CN109563549B

CN109563549B - 反义长非编码rna中的遗传变异作为对疾病治疗的敏感性的生物标志物

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Publication number: CN109563549B
Application number: CN201780047430.0A
Authority: CN
Inventors: N·G·耶尔; 陈邵文
Original assignee: Singapore Health Services Pte Ltd
Current assignee: Singapore Health Services Pte Ltd
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2037-06-05
Also published as: WO2017209697A9; US20200318196A1; US11274348B2; EP3464638B1; EP3464638C0; SG11201810694WA; WO2017209697A1; EP3464638A4; EP3464638A1; CN109563549A

Abstract

本发明涉及一种预测患有癌症的患者对用抗癌药物治疗的敏感性的方法，所述方法包括检测存在于致癌基因的反义链中的长非编码RNA(lncRNA)中存在或不存在遗传变异，所述遗传变异改变或破坏所述致癌基因的表达；如果存在所述遗传变异，预测所述受试者对所述治疗更敏感。具体的，基因变异是致癌基因表皮生长因子受体(EGFR)的Q787Q处沉默G>A突变。本发明还公开了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述受试者显示出在存在于致癌基因的反义链中的IncRNA中具有基因变异。

Description

反义长非编码RNA中的遗传变异作为对疾病治疗的敏感性的生物标志物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年6月03日提交的美国临时申请No.62/345,081的优先权的权益，其内容通过引用全部并入本文中。

技术领域

本发明一般涉及分子生物学领域。特别地，本发明涉及生物标志物用于确定针对各种疾病如癌症的治疗方式的用途。

发明背景

途径导向的治疗剂，例如靶向表皮生长因子受体(EGFR)相关途径的治疗剂，在各种类型的癌症例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC)中具有确定的临床活性。值得注意的是，在治疗结果中已经观察到位点特异性差异。

尽管已经显著改进了治疗癌症的多模态方法，但是迄今为止这些方法似乎具有仅50％的完全缓解率，也就是说仅50％的癌症被治愈。迄今为止，医护标准提供了用于治疗复发性转移性疾病的有限选择，例如使用已知赋予6个月至9个月的中位存活期的铂基化疗。尽管有证据表明，例如HNSCC癌症的大子集依赖于EGFR信号传导，但迄今为止，基于单克隆抗体和/或酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的已知治疗仅取得了一点成就。例如，在转移性情况下，西妥昔单抗单药疗法与13％的反应率相关，而表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂在几个II期试验中的效力更不均匀，反应率范围为1.8％至20％。

因此，需要能够预测受试者对特定药物治疗的敏感性的生物标记物、遗传标记物、蛋白质或其它标记物。

发明内容

在一个方面，本发明涉及预测患有癌症的受试者对用抗癌药物治疗的敏感性的方法，其中所述方法包括检测存在于致癌基因的反义链中的长非编码RNA(lncRNA)中存在或不存在遗传变异，所述遗传变异改变或破坏所述致癌基因的表达；在存在所述遗传变异的情况下，预测所述受试者显示出与未携带致癌基因的受试者相比改善的对用抗癌药物治疗的敏感性。

在另一方面，本发明涉及预测患有EGFR相关癌症的受试者对用EGFR抑制剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括确定是否给出下列中的一种或两种或全部：i)所述受试者具有在EGFR外显子20中的Q787Q位(核苷酸2361；如NCBI序列ID NM_005228.4和SEQ ID NO：27所示)的沉默G＞A突变(遗传变异)；ii)所述受试者具有与对用EGFR抑制剂治疗无响应的受试者相比低的EGFR-AS1或EGFR-AS1 lncRNA表达水平；iii)所述受试者具有与对用EGFR抑制剂治疗无响应的受试者相比高的EGFR同种型D/EGFR同种型A比值；其中在给出i)至iii)中的一种或两种或全部的情况下，预测所述受试者显示出与未显示i)至iii)中的任何一种的受试者相比改善的对用EGFR抑制剂治疗的敏感性。

在另一方面，本发明涉及治疗患有癌症的受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括检测与癌症相关的致癌基因的反义链上的长非编码RNA中存在或不存在突变，其中遗传变异改变或破坏致癌基因的表达；在确认遗传变异存在的情况下，施用针对所述受试者患有的癌症类型的抗癌药物。

在另一方面，本发明涉及治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的影响致癌基因的非编码RNA表达的治疗剂，其中遗传变异改变或破坏致癌基因的表达；以及向受试者施用有效量的对与致癌基因相关的癌症特异性的抗癌药物。

在一个方面，本发明涉及治疗患有EGFR相关癌症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的治疗剂，所述治疗剂影响EGFR-AS1 lncRNA表达、或影响EGFR-AS1表达、或增加EGFR同种型D的量和/或降低EGFR同种型A或其组合；以及向受试者施用有效量的用于治疗EGFR相关癌症的酪氨酸激酶抑制剂。

附图说明

当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：

图1是图1A-图1E的集合，显示EGFR的lncRNA中的点突变(本文称为Q787Q)与原发性HNSCC细胞系对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的敏感性的相关性。图1A是一组显示细胞增殖试验的结果和使用吉非替尼、厄洛替尼或阿法替尼的治疗对细胞增殖抑制的影响的线状图。误差条表示一个标准偏差。图1B是一组Sanger测序的DNA序列示踪色谱图，显示了具有对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(NCC-HN19和NCC-HN64)的增加的敏感性的细胞系中公开的AA基因型。图1C是一组Western印迹结果的图像，显示了在用酪氨酸激酶抑制剂治疗的情况下和在未用酪氨酸激酶抑制剂治疗的情况下具有所示Q787Q基因型的HNSCC细胞系中的EGFR途径的激活。在磷酸化速率以及吉非替尼治疗对磷酸化速率(即存在p-型蛋白质相对于未磷酸化形式的蛋白质)的影响方面，对每种细胞系进行比较。例如，前两行比较EGFR和p-EGFR(即磷酸化形式的EGFR)之间的磷酸化水平。由于吉非替尼是已知的酪氨酸激酶抑制剂，因此预期磷酸化速率与所施用的吉非替尼的量成反比。也就是说，随着所施用的吉非替尼的量的增加，磷酸化速率降低。GAPDH作为加样对照。图1D是显示了与G/G^AAV阴性对照(克隆CL12、CL76和CL77)相比，正确靶向的G/A^AAV克隆(CL16、CL19和CL63)中对吉非替尼敏感性的IC₅₀值的图。这表明G/A突变的存在导致吉非替尼的IC₅₀值的明显差异。就药物的IC₅₀值而言，值得注意的是IC₅₀值越低，则认为药物越有效。误差条表示一个标准偏差，p值如基于学生t-检验所指示的。图1E是一组Western印迹结果的图像，显示了与G/G^AAV阴性对照(克隆CL12)相比，在G/A^AAV克隆CL16、CL63、CL19中用0.1μM吉非替尼抑制EGFR途径激活。

