CN109568251A - 一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶及其制备和应用 - Google Patents

一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶及其制备和应用。该凝胶包括叶酸、DTPA‑Gd复合物、1,3‑丙烷磺酸内酯、硫化铜和聚乙烯亚胺纳米凝胶。该制备方法包括：聚乙烯亚胺纳米凝胶制备，钆、叶酸和两性离子修饰的聚乙烯亚胺纳米凝胶复合物制备，负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶制备。该凝胶尺寸分布均匀，具有良好的溶液分散性和细胞相容性，同时显著提高了r1弛豫率，具有优良的光热转换效率，在MR成像以及PTT领域具有潜在的应用价值。

Description

一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶及其制备和应用
技术领域
本发明属于纳米诊疗剂及其制备和应用领域，特别涉及一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
磁共振(MR)成像技术是七十年代发展起来的一种先进医学成像诊断技术，已广泛用于人体多种疾病的检测和早期诊断。MR成像具有较高的分辨率，较高的空间和断层成像能力，无放射引起的电离损害，同时可获得解剖及生理信息，具有其他医学成像无可比拟的优点。MR成像在疾病监测领域发挥越来越重要的作用。但MR成像的弱点是其敏感性较低，而且不同器官或肿瘤组织的弛豫时间相互重叠使MR成像诊断困难。近年来，通过注射MR成像造影剂的方法可以有效解决MR成像敏感性较低的问题，显著提高成像的对比度和清晰度。因此选择合适的MR造影剂就显得尤为重要。热疗(Hyperthermia)是近年来癌症治疗领域的研究热点之一。热疗的理论基础是肿瘤细胞比正常细胞对高温更敏感。它主要利用一些物理的能量转换，使得肿瘤部位的温度升高，而高温则能造成癌细胞各种质膜的破裂并影响DNA复制等生物学活动，进而杀死癌细胞，以达到治疗的目的。相比贵金属纳米颗粒(金，银，铂)，碳类材料(石墨烯，碳纳米棒)，有机染料物质(吲哚菁绿)及导电高分子材料(聚苯胺，聚吡咯)，硫化铜(CuS)作为一种典型的铜基半导体纳米材料，它具有优异的光热稳定性和较高的消光系数，同时还具备天然的降解性能。因此，CuS作为光热转换材料应用于癌症的光热治疗近年来得到了快速发展。
通过诊疗一体化实现肿瘤的精准诊断和高效治疗一直是现代医学关注和追求的重要目标。实现诊疗一体化，有利于在癌症治疗过程中，运用影像诊断的方法精确定位病灶，监测疗效。毫无疑问，实现癌症临床的诊疗一体化，有利于达到癌症治疗最佳效果，并减少毒副作用。
纳米技术的发展给癌症的诊疗带来了福音，越来越多的纳米载体，例如胶束、纳米凝胶和树状大分子等，已经被广泛地运用于构建兼具诊断与治疗功能的纳米载体上。其中纳米凝胶(NGs)这类载体在生物医学领域的各个方面，特别是药物传递、肿瘤诊断和组织工程领域，表现出极大的应用潜力。纳米凝胶是由亲水性或两亲性的高分子链通过物理或者化学交联的方式组成的三维网状结构的水凝胶颗粒，它是一种纳米尺度的软体材料。纳米凝胶具有许多优良的特性，如良好的胶体稳定性、生物相容性、高负载能力、易于多功能化、易被细胞吞噬、易进入肿瘤组织等，促进了其在生物医学领域中的应用。同时有文献报道表明，以纳米凝胶作为载体负载MR成像造影元素，可显著提高r1或r2弛豫率(J.Mater.Res.2014,29(15),1626-1634；Biomater.Sci.2016,4(10),1422-1430)。超支化PEI是商业上广泛使用的一种高分子聚合物，超支化PEI由于表面含有丰富的氨基，因此其可以进行各种功能化修饰，实现不同的功效，因此其在生物医学领域能够有良好的应用。
检索国内外文献尚没有发现关于聚乙烯亚胺纳米凝胶负载钆和硫化铜纳米颗粒的制备及其用于肿瘤MR成像/光热治疗(photothermal therapy，PTT)的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶及其制备方法和应用，以克服现有技术中纳米诊疗剂效果不佳的缺陷。
本发明的一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶，所述凝胶包括：叶酸、DTPA-Gd复合物、1,3-丙烷磺酸内酯1,3-PS、硫化铜和聚乙烯亚胺纳米凝胶，其中叶酸、DTPA-Gd复合物、1,3-丙烷磺酸内酯1,3-PS均通过化学键合修饰在聚乙烯亚胺纳米凝胶的表面，硫化铜原位负载在纳米凝胶内部。
所述凝胶PEI、Gd、FA、1,3-PS的摩尔比为1:15～25:2～4:25～35。
本发明的一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将聚乙烯亚胺PEI和N,N-亚甲基双丙烯酰胺BIS以摩尔比为1:15～1:25溶解于水中，混合搅拌，将得到的溶液逐滴加入Span 80溶液中，再次搅拌，将得到的W/O聚合物乳液超声破碎，得到的乳液中滴加三乙胺，搅拌过夜，离心，将得到的下层用溶剂分散，透析，得到聚乙烯亚胺纳米凝胶PEI NGs，其中PEI、Span 80和三乙胺的摩尔比为1:250～350:800～900；
