CN109576064A - 从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法 - Google Patents

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孙继鹏
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Abstract

本发明涉及一种从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，步骤如下：对鱼油进行皂化处理，得皂化后的混合游离脂肪酸，采用尿素包和的方法，在有机溶剂中包和混合脂肪酸中的饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸，低温尿素结晶，分离出尿素包和固体，在有机溶剂或酸性溶剂中，或升高温度解包和作用，浓缩有机溶剂，得到饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的混合物，经过柱层析，分离得到反式棕榈油酸。本方法操作简单，从鱼油中分离制备得到反式棕榈油酸，是首次从鱼油中发现并分离得到反式棕榈油酸的方法。

Description

从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法
技术领域
本发明涉及一种从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法。
背景技术
棕榈油酸(Palmitoleic acid)是一种16碳的单不饱和脂肪酸(monounsaturatedfatty acid，MUFA)，双键位于碳端的第7个碳原子上(16:1,n-7)，近年来，棕榈油酸在一些慢性疾病如糖尿病、代谢综合症和炎症中具有治疗作用，引起人们广泛关注。顺式棕榈油酸在大多数动植物种均有分布，但含量较高的物种稀少，现其主要来源为沙棘果油，鱼油和一些海洋浮游生物，在鱼油中，棕榈油酸的含量约有15％～20％，可作为棕榈油酸的制备原料。
反式棕榈油酸是顺式棕榈油酸的同分异构体(顺反异构体)，近几年反式棕榈油酸在牛乳中被发现，具有调节糖脂代谢的作用，被当做II型糖尿病和冠心病的生物标志物。寻找其他含反式棕榈油酸物种，以便分离获得更多的反式棕榈油酸物种具有重要的经济意义和理论研究价值。
传统从鱼油中提取棕榈油酸的制备方法如中国专利申请CN105461539所报道的制备方法得到的棕榈油酸为顺式棕榈油酸。
发明内容
本发明的目的在于尝试采用不同制备方法，期望从鱼油、沙棘果油等天然原料中分离制备得到天然反式棕榈油酸。
本发明首次发现鱼油中含有反式棕榈油酸，而沙棘果油中并未检测到反式棕榈油酸的存在。分离制备反式棕榈油酸，用于深入研究反式棕榈油酸及顺反异构体的活性及作用机制的差异性，以及后期的开发利用具有重要的意义。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，包括以下步骤：
(1)皂化往鱼油中加入有机溶剂和碱，加热解离后，使得鱼油中的脂肪酸处于游离状态，再进行酸化处理，分离出油层部分，得到混合脂肪酸；
(2)尿素包和尿素及极性有机溶剂混合，加热溶解使澄清后加入混合脂肪酸，搅拌混匀，冷却至室温后，于0-20℃静置使结晶，0-20℃下离心或抽滤得尿素包和固体；
(3)解包和往尿素包和固体中加入酸溶液和酯类溶剂混合溶剂中，加热使解包和，脂肪酸游离至有机层，分离有机层，得到饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的混合物；
(4)柱层析采用柱层析的方法分离制备反式棕榈油酸，柱色谱条件为：固定相为300-400目硅胶，展开剂为石油醚与乙酸乙酯体积比为(10-20):1，上样样品与固定相比例为1:(20-35)，反式棕榈油酸HPLC纯度≥80％。
进一步地，步骤(1)为鱼油的皂化反应，其采用常规皂化方法即可，皂化反应采用有机溶剂可为常用有机溶剂醚类溶剂如四氢呋喃、酯类溶剂如乙酸乙酯、醇类溶剂如甲醇或乙醇等。所述鱼油(g)：有机溶剂(ml)：碱(g)的比例为1：(0.7-2)：(0.1-0.8)。
在一些实施例中，所述步骤(2)中尿素包和的具体步骤为：尿素与甲醇混合，比例为1g/(2-8)ml，加热30-60℃使澄清，将混合脂肪酸加入甲醇溶剂中，30-60℃状态下充分混合15-45min，冷却至室温，0-20℃冷藏4-15h后快速抽滤，得到尿素包和固体；
在一些实施例中，步骤3)中所述尿素包和固体与混合溶剂的比例为1:(0.2-4)(g:ml)；
在一些实施例中，步骤3)中所述酸溶液为甲酸溶液、醋酸溶液或者盐酸溶液，所述酸溶液的质量分数为0.5％-5％；所述酯类溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸叔丁酯；所述酯类溶剂与水的比例为(1-2):1。
在一些实施例中，所述步骤(4)中柱层析的具体步骤为：采用硅胶柱层析，选用300-400目硅胶，展开剂为石油醚和乙酸乙酯，比例为(10-20):1，上样样品：固定相为1:(25-35)，采用不同比例的展开剂洗脱，收集洗脱液，浓缩得到油状物。
分析鉴定上述浓缩得到油状物，采用气相色谱-质谱联用技术，液相色谱-质谱联用技术，以及标准品进行鉴定，采用气相色谱及液相色谱法对油状物进行分析定量。
