在测定大鼠2全脑缺血-再灌注病理事件中测得的差示脉冲伏安响应图。三次测量分别为大鼠在正常状态、全脑缺血60分钟、再灌注60分钟时，灌流液为空白人工脑脊液。
图14为铜离子电化学传感器在测定大鼠3全脑缺血-再灌注病理事件中测得的差示脉冲伏安响应图。三次测量分别为大鼠在正常状态、全脑缺血60分钟、再灌注60分钟时，灌流液为空白人工脑脊液。
图15为铜离子电化学传感器在测定大鼠4全脑缺血-再灌注病理事件中测得的差示脉冲伏安响应图。三次测量分别为大鼠在正常状态、全脑缺血60分钟、再灌注60分钟时，灌流液为空白人工脑脊液加标2μM Cu2+。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种铜离子电化学传感器，如图1所示，由枝状聚乙烯亚胺修饰的GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极1、内参比单元GC/Cys/Au/FcHT电极2组成，枝状聚乙烯亚胺修饰的GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极用于Cu2+的识别单元，与内参比单元GC/Cys/Au/FcHT电极共同组成可再生比率型传感器。
图2为本发明铜离子电化学传感器的制备过程，包括以下步骤：
步骤一、以枝状聚乙烯亚胺为可再生识别单元，采用逐步化学反应将其共价修饰到GC电极1上，标记为GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极；
步骤二、以6-(二茂铁)六硫醇(FcHT)为内置参比单元，采用逐步化学反应将其共价修饰到GC电极2上，标记为GC/Cys/Au/FcHT电极；
步骤三、将步骤一、步骤二中制备的电极共同组建可再生的比率型铜离子电化学传感器。
图3为本发明在线微透析活体取样-电化学传感器系统的设备连接示意图，蠕动泵装载气密性注射器传递人工脑脊髓溶液，外接两个八通道纳米阀用来装载EDTA二钠盐溶液，通过八通阀将EDTA二钠盐灌注到传感器表面中，采用三电极测试体系，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为不锈钢流通池，传感器与电化学工作站CHI 832D连接，通过电脑进行数据分析与处理，为了减小分子扩散，所有部件的连接部分均用石英毛细管来连接，各石英毛细管的连接用面部有特殊材料涂层的聚四氟乙烯管连接。
将在线微透析活体取样-电化学传感器系统用于在线再生-检测循环，包括以下步骤：
a).蠕动泵装载气密性注射器传递人工脑脊髓溶液，流速为0.05～4μL/min，外接两个15～200μL定量环的八通道纳米阀用来装载0.1～100mM的EDTA二钠盐溶液，为了减小分子扩散，所有部件的连接部分均用石英毛细管(I.D.75μm)来连接，各石英毛细管的连接用面部有特殊材料涂层的聚四氟乙烯管连接；
b).在检测间隔期间，将EDTA二钠盐溶液装载至定量环中，转动八通阀将EDTA二钠盐灌注到传感器表面中，清洗Cu2+生物传感器表面残留的Cu2+和Cu+实现在线再生，进一步传递Cu2+溶液进行检测信号和原信号无明显差别，说明该传感器初步具备在线再生-检测循环的能力；
c).进行5次再生-检测循环，与传感器直接五次重复测定信号对比，该传感器具有多次在线再生-检测循环的能力，且信号稳定。
下面结合附图和具体实施例对本发明铜离子电化学传感器的制备方法进一步说明。
实施例1
采用玻碳片制备GC/Cys/Au电极，包括以下步骤：
1)将裸双玻碳块状电极(包含GC电极1和GC电极2)用0.05μm的氧化铝在抛光布上抛光，并依次置于丙酮、硝酸(1:1，v/v)、氢氧化钠(50％，w/w)和蒸馏水依次超声5min；
2)将步骤1)制备的电极在0.5M H2SO4中采用循环伏安法扫描至电流稳定，扫描电压范围从-1V至+1V，扫描速度0.1V/s，用蒸馏水清洗；
3)将步骤2)制备的电极依次浸泡于10mM的半胱氨酸、10mM的EDC、10mM的NHS溶液中2h，用蒸馏水清洗；
4)将步骤3)制备的电极浸泡于用柠檬酸三钠合成的金纳米颗粒溶液中2h，用蒸馏水清洗，得到GC1/Cys/Au电极、GC2/Cys/Au电极。