(2)将DTPA-Gd复合物溶液加入到步骤(1)中PEI NGs的溶液中，反应，加入FA-PEG-NHS，继续反应，加入1,3-丙烷磺酸内酯1,3-PS，搅拌，得到钆、叶酸和两性离子修饰的聚乙烯亚胺纳米凝胶复合物FA:Gd@b-PEI NGs，其中PEI NGs、DTPA-Gd复合物中Gd、FA-PEG-NHS中FA、和1,3-PS的摩尔比为1:15-25:2-4:25-35；
(3)将氯化铜溶液加入步骤(2)中FA:Gd@b-PEI NGs的溶液中，搅拌，加入硫化钠溶液，继续搅拌，反应，得到负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶FA:CuS:Gd@b-PEI NGs；其中FA:Gd@b-PEI NGs、氯化铜和硫化钠的摩尔比为1:15-20:85-95。
所述步骤(1)中混合搅拌时间为10～20min；再次搅拌时间为20～40min。
所述步骤(1)中超声破碎时间为2～3min。
所述步骤(1)中Span 80溶液浓度为10-30mg/mL，溶剂为甲苯。
所述步骤(1)中搅拌转速为800～1500rpm；离心转速为8000～20000rpm。
所述步骤(1)中溶剂为甲醇。
所述步骤(1)中透析是采用截留分子量为8-14kDa透析袋。
所述步骤(2)中DTPA-Gd复合物的制备方法包括：将金属螯合剂二乙烯基三胺基五乙酸二酐DTPA与六水硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O的水溶液混合搅拌10～15h，即得；其中DTPA与Gd(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:1.6～2.2。
所述步骤(2)中FA-PEG-NHS的制备方法包括：取叶酸FA溶于二甲基亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化2～4h，加入NH2-PEG-COOH反应2～4d，透析冻干，得到FA-PEG-COOH；其中FA、EDC、NHS和NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:0.6～1:0.6～1:2～3；将得到的FA-PEG-COOH溶于超纯水中，加入EDC和NHS活化2～4h，得到FA-PEG-NHS。
所述步骤(2)中反应时间为10～15h；继续反应时间为2～4d。
所述步骤(2)中搅拌时间为2～4h。
所述步骤(3)中搅拌温度为室温，搅拌时间为20～40min。
所述步骤(3)中继续搅拌温度为室温，时间为4～6min。
所述步骤(3)中反应温度为50～70℃，反应时间为1～2h。
本发明的一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶的应用。例如，用于肿瘤的MR成像和PTT，体现出增强的体外、体内成像效果和优良的体内治疗效果。
本发明通过反相微乳液的方法制备合成聚乙烯亚胺(PEI)纳米凝胶，然后凝胶表面修饰DTPA-Gd络合物、叶酸和两性离子1,3-丙烷磺酸内酯(1,3-PS)，最后，将制备的FA:Gd@b-PEI NGs作为纳米反应器，原位制备合成硫化铜纳米颗粒，最终得到FA:CuS:Gd@b-PEINGs。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、场发射扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、磁共振(MR)成像分析、体外升温和体外、体内光热成像性能评价等手段表征制备的负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶(FA:CuS:Gd@b-PEINGs)。然后利用CCK-8法评价纳米凝胶的细胞毒性，最后进行裸鼠体内肿瘤模型的MR/红外热成像，以及光热治疗实验，考察FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的成像和治疗效果。此外，通过组织分布实验研究FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在动物体内的代谢情况。具体测试结果如下：
1.Zeta电势及水动力学直径测试结果
Zeta电势测定结果(见表1)表明PEI NGs的表面电势为+53.3mV，水动力学直径为532.7nm。FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的表面电势大大降低(+10.2)，同时水动力直径也减小为258.5nm。证明了硫化铜的成功上载。FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在各溶液中的水动力直径几乎不变(见图2)，表明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs具有良好的胶体稳定性。
2.FTIR光谱测试结果