采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱为BDS hypersil C18，100*4.6mm，2.4um，流动相为乙腈:水＝8:2，流速为1ml/min，出峰时间为4.91-5.19min。
采用超高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱为BDS hypersil C18，100*2.1mm，2.4um，流动相为乙腈:水＝8:2，流速为0.4ml/min，出峰时间为3.00-3.25min。
经过比对反式棕榈油酸标准品保留时间，发现本发明制备的油状物与反式棕榈油酸标准品保留时间一致，推定所制备的油状物为反式棕榈油酸。
采用甲酯化后气相色谱分析定量反式棕榈油酸的含量，色谱条件：色谱柱选用毛细管柱Supelco SPTM-2560 100*0.25mm*0.2um；升温方式：3-21.5min，120-190℃，21.5-82.5min，190-220℃，82.5-98min，220-240℃。
本发明提供了一种从鱼油中分离制备得到天然的反式棕榈油酸的方法。该方法具有以下优势及优点：
1.该方法首次从鱼油中分离得到顺式棕榈油酸的同分异构体，反式棕榈油酸，本方法分离制备的反式棕榈油酸纯度≥80％。
2.该方法操作简单，成本低廉，不需要购买昂贵的仪器设备，如采用分子蒸馏等也可制备高纯度的反式棕榈人油酸。
3.该方法采用尿素包和法和柱层析法，成本低廉，均可回收重复使用，适用于实验室及工业化生产。
4.鱼油产品在我国大量开发生产，尿素包和溶剂部分是多不饱和脂肪酸，可用于制备DHA等，同样，在制备多不饱和脂肪酸的同时，该方法可同时应用于制备单不饱和脂肪酸混合物或者顺式及反式棕榈油酸，可用于联合生产鱼油制品，或者作为多不饱和脂肪酸的附加值产品。
本发明上下文中，液体与液体之间的比例均为体积比；固体与液体或液体与固体直接的比例为质量体积比，单位为g/ml。
附图说明
图1为顺/反棕榈油酸标准品液相色谱图，其中保留时间4.631处为顺式棕榈油酸，保留时间5.094处为反式棕榈油酸，对照品采购于NU-CHEK公司；
图2为实施例1步骤4柱层析浓缩之后透明油状物的液相色谱图；其中保留时间4.685处为顺式棕榈油酸，4.941处为反式棕榈油酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例一：
从鱼油中分离制备并鉴定反式棕榈油酸的方法，步骤如下：
(1)皂化 采用碱性皂化方法对鱼油进行皂化处理，使用甲醇和氢氧化钠，加热解离，鱼油(g)：甲醇(ml)：氢氧化钠(g)＝1：0.7：0.2，80℃水浴搅拌回流2h，使样品中的脂肪酸处于游离状态，再进行酸化处理，盐酸调节pH＝2-3，搅拌15min使其充分酸化，分离出油层部分，得到混合脂肪酸。
(2)尿素包和 尿素及常用极性有机溶剂甲醇或者乙醇混合，加热40℃溶解使澄清，加入混合脂肪酸，搅拌30min使混匀，冷却至室温后，低温4℃静置6h使结晶，低温抽滤得尿素包和固体，用预冷的甲醇或乙醇冲洗，或者低温离心去除上清，得到尿素包和固体。
(3)解包和 尿素包和固体加入乙酸乙酯，比例为1：0.2(g:ml)，乙酸乙酯与水的比例为1:1。40℃加热回流30min，冷却至室温，离心或静置，分离乙酸乙酯层，浓缩回收溶剂，得饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的混合物。
(4)柱层析 采用柱层析的方法分离制备得到反式棕榈油酸，纯度≥80％。具体可以如下：采用硅胶柱层析，展开剂：石油醚-乙酸乙酯，比例12:1冲洗一个柱体积，15:1冲洗2个柱体积，收集洗脱液，浓缩，得到透明油状物。
(5)分析鉴定：采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱为BDS hypersil C18，100*4.6mm，2.4um，流动相为乙腈:水＝8:2，流速为1ml/min，出峰时间为4.91-5.19。
实施例二：
从鱼油中分离制备并鉴定反式棕榈油酸的方法，步骤如下：
(1)皂化 采用碱性皂化方法对鱼油进行皂化处理，使用乙醇加氢氧化钠，加热解离，鱼油：有机溶剂：碱＝1：2：0.5，80℃水浴搅拌回流1.5h，使样品中的脂肪酸处于游离状态，再进行酸化处理，盐酸调节pH＝2-3，搅拌30min使其充分酸化，分离出油层部分，得到混合脂肪酸。
(2)尿素包和 尿素1g及乙醇6ml混合，加热60℃溶解使澄清，加入混合脂肪酸，搅拌15min使混匀，冷却至室温后，低温4℃静置15h使结晶，低温抽滤得尿素包和固体，用预冷的甲醇或乙醇冲洗，或者低温离心去除上清，得到尿素包和固体。
(3)解包和 尿素包和固体加入乙酸乙酯及3％甲酸水溶液，尿素与乙酸乙酯的比例为1:4(g:ml)，乙酸乙酯与3％甲酸水溶液的体积比为1:1，60℃加热回流15min，冷却至室温，离心或静置，分离乙酸乙酯层，浓缩回收溶剂，得饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的混合物。
(4)柱层析 采用柱层析的方法分离制备得到反式棕榈油酸，纯度≥80％。具体可以如下：采用硅胶柱层析，展开剂：石油醚-乙酸乙酯，比例10:1冲洗一个柱体积，20:1冲洗2个柱体积。
(5)分析鉴定：采用液相色谱法，色谱条件：色谱柱为BDS hypersil C18，100*4.6mm，2.4um，流动相为乙腈:水＝8:2，流速为1ml/min，出峰时间为4.91-5.19min。