图2是图2A-图2E的集合，显示了长非编码RNA EGFR-AS1作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性机制的含义。图2A是显示EGFR-AS1 lncRNA相对于EGFR基因外显子20的基因组位置以及Q787Q SNP位置的示意图，箭头指示设计用于敲低该EGFR-AS1 lncRNA的siRNA的位置。图2B是一组显示了通过实时RT-PCR测量的EGFR-AS1 lncRNA转录物在具有AA(NCC-HN19和NCC-HN64)和G/G基因型(NCC-HN1和NCC-HN43)的株系中、具有正确靶向的等基因NCC-HN1克隆(G/A^AAV：CL16、CL63和CL19)中和阴性对照(G/G^AAV：CL12、CL76和CL77)中的表达水平的柱状图。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。图2C是一组显示了用放线菌素D治疗后在具有AA(NCC-HN19和NCC-HN64)和G/G基因型(NCC-HN1和NCC-HN43)的株系中、在具有正确靶向的等基因NCC-HN1克隆(G/A^AAV：CL16和CL19)中和阴性对照(G/G^AAV：CL12和CL77)中的EGFR-AS1水平的趋势(通过实时RT-PCR测定)的线状图。误差条表示一个标准偏差。图2D是显示与非靶向对照(NT)相比，在EGFR-AS1敲低(siAS1)的细胞系中吉非替尼的IC₅₀值的图。如前所述，值得注意的是IC₅₀值越低，则认为药物越有效。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。图2E是显示在用AS1-靶向LNA和非靶向对照治疗后AS1-高PDXs HN124和AS1-高PDXs HN159中肿瘤生长水平的线状图。误差条表示一个标准偏差。

图3是图3A-图3F的集合，显示EGFR-AS1长非编码RNA对EGFR同种型的影响以及对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性。图3A是显示了通过实时RT-PCR测量的具有所示的Q787Q基因型的不同株系中和所靶向的NCC-HN1(G/A^AAV)克隆中的EGFR同种型D转录物与EGFR同种型A转录物的比值的条形图。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。图3B是显示了与非靶向对照(NT)相比，在敲低EGFR-AS1(siAS1)后通过实时RT-PCR测量的EGFR同种型D转录物与EGFR同种型A转录物的比值的条形图。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。图3C是一组显示与用吉非替尼治疗的非靶向对照(NT)相比，在成功的同种型D敲低(shIsoD)之后，不同HNSCC细胞系和NCC-HN1克隆(G/A^AAV和G/G^AAV；所示的基因型)的IC₅₀值的图。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。图3D是显示了与非靶向对照相比，在同种型D敲低(shIsoD)后，在用吉非替尼治疗后，EGFR途径激活的蛋白质印迹结果的一组图像。GAPDH在此用作加样对照。图3E是显示了在成功敲低同种型D(shIsoD)以及另外地敲低EGFR-AS1(siAS1)后不同HNSCC细胞系和NCC-HN1克隆(G/A^AAV和G/G^AAV；所示的基因型)的IC₅₀值的图。在本文中这些克隆称为CL16和CL19(G/A^AAV)以及阴性对照CL12和阴性对照CL77(G/G^AAV)。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。图3F是一组显示了在含有血清(FCS)的RPMI、不含血清(SF)的RPMI或不含血清但添加了EGF(EGF)的RPMI中用吉非替尼治疗的AA细胞系(NCC-HN19和NCC-HN64)和G/A HN1克隆的IC₅₀值的图。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。

图4是图4A-图4D的集合，显示Q787Q基因型与EGFR-AS1和EGFR同种型转录物的体内相关性以及对吉非替尼治疗的响应。图4A是一组显示了使用RNAscope的RNA原位杂交的结果的照片，显示了在具有A/A和G/G基因型的两种肿瘤样品中AS1、EGFR同种型A和EGFR同种型D的水平。PPIB是阳性对照，DAPB是阴性对照。图4B是显示了一组患者来源的肿瘤组织和细胞系的Q787Q基因型、AS1的相对转录水平和同种型D/同种型A比值(通过实时RT-PCR)以及福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织评分(RNA-范围评分)和IC₅₀水平之间的相关性的表，从而总结了前面图中提供的信息。图4C是一组显示了用对照或吉非替尼治疗的HN137原发性肿瘤(pri)和HN137转移性(met)肿瘤的患者来源的异种移植物模型的照片和线状图。线状图上的箭头表示何时开始治疗。图4D是一组显示了患者HN137对吉非替尼治疗的响应的临床和CT扫描图像。箭头指示了随后对治疗有响应的肺转移的位置。

图5是一组显示了基于实时PCR的各种细胞系中的EGFR拷贝数的相对变化以及所示的吉非替尼IC₅₀值的柱形图。该图表明EGFR拷贝数与IC₅₀值之间没有关联。误差条表示一个标准偏差。

图6是显示了被设计用于将Q787Q基因型从G改变为A的靶向构建体和策略的示意图。显示了用于PCR筛选的引物的结合位置和EGFR-AS1在该构建体中的位置。

图7是一组显示了PCR筛选结果的DNA凝胶图像，显示了在CL16、CL63和CL19克隆中的正确靶向以及CL12、CL76和CL77中的随机整合。随机整合意味着克隆CL12、CL76和CL77不具有对于G＞A转换的“敲入”的期望效果，而是随机整合到细胞系基因组中，从而产生阴性对照。

图8是显示了与所示的细胞系中的非靶向对照(NT)相比，敲低(siAS1)后通过实时RT-PCR测量的EGFR-AS1水平的相对倍数变化的柱状图。LNA对照是非目标LNA。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。