如FTIR光谱测试结果(见图3)所示，PEI NGs以及FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的谱图中1651cm-1出现了新的吸收峰，说明了来自交联剂BIS的C＝O弯曲振动的存在，说明BIS与PEI成功发生了交联。1591cm-1处出现增强的吸收峰以及1035和1148cm-1处出现的吸收峰分别表明了FA中苯环和1,3-PS中硫氧双键的存在。进一步说明了FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的成功制备。
3.UV-Vis光谱测试结果
通过测定FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的UV-Vis图谱(见图4)，结果表明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在980nm及之后都有较强吸收，表明CuS纳米颗粒在水凝胶中的成功合成。
4.SEM和TEM测试结果
通过SEM观察PEI NGs的形态(见图5)，结果表明PEI NGs形态均匀，平均粒径约为480nm，TEM结果(见图6)显示，原位合成硫化铜纳米颗粒以后，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的形态接近球形，且尺寸减小为85nm，可观察到CuS纳米颗粒均匀分散在凝胶中。
5.磁共振(MR)分析结果
通过ICP-AES测试法测定FA:CuS:Gd@b-PEI NGs中Gd和Cu元素的含量。分别配制浓度为0.05，0.1，0.2，0.3和0.4mM的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs及临床钆剂马根维显的水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Gd浓度下的T1弛豫效应(如图7)。通过计算后得出FA:CuS:Gd@b-PEI NGs和临床钆剂马根维显的r1值分别为11.66和4.56mM-1s-1，测试结果显示FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的r1值是马根维显的2.56倍，表明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs可以作为MR分子影像诊断中的优良T1阳性造影剂。
6.体外升温效果评价
在EP管中配制不同浓度的500μL FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液([Cu]＝0.75，0.9，1.05，1.2和1.5mM)，以等体积的水作对照，用1064nm的激光器照射，输出功率密度为0.6W/cm2，照射时间为5min，每5秒钟记录一次温度示数(见图8a)。随后对浓度为1.5mM的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液用不同输出功率(0.2，0.4，0.6和0.8W/cm2)的1064nm激光器照射5min，每5秒钟记录一次温度示数(见图8b)。同时，对溶液循环照射4次，观测材料的循环升温效应(见图8c)。测试结果表明，在1064nm激光照射，同一输出功率密度0.6W/cm2下，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的升温效应随着浓度增加而增加。在浓度为1.5mM时，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的温度升高了35.6℃，而水的温度只升高了4.6℃。同时，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的升温效应也和激光照射的功率密度相关。随着激光功率密度的增加，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液的温度也随之增加。同时，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液表现出了良好的循环升温效应。
7.细胞活力评价
收集对数生长期KB细胞，按照1×104细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育24小时。弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL含不同浓度的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs(最终NG浓度为12.5、25、50、100、200、300μg/mL)或纯PBS(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24和48小时。随后弃掉原培养基，加入含10μLCCK-8的新鲜培养基溶液，继续培养2h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图9所示。与PBS对照组相比，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在试验浓度范围内对KB细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在80％以上，说明FA:CuS:Gd@b-PEINGs具有良好的细胞相容性。
8.体外细胞光热消融结果