Claims (7)

1.从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)皂化往鱼油中加入有机溶剂和碱，加热解离后，使得鱼油中的脂肪酸处于游离状态，再进行酸化处理，分离出油层部分，得到混合游离脂肪酸；
(2)尿素包和尿素及醇类溶剂混合，加热溶解使澄清后加入混合脂肪酸，搅拌混匀，冷却至室温后，于0-20℃静置使结晶，0-20℃下离心或抽滤得尿素包和固体；
(3)解包和往尿素包和固体中加入酸溶液和酯类溶剂混合溶剂，加热使解包和，脂肪酸游离至有机层，分离有机层，得到饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的混合物；
(4)柱层析采用柱层析的方法分离制备反式棕榈油酸，柱色谱条件为：固定相为300-400目硅胶，展开剂为石油醚与乙酸乙酯体积比为(10-20):1，上样样品与固定相质量比为1:(20-35)，收集洗脱液，浓缩得到透明油状物。
2.根据权利要求1所述从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，其特征在于，在步骤(1)中所述鱼油：有机溶剂：碱的重量体积比例g:ml：g为1：(0.7-2)：(0.1-0.8)。
3.根据权利要求1所述从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中尿素包和的具体步骤为：
尿素与甲醇混合，重量体积比例g:ml为1:(2-8)，加热30-60℃使澄清，将混合脂肪酸加入甲醇溶剂中，30-60℃状态下充分混合15-45min，冷却至室温，0-20℃冷藏4-15h后快速抽滤，得到尿素包和固体。
4.根据权利要求1所述从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，其特征在于，步骤3)中所述尿素包和固体与混合溶剂的比例为1:(0.2-4)(g:ml)。
5.根据权利要求1所述从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，其特征在于，步骤3)中所述酸溶液为甲酸溶液、醋酸溶液或者盐酸溶液，所述酸溶液的质量分数为0.5％-5％；所述酯类溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸叔丁酯；所述酯类溶剂与水的体积比为(1-2):1。
6.根据权利要求1所述从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，其特征在于，所述步骤(4)中柱层析的具体步骤为：采用硅胶柱层析，选用200-300目硅胶，展开剂为石油醚和乙酸乙酯，比例为(10-20):1，上样样品与固定相之间的重量比为1:(20-35)。
7.根据权利要求6所述从鱼油中分离制备反式棕榈油酸的方法，其特征在于，所述展开剂为石油醚与乙酸乙酯的体积比为12:1冲洗一个柱体积，接着15:1至20:1冲洗2个柱体积。
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