图9是显示了实时RT-PCR结果的柱状图，显示了在HN124和HN159患者来源异种移植物中EGFR-AS1体内靶向后AS1转录水平和同种型D/同种型A比值的相对倍数变化。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。

图10是EGFR基因的可变剪接图，显示了四种通常描述的同种型(A、B、C和D)和相关外显子。

图11是显示了与细胞系中的非靶向对照(NT)和等基因NCC-HN1克隆相比，在用靶向shRNA(shIsoD，也称为shEGFR4)敲低同种型D后，通过实时RT-PCR测量的EGFR同种型A转录物和EGFR同种型D转录物的水平的相对倍数变化的柱状图。误差条表示一个标准偏差。星号表示学生t检验的显著性(*-p＜0.05，**-p＜0.01，***-p＜0.001)。

图12是显示了作为细胞系的来源的患者的临床病理特征的表。

图13是显示了细胞系NCC-HN1、NCC-HN43、NCC-HN19、NCC-HN64、NCC-HN26和NCC-HN73中EGFR突变状态的表。

术语定义

术语“基因型转换”指遗传重组事件(也称为"敲入")，其中给定位置的核苷酸转换成另一核苷酸，从而将受试者的基因型从一种基因型改变为另一种基因型。例如，在本文所示的实验中，EGFR基因上第2361位处Q787Q位的核苷酸残基(如NCBI Sequence ID：NM_005228.4所示)已经从G转换到A。

术语“酪氨酸激酶”指在细胞中可将磷酸基团从三磷酸腺苷(ATP)转移到靶蛋白的酶。它作为许多细胞功能中的"开"或"关"开关起作用。酪氨酸激酶是蛋白激酶的一个亚类，其中酪氨酸激酶被如此命名是因为它将磷酸基团从ATP转移到目标蛋白内的酪氨酸残基上。有两个已知的酪氨酸激酶家族，即受体酪氨酸激酶(RTK)和非受体酪氨酸激酶或胞质酪氨酸激酶，由此受体酪氨酸激酶包含跨膜结构域和一个或多个胞外配体结合结构域。胞质酪氨酸激酶不具有这样的跨膜结构域或任何胞外配体结合结构域。

术语“致癌基因”是指具有引起癌症的潜力的基因。致癌基因也可指破坏细胞生长和分裂并能将正常细胞转化为癌细胞的细胞基因(原癌基因)的显性突变等位基因。在肿瘤细胞中，致癌基因经常被突变或以高水平表达。致癌基因通常编码参与但不限于积极控制细胞分裂周期的蛋白质，例如生长因子受体、信号转导蛋白和转录因子。这些基因中的突变倾向于松弛控制机制并加速细胞分裂，导致具有癌症特征的细胞增殖。一些致癌突变对程序性细胞死亡(凋亡)产生抑制作用，使得癌细胞不太可能被宿主免疫系统破坏。当关键功能改变时，大多数正常细胞将经历凋亡。相反，活化的癌基因可引起那些设定为凋亡的细胞的增殖和存活。一些致癌基因可能需要额外的步骤，例如，诸如另一基因中的突变，或环境因素，诸如病毒感染，以引起癌症。

术语“RNA”，即“核糖核酸”是指由长链核苷酸组成的有机分子，其中糖是核糖(或其变体)，碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶。存在各种类型的RNA，例如但不限于信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运信使RNA(tmRNA)、小核RNA(snRNA)、反义RNA(asRNA)和Piwi相互作用RNA(piRNA)。所有类型的RNA是编码的或非编码的，即导致蛋白质表达的RNA(例如信使RNA)或不导致蛋白质表达的RNA(例如转运RNA)。非编码RNA的一个具体实例是长非编码RNA(lncRNA)，指长度为200个核苷酸或更长(至少200个核苷酸)的非编码RNA转录物。LncRNA是范围为200个核苷酸至100000个核苷酸(或200个碱基至100kb)的转录物，并且分布在整个基因组中。在一些实例中，lncRNAs的长度为200个核苷酸至100000个核苷酸、200个核苷酸至400个核苷酸、300个核苷酸至700个核苷酸、500个核苷酸至1000个核苷酸、900个核苷酸至1300个核苷酸、1200个核苷酸至2500个核苷酸、2400个核苷酸至3600个核苷酸、3500个核苷酸至4800个核苷酸、4500个核苷酸至10000个核苷酸、9000个核苷酸至50000个核苷酸、50000个核苷酸至75000个核苷酸、70000个核苷酸至100000个核苷酸。在另一个实例中，lncRNAs的长度为至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少280个核苷酸、至少320个核苷酸、至少480个核苷酸、至少520个核苷酸、至少550个核苷酸、至少640个核苷酸、至少760个核苷酸、至少830个核苷酸、至少950个核苷酸、至少1100个核苷酸、至少1250个核苷酸、至少1400个核苷酸、至少1600个核苷酸、至少1800个核苷酸、至少2100个核苷酸、至少2800个核苷酸、至少5500个核苷酸、至少10500个核苷酸、至少25000个核苷酸、至少35000个核苷酸、至少48000个核苷酸、至少55000个核苷酸、至少68000个核苷酸、至少80000个核苷酸。尽管具有很少或未知的蛋白编码能力，但lncRNAs具有多种功能，包括转录调节、通过染色质修饰的表观遗传调节和转录后调节。这些功能中的几种功能涉及与DNA、前mRNA和成熟mRNA的直接(基于同源性)结合。然而，据信lncRNAs的三维结构构象在扩展其宽范围的抗体谱(repertoire)中起重要作用并且还影响这些分子本身的稳定性。

术语“RNAi”指RNA干扰，一种RNA分子抑制基因功能的过程。这种干扰是基于双链RNA干扰或抑制具有相应碱基序列的基因的表达的能力。例如，两种类型的小核糖核酸(RNA)分子-微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)-对于RNA干扰是重要的。RNA分子(或RNA)是基因的直接产物，这些小RNA可以结合例如其它特异性信使RNA(mRNA)分子，从而提高或降低mRNA的活性，例如通过防止mRNA产生蛋白质。RNA干扰在发育中以及在细胞防御来自例如病毒和转座子的寄生核苷酸序列中起重要作用。