将1×104KB细胞种在96孔板上，分别加入不含FA的DMEM培养基和含5μM FA的DMEM培养基，培养过夜，分别标记为KB-HFAR细胞和KB-LFAR细胞。然后加入含PBS或FA:CuS:Gd@b-PEI NGs(最终NG浓度为25、50、100、300μg/mL)的培养基再培养4h。此时KB-HFAR细胞和KB-LFAR细胞用PBS溶液洗涤3次，加入新的培养基，接着用1064nm的激光器照射(输出功率密度0.6W/cm2)，用未作任何处理的细胞作对照组，照射后继续培养2h。接着每孔加入10μLCCK-8和90μL的DMEM，然后继续在5％CO2，37℃条件下孵育4小时。之后置于酶标仪中，测定每孔在450nm处的吸光值，通过采集到的数据计算细胞消融情况。结果显示(见图10)，没有激光照射的细胞能够保持良好的生存能力。在激光照射5min后，细胞活力随着NG浓度的升高而降低。当NG浓度达到50μg/mL时，对于KB-HFAR细胞，仍然有60％左右的细胞保持活力，对于KB-LFAR细胞，有82％左右的细胞保持活力。当NG浓度达到100μg/mL时，只有12.3％的KB-HFAR细胞保持活力，而对于KB-LFAR细胞，依然有51.6％的细胞保持活力。研究结果表明，对于KB-HFAR细胞，本发明制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs可以作为良好的光热转换剂来消融癌细胞。
9.体内肿瘤MR成像结果
在裸鼠体内构建KB皮下瘤模型，通过尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Gd]＝10mM)来评价肿瘤部位MR成像效果(参见附图1)。如图1a和1b所示，与对照组(肿瘤用FA预处理)相比较，在注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs 60min后，小鼠肿瘤部位的MR信号达到最强，且ΔSNR为13.28，远大于对照组(ΔSNR为4.45)。说明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在荷瘤鼠体内有良好的肿瘤靶向效果，可以作为造影剂应用于体内肿瘤成像。
10.体内肿瘤光热治疗效果
在裸鼠体内构建KB皮下瘤模型，随后将小鼠分为六组(每组五只)：尾静脉注射生理盐水(100μL)没有激光照射(组1)；尾静脉注射生理盐水(100μL)并暴露在1064nm激光照射(0.6W/cm2)下10min(组2)；瘤内注射100μL FA溶液(5μM)，1h后通过尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，没有激光照射(组3)；尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，没有激光照射(组4)；瘤内注射100μL FA溶液(5μM)，1h后通过尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，1h后用1064nm激光照射10min(组5)；尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，1h后用1064nm激光照射10min(组6)；通过实验结果发现，第6组小鼠的肿瘤在光照处理后的八天内，肿瘤逐渐变小，直至消失。第5组的小鼠肿瘤在光照处理后4天内生长趋势受到了抑制，4天后，肿瘤生长速度加快。同时，第1-4组的小鼠肿瘤在进行处理后，肿瘤依然呈现出快速生长的趋势(图11a)。通过监测小鼠的体重变化，发现小鼠并未出现较大体重变化(图11b)。说明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs具有良好的光热治疗效果，并且不会产生明显副作用。
11.体内组织分布结果
随后构建KB肿瘤模型裸鼠来研究FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在生物体内各组织的分布代谢情况。向裸鼠尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，分别在注射1、12、24、48h后，处死小鼠，取出各个主要器官和肿瘤部位并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水浸泡2天，用ICP-AES测定各个组织样品中Cu的含量。如图12所示，注射后，24h内，肝脏和脾脏中Cu的含量随时间增加逐渐增高，24h后Cu的含量降低，肺和肿瘤中Cu的含量逐渐减少，肾脏中Cu的含量在12h达到最高，随后逐渐减少。说明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在小鼠体内能被正常代谢清除。
有益效果
(1)本发明工艺十分简单，易于操作分离，同时原料来源广泛，具有良好的发展应用前景。
(2)制备的聚乙烯亚胺纳米凝胶尺寸分布均匀，具有良好的溶液分散性和细胞相容性。同时显著提高了r1弛豫率，具有优良的光热转换效率，在MR成像以及PTT领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例7中将实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Gd]＝10mM)经尾静脉注射前和注射后不同时间点小鼠肿瘤的MR成像图(a)，相应的肿瘤部位信噪比变化(b)。