在原子力显微镜下观察如图4，可明显观察到传感器表面的金颗粒组装边缘，在未修饰半胱氨基的表面，金颗粒零散地分布在玻碳片上；在修饰半胱氨基的表面，金颗粒以较致密的单分子层分布在玻碳片上。如图4中标记有a，b，c，d四个不同的表面，根据分析，其高度如图5所示。a和b所标记的单个金颗粒的尺寸约为6nm，c和d所标记的单分子金层的厚度大约为6nm，这说明金颗粒通过半胱氨基的巯基修饰于破碳片表面，且为单分子修饰。
实施例2
采用实施例1所得GC1/Cys/Au电极制备GC1/Cys/Au/MPA/hPEI电极，包括以下步骤：
5)将GC1/Cys/Au电极浸泡于10mM的巯基丙酸溶液中2h，用蒸馏水清洗；
6)将制备的电极浸泡于1mM的枝状聚乙烯亚胺、10mM的EDC、10mM的NHS溶液中2h，用蒸馏水清洗。
实施例3
采用实施例1所得GC2/Cys/Au电极制备GC2/Cys/Au/FcHT电极，包括以下步骤：
5)将GC2/Cys/Au电极浸泡于1mM的巯基二茂铁溶液中1h，用蒸馏水清洗；
6)将制备的电极浸泡于1mM的六巯基已硫醇溶液中1h，用蒸馏水清洗。
经过步骤1)～6)的逐步化学反应策略，最终得到双通道传感器，具体为：
a)裸GC1；裸GC2；b)活化GC1；活化GC2；c)GC1/Cys；GC2/Cys；d)GC1/Cys/Au；GC2/Cys/Au；e)GC1/Cys/Au/MPA；GC2/Cys/Au/FcHT；f)GC1/Cys/Au/MPA/hPEI；GC2/Cys/Au/FcHT。
将上述电极分别置于2μM Cu2+溶液中，进行差示脉冲伏安扫描如图6。扫描参数：电势阶跃为4mV，脉冲宽度为0.06s，脉冲周期为0.5s，脉冲振幅为50mV。由图5可以看出，很明显，Cu2+出现峰电流响应仅在GC/Cys/Au/MPA/hPEI上得到，而二茂铁的峰电流响应仅在GC/Cys/Au/FcHT上得到。这说明所制备的传感器对Cu2+具有良好的电流响应。
实施例4
将实施例2制备的GC1/Cys/Au/MPA/hPEI电极，以及实施例3制备的GC2/Cys/Au/FcHT电极组装成铜离子电化学传感器，具体如图1所示，将该铜离子电化学传感器置于系列浓度的Cu2+溶液中，进行差示脉冲伏安扫描如图7。100mV处的峰电流随着Cu2+浓度的升高呈现线性增长，而360mV处的峰电流基本保持不变。通过计算J/JR，Cu2+浓度与J/JR呈良好的线性相关。因此J/JR用于定量的计算Cu2+浓度。
实施例5
将实施例4制备的铜离子电化学传感器分别置于Cu2+和各种金属离子(Cu+，Ni2+，Ca2+，Mg2+，Co2+，Pb2+，Cd2+，Mn2+，Fe3+，Fe2+，Zn2+)溶液中，进行差示脉冲伏安扫描如图8，Cu2+浓度为4μM，各金属离子的浓度均为10μM。100mV处未观察到明显的峰电流响应，而360mV处的峰电流保持不变，这说明该传感器对抗各种其他金属离子，具有对Cu2+分析的专属性。
将该铜离子电化学传感器分别置于Cu2+和各种氨基酸(组氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，缬氨酸，蛋氨酸,甘氨酸,酷氨酸,色氨酸,苯丙氨酸,丝氨酸,精氨酸)溶液中，进行差示脉冲伏安扫描如图9，Cu2+浓度为4μM，各氨基酸的浓度均为10μM。100mV处未观察到明显的峰电流响应，而360mV处的峰电流保持不变，这说明该传感器对抗各种氨基酸，具有对Cu2+分析的专属性。
将该铜离子电化学传感器分别置于Cu2+和各种生物活性物质(多巴胺，抗坏血酸，尿酸，氧气，乳酸，葡萄糖和过氧化氢)溶液中，进行差示脉冲伏安扫描如图10，Cu2+浓度为4μM，各活性物质的浓度为多巴胺：10μM，抗坏血酸：100μM，尿酸：10μM，氧气：0.25mM，乳酸：1mM，葡萄糖：1mM，过氧化氢：1μM。100mV处未观察到明显的峰电流响应，而360mV处的峰电流保持不变，这说明该传感器对抗各种生物活性物质，具有对Cu2+分析的专属性。
实施例6