术语“有义链”，也称为编码链，是指双链DNA内从5′到3′延伸并且与从3′到5′延伸的DNA的反义链互补的片段。DNA的有义链是具有与在转录期间以反义链作为其模板并且最终(虽然通常是，不总是)经翻译形成蛋白质的mRNA相同的序列的DNA链。因此反义链负责随后翻译成蛋白质的RNA，而有义链具有与mRNA几乎相同的组成。值得注意的是，对于双链DNA(dsDNA)的每个片段，可能存在两组有义链和反义链，这取决于人们读取DNA的方向，因为有义和反义的命名是相对于视角的。最终，基因产物或mRNA指示dsDNA的一个片段的哪条链被称为有义链或反义链。然而，值得注意的是，例如在原核生物中，相对链上的重叠基因意味着，对于一种mRNA的有义链可以是对于另一种mRNA的反义链。在本发明的上下文中，从DNA获得的反义链是指在3′到5′方向延伸的RNA片段。

术语“突变”或“突变的”或“遗传变异”指任何生物有机体、病毒或染色体外遗传元件的基因组或核酸序列的一部分的天然或人工修饰、或遗传变异。这种突变可以使用但不限于化学品和辐射人工诱导，也可以在细胞分裂中的核酸复制过程中自发发生。突变可以产生或不产生生物体的可观察特征(表型)的可辨别的变化。存在多种已知类型的突变，这些突变可以是小规模突变，也可以是大规模突变。小规模突变的实例是，但不限于，取代突变、沉默突变、错义突变、无义突变、插入和缺失。大规模突变的实例是，但不限于，扩增、缺失、染色体易位、间隙缺失、染色体倒位和导致杂合性丧失的突变。突变也可以根据它们对所得产物的功能的影响进行分组。这些突变包括但不限于功能丧失(失活)突变、功能获得(激活)突变、显性失活(反效等位基因)突变、致死突变和回复或逆转突变。点突变，例如，也称为单碱基修饰，是一种引起遗传物质DNA或RNA的单核苷酸碱基置换、插入或缺失的突变类型。术语“移码突变”表示碱基对的添加或缺失。

例如，沉默突变是不会显著改变发生该突变的生物体的表型的DNA中的突变。沉默突变可以发生在非编码区(基因外或内含子内)，或者沉默突变可以发生在外显子内。当沉默突变存在于外显子中时，它们不会导致蛋白质氨基酸序列的改变(也称为同义替换)，或者它们会导致插入具有与原始氨基酸相似的性质的替代氨基酸。在任一情况下，所得表型都没有显著变化。短语沉默突变通常与短语同义突变互换使用。然而，同义突变仅发生在外显子内，并且不总是沉默突变。同义突变是可以影响转录、剪接、mRNA转运和翻译的突变，其中任何一个都可以改变表型，导致同义突变非沉默。

术语“多态性”指在例如动物物种中存在两种或多种明显不同的形式(形态)。在遗传学中，(遗传)多态性用来描述使每个人类基因组独特的DNA序列中的基本个体间功能沉默差异。换句话说，遗传多态性是多个离散等位基因状态在同一群体中的存在，其中至少两个离散等位基因状态具有高频率。通常，高频率定义为所讨论的人口的1％或更多。遗传多态性的一个例子是单核苷酸多态性(SNP)，是在基因组中的特定位置发生的单核苷酸的变异，其中每种变异在群体中以某种可观的程度存在(例如，超过所述群体的1％)。

术语“敏感性”是指某些事物，例如疾病，可能受其它事物，例如所述疾病的治疗所影响的倾向。这种影响可以是积极的或消极的，取决于所参考的内容。例如，如果疾病对特定治疗敏感，那么所述疾病对特定治疗的敏感性是积极效果。然后可以说该疾病对该治疗是易感的(或敏感的)。另一方面，如果疾病对给定的治疗不敏感，则认为该疾病对所述治疗无响应或有抗性。

如上所定义的，术语“预测敏感性”是指某些事物，例如疾病，可能被其它事物，例如所述疾病的治疗所影响的倾向。换句话说，预测癌症对特定治疗的敏感性是确定癌症是否对用某种药物或抗癌药物的治疗起反应。值得注意的是，术语“确定敏感性”与例如“做出预后”不同义。前一术语仅着眼于疾病对特定药物或疗法的可能反应，而后一术语描述了患者从整体上幸免于疾病或疾病进展的可能性。虽然在一些情况下，可能将一个术语对另一个术语的影响相关联，也就是说，对给定治疗响应良好的疾病(即，该疾病对治疗敏感)可能增加所述患者接收关于整个疾病进展的阳性预后的可能性，但这不应作为规则。如本领域技术人员所理解的，阳性预后取决于除疾病对治疗敏感性外的许多患者特异性因素，例如，治疗前的患者总体健康状况、代谢、饮食、(原发性)疾病的侵袭性、继发性疾病和/或感染等。术语“表达”指基因表达，即通过RNA聚合酶将DNA转录成信使RNA(mRNA)；或蛋白表达，即mRNA翻译成(功能性)蛋白。通常与野生型或无病受试者相比，根据是否存在表达增加或减少，可认为表达是上调(或过表达)或下调(抑制、低或降低表达，也称为低表达)。

术语“同种型”或“蛋白质同种型”是指由同一基因编码的蛋白质的不同形式。这些蛋白质在结构和组成上都不同，因此这些差异受mRNA的可变剪接调节。这种可变剪接已经显示对蛋白质组多样性具有很大影响。所产生的蛋白质的特异性源自蛋白质结构/功能、发育阶段甚至细胞类型。当蛋白质具有多个亚基且每个亚基具有多个同种型时，同种型形成变得更复杂。

术语“可变剪接”指基因表达过程中的受调控过程，该过程导致单一基因编码多种蛋白质。在该过程中，基因的特定外显子(即，成为成熟RNA一部分的遗传密码的部分)可以包含于由该基因产生的最终加工的信使RNA(mRNA)内或者从由该基因产生的最终加工的信使RNA(mRNA)排除。被排除的序列成为内含子，来自基因内区域即基因内部的区域。术语内含子和外显子是指基因内的DNA序列和RNA转录物中的相应序列。因此，从可变剪接后的mRNA翻译的各蛋白质含有在它们的氨基酸序列中并且通常在它们的生物学功能中的差异。