图2为实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs样品在不同溶液中的水动力学直径变化图。
图3为PEI，实施例1制备的PEI NGs以及FA:CuS:Gd@b-PEI NGs样品的FT-IR图。
图4为实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs样品的UV-Vis图。
图5为实施例1制备的PEI NGs样品的SEM图。
图6为实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs样品的TEM图。
图7为实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs及临床钆剂马根维显的T1弛豫时间的倒数随Gd浓度变化的线性关系图。
图8为实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在不同样品浓度，同一功率密度(a)，同一样品浓度，不同功率密度(b)的1064nm激光照射下的温度变化图和FA:CuS:Gd@b-PEINGs在1064nm，输出功率密度为0.6W/cm-1的激光单个和连续四个循环照射下的温度变化图(c和d)。
图9为实施例5中KB细胞经实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs(NG浓度为6.25、12.5、25、50、100、200和300μg/mL)和纯PBS处理24和48h后的CCK-8细胞活力分析结果图。
图10为实施例6中叶酸高表达和叶酸低表达的KB细胞经实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs处理4h，随后经过激光或无激光处理后的CCK-8细胞活力分析结果图。
图11为实施例8中分别将生理盐水、实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)经尾静脉注射1h后，在肿瘤部位进行1064nm激光照射和无激光照射处理的24天内肿瘤的体积(a)和体重(b)变化图。
图12为实施例9中尾静脉注射实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)后不同时间点，Cu元素在小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤的组织分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取272mg聚乙烯亚胺(PEI)和32mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶解于5mL超纯水中混合搅拌15min，然后逐滴加入到60mL Span 80的甲苯溶液(20mg/mL)中，1000rpm搅拌30min，初步形成W/O乳液，然后将该W/O乳液置于超声破碎仪中超声2min，随后滴加1.2mL三乙胺并继续1000rpm搅拌过夜。之后，将W/O乳液12000rpm离心15min后，去上清，取沉淀用15mL甲醇重新分散后置于8-10kDa透析袋中透析3d，得到PEI NGs。
(2)将27.5mg FA溶于5mL DMSO中，随后滴加3mL EDC的DMSO溶液(3.25mg/mL)和2mL NHS的DMSO溶液(3mg/mL)活化3h。随后将5mL NH2-PEG-COOH的DMSO溶液(10mg/mL)逐滴加入到上述活化好的溶液中，搅拌反应3d后，透析(PBS1d，超纯水2d)、冷冻干燥得到FA-PEG-COOH粉末备用。取40mg DTPA与101mg Gd(NO3)3·6H2O混合分散于6mL水中，搅拌反应12h，随后逐滴加入到15mL PEI NGs水溶液(9.4mg/mL)中，搅拌12h，得到Gd@PEI NGs溶液。取38mg FA-PEG-COOH粉末溶于13mL水中，加入1mL EDC的水溶液(2.6mg/mL)和1mL NHS的水溶液(1.6mg/mL)活化3h。随后将其加入到上述Gd@PEI NGs溶液，搅拌3d，得到FA:Gd@PEINGs溶液，再向其中加入1mL 1,3-PS水溶液(20.7mg/mL)，搅拌3h。得到FA:Gd@PEI NGs溶液。
(3)取3mL CuCl2·2H2O水溶液(10mg/mL)逐滴加入到步骤(2)中FA:Gd@PEI NGs溶液中，搅拌30min，随后逐滴加入1.5mL Na2S·9H2O溶液(121mg/mL)，室温搅拌反应5min后，将反应溶液移入60℃水浴锅中，加热搅拌反应1h，然后使用截留分子量8-10kDa的透析袋对水溶液透析2天(2L/次，3次/天)，即得负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶FA:CuS:Gd@b-PEI NGs。
实施例2