将铜离子电化学传感器与微透析活体取样系统联用，形成在线微透析活体取样-电化学传感器系统，如图3所示，测试再生-检测循环。循环五次，分别计算J/JR，如图11所示，Cu2+浓度为4μM，J为100mV处的峰电流密度，JR为360mV处的峰电流密度。五次循环测得的J/JR信号稳定，相对标准偏差为6.20％；而五次重复检测的J/JR信号逐渐下降，相对标准偏差为17.27％。这说明所述的电化学传感器具有良好的再生能力，可用于同一活体内Cu2+水平的多次循环检测。
实施例7
将铜离子电化学传感器与微透析活体取样系统联用平台用于大鼠在全脑缺血-再灌注病理模型过程中Cu2+水平的变化，如图12、13、14所示。三次测量分别为大鼠在正常状态、全脑缺血60分钟、再灌注60分钟时，灌流液为空白人工脑脊液。大鼠1三次测量Cu2+浓度分别为：1.01μM，3.44μM，1.09μM；大鼠2三次测量Cu2+浓度分别为：1.18μM，3.49μM，1.23μM；大鼠3三次测量Cu2+浓度分别为：2.43μM，6.95μM，2.38μM。这说明大鼠在全脑缺血情况下Cu2 +水平明显上升，一般上升2.8-3倍，进行再灌注后，Cu2+可恢复至正常水平。
为了确保传感器检测的信号为真实的Cu2+水平，将灌流液换成空白人工脑脊液加标准Cu2+2μM再测量第四只老鼠在全脑缺血-再灌注病理模型过程中Cu2+水平的变化，如图15所示。大鼠4三次测量Cu2+浓度分别为：3.46μM，8.73μM，3.51μM。在加入标准Cu2+2μM后，大鼠4的正常状态的Cu2+水平、全脑缺血病理状态的Cu2+水平和再灌注状态的Cu2+水平均有所上升，这说明所述的信号确实为Cu2+水平的真实反应。这从另一方面也说明了，所述的电化学传感器与微透析活体取样系统联用平台可实现活体在病理发生过程中Cu2+水平的连续监测。

Claims (9)

1.一种铜离子电化学传感器，其特征在于，由枝状聚乙烯亚胺修饰的工作电极、巯基二茂铁修饰的内参比单元组成，所述枝状聚乙烯亚胺修饰的工作电极用于铜离子的识别单元，与巯基二茂铁修饰的内参比单元共同组成可再生比率型传感器；
所述的由枝状聚乙烯亚胺修饰的工作电极，是将枝状聚乙烯亚胺修饰到GC电极1上，修饰后的电极标记为GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极；
所述的巯基二茂铁修饰的内参比单元，是将6-(二茂铁)六硫醇(FcHT)修饰到GC电极2上，修饰后的内参比单元标记为GC/Cys/Au/FcHT电极。
2.根据权利要求1所述铜离子电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以枝状聚乙烯亚胺为可再生识别单元，采用逐步化学反应将其共价修饰到GC电极1上，标记为GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极；
步骤二、以6-(二茂铁)六硫醇(FcHT) 为内置参比单元，采用逐步化学反应将其共价修饰到GC电极2上，标记为GC/Cys/Au/FcHT电极；
步骤三、将步骤一、步骤二中制备的电极共同组建可再生的比率型铜离子电化学传感器。
3.根据权利要求2所述铜离子电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，具体为：
1.1) 将GC电极1用0.01～0.1 μm的氧化铝在抛光布上抛光，并依次置于丙酮、硝酸、氢氧化钠和蒸馏水依次超声 1～10 min；其中硝酸的体积浓度为3:1～1:3，v/v；氢氧化钠的质量浓度为20%～60%，w/w；
1.2) 将步骤1.1)制备的电极在0.1～5 M的H2SO4中采用循环伏安法扫描至电流稳定，扫描电压范围从-1 V至+1 V，扫描速度0.1 V/s，用蒸馏水清洗；
1.3) 将步骤1.2)制备的电极依次浸泡于0.01～100 mM的半胱氨酸、0.5～100 mM的EDC、0.5～100 mM的NHS溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
1.4) 将步骤1.3)制备的电极浸泡于用柠檬酸三钠合成的金纳米颗粒溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