术语“治疗剂”是指当向患者适当地施用时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。例如，就施用抗糖尿病药物治疗例如患者的糖尿病而言，认为抗糖尿病药物是治疗剂。

术语“锁核酸”、“LNA”或“不可及RNA(inaccessible RNA)”是指经修饰的RNA核苷酸，其中LNA核苷酸的核糖部分被连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内(North)构象中，3'-内(North)构象是在A-型双链体中经常发现的相同构象。只要需要，通常合成的锁核酸核苷酸可以与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合，并根据沃森-克里克碱基配对法则与DNA或RNA杂交。锁定的核糖构象增强了碱基堆积和主链预组织化。这显著地提高了寡核苷酸的杂交特性(解链温度)。

术语“EGFR抑制剂”是指能够抑制或阻断表皮生长因子受体活性的化合物。各种化合物和药物不限于单一作用，因此即使它们在结构上不同，也可认为是EGFR抑制剂。也就是说，EGFR的抑制是这些化合物的组合特征。

术语“EGFR-AS1”指对应于由EGFR基因表达的内含子和外显子20(图2A)的2.8kb序列。

如本文所用，术语“血液恶性肿瘤”或“多个血液恶性肿瘤”通常指来源于造血组织如骨髓或免疫系统细胞的恶性肿瘤或癌症。这些癌症在本领域中也被称为血癌或液体癌。血液恶性肿瘤可以源自两种主要血细胞谱系中的任一种：骨髓和淋巴样细胞系。骨髓细胞系通常产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴样细胞系产生B细胞、T细胞、NK细胞(自然杀伤细胞)和浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞白血病和骨髓瘤来源于淋巴细胞系，而急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病被认为是骨髓源性的。血液癌症的实例是，但不限于，白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。白血病的类型是，但不限于，急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)和急性单核细胞白血病(AMoL)。淋巴瘤的类型是，但不限于，霍奇金氏淋巴瘤(包括所有四种霍奇金氏淋巴瘤亚型)和所有非霍奇金氏淋巴瘤亚型。

发明详述

靶向治疗的成功是基于高精度预测性生物标记物来预测的。例如，基于同生群的测序研究未能证明表皮生长因子受体(EGFR)的外显子18至外显子21中的激活突变，或未能证明存在(治疗)响应(例如EGFR扩增)的已知预测因子，从而突出通过非基因组机制保持EGFR驱动的肿瘤的子集。例如，在检查在化疗-放疗之前诱导吉非替尼对不可切除的口腔鳞状细胞癌的影响的已完成的II期试验中，观察到两个对吉非替尼显著响应的患者。在这两个病例中，所进行的靶向EGFR测序都没有显示“激活”突变，由此表明在例如治疗响应和EGFR扩增之间没有明显的相关性，从而强调了对生物标记物的需要，其中这些生物标记物的存在或不存在充当受试者对某种治疗的响应有多好或者患者对预期的治疗是否响应的指示。因此，在一个实例中，本发明涉及预测患有癌症的受试者对用抗癌药物治疗的敏感性的方法。

确定受试者对用特定药物治疗的敏感性的基础可以是，例如，在基因组内、在遗传转录物如RNA内或在由基因表达的蛋白质内存在或不存在例如遗传变异或突变。所述遗传突变或变异可以导致或可以不导致例如蛋白质或RNA序列的改变，这取决于所述突变的类型。例如，与激活突变不同，沉默突变不会导致代谢或表达产物的任何可辨别的变化，因为突变是沉默的。点突变可以是沉默的，也可以不是沉默的，这取决于即将发生的确切突变和所述突变的结果。例如，如果点突变导致一个氨基酸改变成另一个氨基酸，其中新氨基酸导致所得蛋白质具有不同的三级结构，则不认为这种突变是沉默突变。然而，如果点突变导致不同的RNA序列，但该RNA序列仍然导致在蛋白质的该点具有相同氨基酸(由于遗传密码的冗余，即多个密码子编码相同氨基酸)，则认为点突变是沉默突变。

本申请还公开了包括检测在长非编码RNA(lncRNA)的反义链中存在或不存在遗传变异的方法。这种长非编码RNA(lncRNA)序列可以存在于致癌基因的反义链中。在另一个实例中，长非编码RNA(lncRNA)序列位于致癌基因的编码链中。因此，在一个实例中，本文公开了包括检测长非编码RNA(lncRNA)的反义链中存在或不存在遗传变异的方法。在另一个实例中，遗传变异改变或破坏致癌基因的表达。在另一个实例中，本文公开了预测患有癌症的受试者对用抗癌药物治疗的敏感性的方法，其中所述方法包括检测致癌基因的非编码RNA的反义链中存在或不存在突变，其中所述突变改变或破坏致癌基因的表达。在另一个实例中，长非编码RNA(lncRNA)序列位于致癌基因的编码链中。在另一个实例中，在存在遗传变异或突变的情况下，预测所述受试者显示出与未携带突变的受试者相比改善的对用抗癌药物治疗的敏感性。在一个实例中，公开了预测患有癌症的受试者对用抗癌药物治疗的敏感性的方法，其中所述方法包括检测存在于致癌基因的反义链中的长非编码RNA(lncRNA)中存在或不存在遗传变异，其中遗传变异改变或破坏致癌基因的表达；其中在存在遗传变异的情况下，预测所述受试者显示出与未携带遗传变异的受试者相比改善的对用抗癌药物治疗的敏感性。

如本文所用，术语“改变”是指通常与不同状态下的相同特性相比的特性变化。例如，可以认为已知基因的表达水平的差异是所述基因的基因表达的改变。这通常与基因的无病(或健康)状态相比给出。表达、基因蛋白或其它方面的这种差异可以绝对或相对的形式给出。例如，以绝对术语给出，在无病状态下基因Z以水平50表达。在疾病状态下基因Z以水平25表达。在相对术语中，在患病状态下基因Z的基因表达相对于无病状态为0.5(也称为基因Z表达下调)。在另一个实例中，以绝对术语给出，在无病状态下基因Z以水平50表达。在疾病状态下基因Z以水平100表达。在相对术语中，在患病状态下基因Z的基因表达相对于无病状态是2(也称为基因Z表达上调)。在这两个实例中，Z的基因表达都被改变。