取实施例1制备的PEI NGs、FA:Gd@PEI NGs和FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液(500μg/mL)，用于测表面电势和水动力直径。测定结果(表1)表明，PEI NGs的表面电势为+53.3mV，水动力学直径为532.7nm。而FA:CuS:Gd@b-PEI NGs表现出了下降的表面电势(+10.2mV)和减小的水动力学直径(258.5nm)。证明了FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的成功合成。同时FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在各种溶液(水，盐水，PBS，DMEM)中的水动力直径几乎不变，证明了FA:CuS:Gd@b-PEI NGs具有良好的胶体稳定性。之后测定了实施例1制备的PEI NGs和FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的FTIR图谱(图3)，PEI NGs谱图中1651cm-1处出现的吸收峰说明了交联剂BIS中碳氧双键的存在。FA:CuS:Gd@b-PEI NGs谱图中1591cm-1处出现增强的吸收峰以及1035和1148cm-1处出现的吸收峰分别表明了FA中苯环和1,3-PS中硫氧双键的存在，进一步说明了FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的成功制备。通过测定实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的UV-Vis图谱(图4)，结果表明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在980nm及之后都有较强吸收，表明CuS纳米颗粒在水凝胶中的成功合成。随后通过SEM观察PEI NGs的形态(图5)，结果表明PEI NGs形态均匀，平均粒径约为480nm，TEM结果(图6)显示，原位合成硫化铜纳米颗粒以后，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的形态接近球形，且尺寸减小为85nm，可观察到CuS纳米颗粒均匀分散在凝胶中。
表1
样品 水动力学直径(nm) 多分散性指数(PDI) 表面电势(mV)
PEI NGs 532.7±3.22 0.248±0.08 53.3±1.55
FA:Gd@b-PEI NGs 554.2±4.37 0.376±0.11 42.6±1.73
FA:CuS:Gd@b-PEI NGs 258.5±6.54 0.421±0.06 10.2±2.31
实施例3
通过ICP-AES测试法测定实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs中Gd元素的含量。分别配制Gd浓度为0.05，0.1，0.2，0.3和0.4mM的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs及临床钆剂马根维显的水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Gd浓度下的T1弛豫效应(如图7)。经过计算得出FA:CuS:Gd@b-PEI NGs及临床钆剂马根维显的r1值分别为11.66和4.56mM-1s-1。FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的r1高于临床钆剂马根维显的r1值。说明实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs可以作为MR分子影像诊断中的优良T1阳性造影剂。
实施例4
在EP管中配制不同浓度的500μL FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液([Cu]＝0.75，0.9，1.05，1.2和1.5mM)，以等体积的水作对照，用1064nm的激光器照射，输出功率密度为0.6W/cm2，照射时间为5min，每5秒钟记录一次温度示数(见图8a)。随后对浓度为1.5mM的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液用不同输出功率(0.2，0.4，0.6和0.8W/cm2)的1064nm激光器照射5min，每5秒钟记录一次温度示数(见图8b)。同时，对溶液循环照射4次，观测材料的循环升温效应(见图8c)。测试结果表明，在1064nm激光照射，同一输出功率密度0.6W/cm2下，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的升温效应随着浓度增加而增加。在浓度为1.5mM时，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的温度升高了35.6℃，而水的温度只升高了4.6℃。同时，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的升温效应也和激光照射的功率密度相关。随着激光功率密度的增加，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液的温度也随之增加。同时，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs溶液表现出了良好的循环升温效应。