1.5) 将步骤1.4)制备的电极浸泡于0.01～100 mM的巯基丙酸溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
1.6) 将步骤1.5)制备的电极浸泡于0.1～100 mM的枝状聚乙烯亚胺、0.5～100 mM的EDC、0.5～100 mM的NHS溶液中2～24h，用蒸馏水清洗。
4.根据权利要求2所述铜离子电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，具体为：
2.1) 将GC电极2用0.01 ～0.1 μm的氧化铝在抛光布上抛光，并依次置于丙酮、硝酸、氢氧化钠和蒸馏水依次超声1-10 min；其中硝酸的体积浓度为3:1～1:3，v/v；氢氧化钠的质量浓度为20%～60%，w/w；
2.2) 将步骤2.1)制备的电极在0.1～5 M的H2SO4中采用循环伏安法扫描至电流稳定，扫描电压范围从-1 V至+1 V，扫描速度0.1 V/s，用蒸馏水清洗；
2.3) 将步骤2.2)制备的电极依次浸泡于0.01～100 mM的半胱氨酸、5～100 mM的EDC、5～100 mM的NHS溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
2.4) 将步骤2.3)制备的电极浸泡于用柠檬酸三钠合成的金纳米颗粒溶液中2～24h，用蒸馏水清洗；
2.5) 将步骤2.4)制备的电极浸泡于0.1～100 mM的巯基二茂铁溶液中1～12h，用蒸馏水清洗；
2.6) 将步骤2.5)制备的电极浸泡于0.01～100 mM的六巯基已硫醇溶液中1～12h，用蒸馏水清洗。
5.根据权利要求1所述铜离子电化学传感器的应用，其特征在于，将铜离子电化学传感器用于高灵敏高选择性地检测Cu2+。
6.根据权利要求5所述铜离子电化学传感器的应用，其特征在于，所述铜离子电化学传感器用于检测人工模拟脑脊液或者磷酸缓冲溶液中Cu2+浓度，包括以下步骤：
S1. 将铜离子电化学传感器置于含有4µM Cu2+的人工模拟脑脊液中，采用DPV方法进行扫描，扫描要求为：GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极的扫描范围为0.35 V 至-0.10 V；GC/Cys/Au/FcHT电极的扫描范围为0.55 V 至0 V，GC/Cys/Au/MPA/hPEI电极于100 mV处获得一个对应铜离子的还原峰，GC/Cys/Au/FcHT电极于360 mV处获得一个对应巯基二茂铁的还原峰；
S2. 将铜离子电化学传感器置于含有一系列浓度Cu2+的人工模拟脑脊液中，100 mV处的峰电流密度（J）随着Cu2+浓度的增加而增加，360 mV处的峰电流密度（JR）保持不变，通过计算，J与JR的比值与Cu2+的浓度成正比，以此为依据，定量地实现对Cu2+的检测。
7.根据权利要求5或6所述铜离子电化学传感器的应用，其特征在于，所述铜离子电化学传感器对其他金属离子，各种氨基酸和几种生物活性物质有较强的抗干扰能力；其他金属离子包括：Cu+，Ni2+，Ca2+，Mg2+，Co2+，Pb2+，Cd2+，Mn2+，Fe3+，Fe2+，Zn2+；各种氨基酸包括：组氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，缬氨酸，蛋氨酸, 甘氨酸, 酷氨酸, 色氨酸, 苯丙氨酸, 丝氨酸, 精氨酸；生物活性物质包括：多巴胺，抗坏血酸，尿酸，氧气，乳酸，葡萄糖和过氧化氢。
8.根据权利要求6所述铜离子电化学传感器的应用，其特征在于，将所述铜离子电化学传感器与微透析活体取样系统联用，形成在线微透析活体取样-电化学传感器系统，实现在线再生-检测循环。
9.根据权利要求8所述铜离子电化学传感器的应用，其特征在于，将所述在线微透析活体取样-电化学传感器系统用于大鼠在全脑缺血-再灌注病理事件中的Cu2+水平的连续检测。
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