如本文所用，术语“破坏”是指过程的破坏、干扰或终止。例如，基因序列中存在突变可以导致翻译过程的破坏，从而通常导致所得蛋白质的截短(蛋白质仅部分表达，例如通过突变引入提前终止密码子)或导致完全不存在蛋白质(不表达蛋白质)。

在另一个实例中，描述了治疗患有癌症的受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括检测与所述癌症相关的致癌基因的反义链上的非编码RNA中存在或不存在突变或遗传变异，其中所述突变改变或破坏致癌基因的表达；在确认突变存在的情况下，施用针对受试者患有的癌症类型的抗癌药物。在另一个实例中，公开了抗癌药物在制备用于治疗患有所述癌症的受试者中的癌症的药物中的用途，其中当检测到与癌症相关的致癌基因的反义链上的非编码RNA中存在或不存在突变时，将所述药物施用于受试者，其中所述突变改变或破坏致癌基因的表达。

在细胞中存在多种已知的起肿瘤发生开关的作用的靶标。这些靶基因是，但不限于，在任何涉及细胞生长和细胞增殖和/或凋亡的给定途径中的调节基因。由于磷酸化是用于调节细胞途径的细胞开关的最熟知的实例之一，表达激酶(负责将磷基团从一种蛋白质转移至另一种蛋白质的酶)的基因是开发抗癌药物和抗癌方案中的主要靶标。其它类别的癌基因包括但不限于受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶、细胞质酪氨酸激酶、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶调节亚单位、细胞周期蛋白依赖性激酶、调节性GTP酶和转录因子。因此，在一个实例中，致癌基因是导致但不限于受体酪氨酸激酶、受体酪氨酸激酶的蛋白质靶标或胞质酪氨酸激酶表达的基因。在另一个实例中，致癌基因是导致受体酪氨酸激酶表达的基因。在另一个实例中，导致受体酪氨酸激酶表达的致癌基因是，但不限于，EGFR、IGF1R、PIK3CD、PIK3R3、PIK3CD、ERBB4、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-kit、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、PIK3Ra、PIK3R2、PIK3R3、ERBB2、ERBB3和INSR。在一个实例中，致癌基因是导致胞质酪氨酸激酶表达的基因。在另一个实例中，导致胞质酪氨酸激酶表达的致癌基因是，但不限于，mTOR、MAP3K1(MEKK)MAPK8(JNK)和BRAF。

在另一个实例中，致癌基因包括，但不限于，表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、PIK3CB、PIK3R3、PIK3CD、ERBB4、BRAF、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、MAPK3K1(MEKK)、MAPK8(JNK)、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、ERBB3、INSR、abl、af4/hrx、akt-2、alk、alk/npm、aml1、aml1/mtg8、axl、bcl-2、bcl-3、bcl-6、bcr/abl、c-myc、dbl、dek/can、E2A/pbx1、enl/hrx、erg/TLS、erbB、erbB-2/HER2/neu、ets-1、ews/fli1、fms、fos、fps、gli、gsp、hox11、hTERT、hst、IGF1R、IL-3、int-2、jun、kit、kmt2b、kmt2c、kmt2d、KS3、K-sam、Lbc、lck、imo1、lmo2、L-myc、lyl-1、lyt-10、lyt-10/C-alpha-1、mas、mdm2、mll、mos、mtg8/aml1、myb、MYH11/CBFB、n-myc、ost、pax-5、pbx1/EA2、pim-1、PRAD-1、raf、rar/pml、ras、rasH、rasK、rasN、rel/nrg、ret、rhom1、rhom2、ros、ski、SRC、sis、tal1、tal2(SCL)、tan-1、tiam1、TSC2和trk。在另一个实例中，致癌基因可包括，但不限于，EGFR、IGF1R、mTOR、PIK3CB、PIK3R3、PIK3CD、ERBB4、BRAF、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-kit、MAPK3K1(MEK)、MAPK8(JNK)、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、ERBB2、ERBB3和INSR。在又一实例中，致癌基因可以是，但不限于，EGFR、IGF1R、mTOR、PIK3CB，PIK3R3、PIK3CD和ERBB4。在另一个实例中，致癌基因是EGFR。

如上所述，在一些实例中，由于在基因的遗传序列中的突变，各种基因变成致癌基因，从而导致偏离所述基因的通常功能。就基因靶向而言，存在使用可用技术可被靶向的多个水平。也就是说，可以在不同的水平上影响基因表达和/或所产生的蛋白质表达。例如，可以通过使用例如siRNA使某一基因沉默来影响所述基因的表达。因此，本公开描述了检测基因表达差异的方法，基于此推断受试者针对特定治疗的敏感性。

在一个实例中，基于致癌基因内或致癌基因的任何表达产物中存在或不存突变来进行此推断。在一个实例中，突变的存在对所得蛋白质的功能有影响。在另一个实例中，突变的存在对所得蛋白质的功能没有影响。

可以使用本领域技术人员已知的方法进行基因表达差异的测定。例如，基因测序可用于在核酸水平上确定是否存在突变。在另一个实例中，可以在RNA水平上，即例如通过确定并比较一个或多个靶基因的RNA转录物的水平，进行基因表达的比较。在另一个实例中，在蛋白质水平上进行基因表达水平的比较。可以通过例如比较患病的受试者中靶基因表达的蛋白质的水平并比较无疾病的受试者中相同蛋白质的水平进行基因表达水平的比较。

在一个实例中，确定基因的RNA转录物中存在或不存在突变。在另一个实例中，确定RNA的反义链上存在或不存在突变。在另一个实例中，确定RNA反义链的非编码区中存在或不存在突变。在另一个实例中，确定在所讨论的致癌基因的长非编码RNA区(lncRNA)的反义链上存在或不存在突变。致癌基因的长非编码RNA区(lncRNA)的反义链可以是，但不限于，EGFR基因的EGFR-AS1；IGF1R基因的IRAIN；MTOR基因的MTOR-AS1；PIK3CB基因的GAPDHP39和RPL23AP40；PIK3R3基因的LOC101929626；PIK3CD基因的PIK3CD-AS1、PIK3CD-AS2和RPL26P7以及ERBB4基因的RNA5SP119。在另一个实例中，确定突变位于EGFR的EGFR-AS1的外显子20中。在另一个实例中，突变是EGFR的EGFR-AS1的外显子20中的外显子20的第Q787Q位的沉默突变。在另一个实例中，沉默突变是EGFR的EGFR-AS1的外显子20中的外显子20的第Q787Q位G＞A突变。