实施例5
收集对数生长期KB细胞，按照1×104细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育24小时。弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL含不同浓度的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs(最终NG浓度为12.5、25、50、100、200、300μg/mL)或纯PBS(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24和48小时。随后弃掉原培养基，加入含10μL CCK-8的新鲜培养基溶液100μL，继续培养2h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值，结果如图9所示。与PBS对照组相比，FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在试验浓度范围内对KB细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在80％以上，说明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs具有良好的生物相容性。
实施例6
将1×104KB细胞种在96孔板上，分别加入不含FA的DMEM培养基和含5μM FA的DMEM培养基，培养过夜，分别标记为KB-HFAR细胞和KB-LFAR细胞。然后加入含PBS或FA:CuS:Gd@b-PEI NGs(最终NG浓度为25、50、100、300μg/mL)的培养基再培养4h。此时KB-HFAR细胞和KB-LFAR细胞用PBS溶液洗涤3次，加入新的培养基，接着用1064nm的激光器照射(输出功率密度0.6W/cm2)，用未作任何处理的细胞作对照组，照射后继续培养2h。接着每孔加入10μLCCK-8和90μL的DMEM，然后继续在5％CO2，37℃条件下孵育4小时。之后置于酶标仪中，测定每孔在450nm处的吸光值，通过采集到的数据计算细胞消融情况。结果显示(见图10)，没有激光照射的细胞能够保持良好的生存能力。在激光照射5min后，细胞活力随着NG浓度的升高而降低。当NG浓度达到50μg/mL时，对于KB-HFAR细胞，仍然有60％左右的细胞保持活力，对于KB-LFAR细胞，有82％左右的细胞保持活力。当NG浓度达到100μg/mL时，只有12.3％的KB-HFAR细胞保持活力，而对于KB-LFAR细胞，依然有45.6％的细胞保持活力。研究结果表明，对于KB-HFAR细胞，本发明制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs可以作为良好的光热转换剂来消融癌细胞。
实施例7
在裸鼠体内构建KB皮下瘤模型，通过尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Gd]＝10mM)来评价肿瘤部位MR成像效果(参见附图1)。如图1a和1b所示，与对照组(肿瘤用FA预处理)相比较，在注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs 60min后，小鼠肿瘤部位的MR信号达到最强，且ΔSNR为13.28，远大于对照组(ΔSNR为4.45)。说明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在荷瘤鼠体内有良好的肿瘤靶向效果，可以作为造影剂应用于体内肿瘤成像。
实施例8
以实施例7构建的KB肿瘤模型裸鼠来研究实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在生物体内的肿瘤光热治疗效果，随后将小鼠分为六组(每组五只)：尾静脉注射生理盐水(100μL)没有激光照射(组1)；尾静脉注射生理盐水(100μL)并暴露在1064nm激光照射(0.6W/cm2)下10min(组2)；瘤内注射100μL FA溶液(5μM)，1h后通过尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，没有激光照射(组3)；尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，没有激光照射(组4)；瘤内注射100μL FA溶液(5μM)，1h后通过尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，1h后用1064nm激光照射10min(组5)；尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，1h后用1064nm激光照射10min(组6)；通过实验结果发现，第6组小鼠的肿瘤在光照处理后的八天内，肿瘤逐渐变小，直至消失。第5组的小鼠肿瘤在光照处理后4天内生长趋势受到了抑制，4天后，肿瘤生长速度加快。同时，第1-4组的小鼠肿瘤在进行处理后，肿瘤依然呈现出快速生长的趋势(图11a)。通过监测小鼠的体重变化，发现小鼠并未出现较大体重变化(图11b)。说明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs具有良好的光热治疗效果，并且不会产生明显副作用。