在遗传水平上的突变，例如在mRNA或基因本身中的突变，可以导致表达的蛋白质或RNA与通常在大多数群体中表达的蛋白质或RNA不同。这种差异可以以多种方式看出，例如当遗传突变导致过表达或低表达所得(功能)蛋白质或RNA转录物时。在一个实例中，遗传突变导致在受试者中过表达或低表达所得RNA转录物。在另一个实例中，遗传突变导致表达截短的RNA转录物或不表达RNA转录物。在另一个实例中，遗传突变导致表达非功能性蛋白质。在另一个实例中，遗传突变导致表达截短的蛋白质。在另一个实例中，遗传突变导致表达蛋白质的不同同种型。在另一个实例中，遗传突变导致各种蛋白质比值的变化，例如，正常低表达的同种型的表达增加。在一个实例中，EGFR的长非编码RNA的反义链(EGFR-AS1)中的突变导致EGFR同种型D的表达增加。在另一个实例中，EGFR的长非编码RNA的反义链(EGFR-AS1)中的突变导致EGFR同种型D与EGFR同种型A的比值(EGFR同种型D/EGFR同种型A)增加。在另一个实例中，公开了治疗患有EGFR相关癌症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的治疗剂，所述治疗剂影响EGFR-AS1 lncRNA表达、或影响EGFR-AS1表达、或增加EGFR同种型D的量和/或降低EGFR同种型A或其组合；以及向受试者施用有效量的用于治疗EGFR相关癌症的酪氨酸激酶抑制剂。在另一个实例中，公开了酪氨酸激酶抑制剂在制备用于治疗患有EGFR相关癌症的受试者的药物中的用途。

在另一个实例中，描述了预测患有EGFR相关癌症的受试者对用EGFR抑制剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括确定是否给出下列中的一种或两种或全部：i)受试者具有EGFR外显子20中的Q787Q位的沉默G＞A突变；ii)受试者具有与对用EGFR抑制剂治疗无响应的受试者相比低的EGFR-AS1或EGFR-AS1 lncRNA表达水平；iii)受试者具有与对用EGFR抑制剂治疗无响应的受试者相比高的EGFR同种型D/EGFR同种型A比值；其中在给出i)至iii)中的一种或两种或全部的情况下，预测所述受试者显示出与未显示i)至iii)中的任何一种的受试者相比改善的对用EGFR抑制剂治疗的敏感性。

基因组内的遗传变异或突变可导致所述突变的纯合或杂合基因型。如本文所用，术语“纯合的”和“杂合的”是指生物的某一特征或性状的等位基因之间的相似程度。这是基于大多数真核生物是二倍体的事实，这意味着它们具有两组匹配的染色体。两组染色体具有位于两组染色体的每一个染色体上的相同的位点。因此，具有纯合基因型的生物描述了给定位点处的等位基因相同的生物(或细胞)。另一方面，如果生物体被描述为对于某一等位基因是杂合的，这意味着一条染色体在相同的位点中显示一种基因型(例如核苷酸A)，而另一条染色体在相同的位点中显示不同的基因型(例如核苷酸T)。纯合或杂合的问题也可以基于来自每个等位基因的各自RNA或RNA转录物中存在或不存在遗传变异或突变而确定。因此，在一个实例中，如果来自等位基因的RNA转录物在相同位点中显示相同的突变，则认为该生物针对该突变是纯合的。在优选的实例中，突变或遗传变异是纯合的。在另一个实例中，突变或遗传变异是杂合的。

还可以确定在例如相应的反义RNA链上或在长非编码RNA(lncRNA)中存在或不存在遗传变异或突变。本实例公开了EGFR-AS1序列中的特定位置处的突变或遗传变异。因此，在一个实例中，长非编码RNA序列的反义链中的所给定的位点针对突变或遗传变异是纯合的。在另一个实例中，致癌基因反义链中的长非编码RNA(lncRNA)中的突变或遗传变异是纯合的。在一个实例中，突变或遗传变异存在于EGFR-AS1序列中。在另一个实例中，突变或遗传变异存在于EGFR-AS1序列的Q787Q位点中。在一个实例中，该位点针对突变或遗传变异是纯合的。这意味着在该位点，两个等位基因上的突变或遗传变异(以及作为结果的基因型)是相同的。在另一个实例中，该位点针对突变或遗传变异是杂合的。在进一步优选的实例中，纯合的突变或遗传变异是AA。在另一个实例中，杂合的突变或遗传变异是GA。

用于确定存在或不存在突变和/或这种突变对所得蛋白质或RNA表达的影响的比较基础是与健康的即无病的受试者或与所讨论的受试者具有相同疾病但已知对正在评估的用于所讨论的受试者的治疗无响应的受试者进行比较。例如，受试者A患有头颈癌。在与该癌症密切相关的致癌基因例如EGFR中发现了突变。受试者B也患有头颈癌并被用抗癌药X治疗，抗癌药X在癌症治疗中无效。受试者C也患有头颈癌并被用抗癌药物X成功地治疗。与受试者B和受试者C中的癌症密切相关的致癌基因(在该实例中，EGFR)的遗传比较表明受试者B在致癌基因的相关预定区中不存在突变，而受试者C在致癌基因的相关预定区中存在突变。因此，具有存在于与受试者C相同的区域中的突变的受试者A显示出对抗癌药物X的治疗敏感性。在另一个实例中，可以基于比较例如蛋白质或RNA水平，或在多种蛋白质或RNA转录物的情况下，和/或比较相关蛋白质的比值，确定对用给定抗癌药物治疗的可能敏感性。在一个实例中，确定受试者是否具有与对用抗癌药物治疗无响应的受试者相比高的EGFR同种型D/EGFR同种型A比值。在一个实例中，确定受试者是否具有与对用抗癌药物治疗无响应的受试者相比低的RNA转录水平。在另一个实例中，确定受试者是否具有与对用抗癌药物治疗无响应的受试者相比低的EGFR-AS1或EGFR-AS1 lncRNA表达水平。在又一实例中，如本文所述的方法还包括测量以下一种或两者以预测敏感性：i)受试者是否具有与对用抗癌药物治疗无响应的受试者相比低的EGFR-AS1或EGFR-AS1 lncRNA表达水平；ii)受试者是否具有与对用抗癌药物治疗无响应的受试者相比高的EGFR同种型D/EGFR同种型A比值，其中抗癌药物是酪氨酸激酶抑制剂或EGFR抑制剂。