实施例9
以实施例7构建的KB肿瘤模型裸鼠来研究实施例1制备的FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在生物体内各组织的分布代谢情况。向裸鼠尾静脉注射FA:CuS:Gd@b-PEI NGs的PBS溶液(100μL，[Cu]＝15mM)，分别在注射1、12、24、48h后，处死小鼠，取出各个主要器官和肿瘤部位并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水浸泡2天，用ICP-AES测定各个组织样品中Cu的含量。如图12所示，注射后，24h内，肝脏和脾脏中Cu的含量随时间增加逐渐增高，24h后Cu的含量降低，肺和肿瘤中Cu的含量逐渐减少，肾脏中Cu的含量在12h达到最高，随后逐渐减少。说明FA:CuS:Gd@b-PEI NGs在小鼠体内能被正常代谢清除。

Claims (10)

1.一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶，其特征在于，所述凝胶包括：叶酸、DTPA-Gd复合物、1,3-丙烷磺酸内酯1,3-PS、硫化铜和聚乙烯亚胺纳米凝胶，其中叶酸、DTPA-Gd复合物和1,3-丙烷磺酸内酯1,3-PS均通过化学键合修饰在聚乙烯亚胺纳米凝胶的表面，硫化铜原位负载在纳米凝胶内部。
2.根据权利要求1所述凝胶，其特征在于，所述凝胶PEI、Gd、FA、1,3-PS的摩尔比为1:15～25:2～4:25～35。
3.一种负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)将聚乙烯亚胺PEI和N,N-亚甲基双丙烯酰胺BIS以摩尔比为1:15～1:25溶解于水中，混合搅拌，将得到的溶液逐滴加入Span 80溶液中，再次搅拌，将得到的W/O聚合物乳液超声破碎，滴加三乙胺，搅拌过夜，离心，将得到的下层用溶剂分散，透析，得到聚乙烯亚胺纳米凝胶PEI NGs，其中PEI、Span 80和三乙胺的摩尔比为1:250～350:800～900；
(2)将DTPA-Gd复合物溶液加入到步骤(1)中PEI NGs的溶液中，反应，加入FA-PEG-NHS，继续反应，加入1,3-丙烷磺酸内酯1,3-PS，搅拌，得到钆、叶酸和两性离子修饰的聚乙烯亚胺纳米凝胶复合物FA:Gd@b-PEI NGs，其中PEI NGs、DTPA-Gd复合物中Gd、FA-PEG-NHS中FA和1,3-PS的摩尔比为1:15-25:2-4:25-35；
(3)将氯化铜溶液加入步骤(2)中FA:Gd@b-PEI NGs的溶液中，搅拌，加入硫化钠溶液，继续搅拌，反应，得到负载钆和硫化铜的聚乙烯亚胺纳米凝胶FA:CuS:Gd@b-PEI NGs；其中FA:Gd@b-PEI NGs、氯化铜和硫化钠的摩尔比为1:15-20:85-95。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合搅拌时间为10～20min；再次搅拌时间为20～40min；超声破碎时间为2～3min；Span 80溶液浓度为10～30mg/mL，溶剂为甲苯。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中搅拌转速为800～1500rpm；离心转速为8000～20000rpm；透析是采用截留分子量为8-14kDa透析袋。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中DTPA-Gd复合物的制备方法包括：将金属螯合剂二乙烯基三胺基五乙酸二酐DTPA与六水硝酸钆Gd(NO3)3·6H2O的水溶液混合搅拌10～15h，即得；其中DTPA与Gd(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:1.6～2.2。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中FA-PEG-NHS的制备方法包括：将叶酸FA溶于二甲基亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化2～4h，加入NH2-PEG-COOH反应2～4d，透析冻干，得到FA-PEG-COOH，其中FA、EDC、NHS和NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:0.6～1:0.6～1:2～3；将得到的FA-PEG-COOH溶于超纯水中，加入EDC和NHS活化2～4h，得到FA-PEG-NHS。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应时间为10～15h；继续反应时间为2～4d；搅拌时间为2～4h。
9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中搅拌温度为室温，搅拌时间为20～40min；继续搅拌温度为室温，时间为4～6min；反应温度为50～70℃，反应时间为1～2h。
10.一种如权利要求1所述纳米凝胶的应用。
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