因此，在一个实例中，患者中EGFR同种型D的量的增加指示对用例如针对EGFR相关癌症的酪氨酸激酶抑制剂治疗的敏感性增加或对用于其它基因特异性癌症的治疗的敏感性增加。在另一个实例中，患者中EGFR同种型A的量的减少表明对酪氨酸激酶抑制剂治疗的敏感性增加。换句话说，认为EGFR同种型D与EGFR同种型A的高比值指示对用例如针对EGFR相关癌症的酪氨酸激酶抑制剂治疗的敏感性增加或对用于其它基因特异性癌症的治疗的敏感性增加。相反，认为EGFR同种型D与EGFR同种型A的低比值指示对用例如针对EGFR相关癌症的酪氨酸激酶抑制剂治疗的可能抗性或对用于其它基因特异性癌症的治疗的可能抗性。

已知某些致癌基因与某些类型的癌症比其它类型的癌症更密切相关。例如，HER2基因是已知的致癌基因，与乳腺癌的某些亚型不仅是相关而是最密切相关。因此，在本公开中，应理解致癌基因中不存在或存在突变影响受试者对例如所述致癌基因相关癌症的治疗的敏感性。在一个实例中，与EGFR、PIK3CB、PIK3R3和PIK3CD相关的癌症是，但不限于，非小细胞肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、乳腺癌、包括成胶质细胞瘤的脑恶性肿瘤、血液恶性肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌、宫颈癌、食管癌、胃癌和卵巢癌。在另一个实例中，EGFR相关癌症是头颈癌或肺癌。在另一个实例中，头颈癌可以是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)或口腔鳞状细胞癌(OSCC)。在另一个实例中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一个实例中，PIKCD相关癌症是血液恶性肿瘤。在一个实例中，ERBB4相关癌症是乳腺癌。在一个实例中，EGFR相关癌症是，但不限于，非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、结肠直肠癌、乳腺癌、包括成胶质细胞瘤的脑恶性肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌、宫颈癌、食管癌、胃癌和卵巢癌。

正如存在与特定类型的癌症密切相关的已知基因，还存在针对相同类型的癌症，与其他治疗相比对某些癌症类型更好地作用的已知治疗例如抗癌治疗。不受理论的约束，认为治疗敏感性中的这种差异是抗癌治疗精确定位例如有缺陷的细胞或信号途径的结果。例如，HER2基因相关癌症，其中HER2基因是缺陷的或产生缺陷产物(例如，RNA或蛋白RNA或蛋白)，所述HER2基因相关癌症对用例如曲妥珠单抗治疗比用其它抗癌药物治疗更敏感。因此，在一个实例中，抗癌药物是，但不限于，用于治疗EGFR相关癌症的吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼；用于治疗IGF1R相关癌症的OSI-906(林西替尼)；用于治疗mTOR相关癌症的依维莫司(也称为RAD001)和西罗莫司；用于治疗PIK3CB和PIK3R3相关癌症的BKM120(布帕尼西)和BYL719(阿哌利西)；用于治疗PIK3CD相关癌症的艾代拉里斯，用于治疗ERBB4相关癌症的达克替尼和拉帕替尼，或其组合。在一个实例中，用于治疗EGFR相关癌症的抗癌药物是，但不限于，吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼或其组合。在另一实例中，用于治疗mTOR相关癌症的抗癌药物是，但不限于，依维莫司(RAD001)、西罗莫司或其组合。在另一个实例中，用于治疗IGF1R相关癌症的抗癌药物是，但不限于，林西替尼。在另一个实例中，用于治疗PIK3CB和PIK3R3相关癌症的抗癌药物是，但不限于，BKM120(布帕尼西)、BYL719(阿哌利西)或其组合。在另一个实例中，用于治疗PIK3CD相关癌症的抗癌药物是，但不限于，艾代拉里斯。在另一个实例中，用于治疗ERBB4相关癌症的抗癌药物是，但不限于，达克替尼、拉帕替尼或其组合。在一个实例中，抗癌药物是酪氨酸激酶抑制剂。在另一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是EGFR抑制剂。在另一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是，但不限于，吉非替尼、厄洛替尼、盐酸厄洛替尼、拉帕替尼、达克替尼、TAE684、阿法替尼、达沙替尼、沙拉替尼、维拉替尼(Veratinib)、AEE788、WZ4002、艾考替尼、奥昔美替尼、BI1482694、ASP8273、EGF816、AZD3759、西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗、帕尼单抗(pannitumumab)、尼妥珠单抗及其组合。在另一个实例中，酪氨酸激酶抑制剂是，但不限于，吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼及其组合。

应当理解，一些药物/治疗剂(本文中公开了其中一些治疗)，虽然具有不同的功效，但可以用于治疗大多数癌症类型。然而，例如，吉非替尼通常不用于治疗例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC)，但是根据本发明表明，确实可以用吉非替尼来治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。

一些方法基于用于治疗疾病的多分支方法，而其它方法可以基于用于特定疾病的单分支方法，即单治疗方案。在一个实例中，使用单一治疗治疗疾病。在另一个实例中，使用至少两种、至少三种、至少四种或更多种治疗来治疗所述疾病。这些治疗可以随后、同时或以其组合的方式进行。在一个实例中，使用至少两种、至少三种、至少四种或更多种药物治疗所述疾病。

基于待治疗的癌症的具体类型，多种类型的抗癌药物或治疗是可以用的。例如，乳腺癌可以用但不限于下列抗癌药物中的任何一种或其组合治疗：依维莫司(RAD001)、他莫昔芬、托瑞米芬、曲妥珠单抗、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、拉帕替尼、来曲唑、帕妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗和帕博西尼。因此，致癌基因中的已知突变可以导致选择更有效的抗癌，这与选择上述所列的药物的任一种完全不同。例如，如果检测到从受试者获得的乳腺癌样品的HER2基因中的突变，则选择曲妥珠单抗用于治疗所述癌症，因为已知曲妥珠单抗在HER2-突变阳性乳腺癌的治疗中具有高成功率。

以下提供了各种类型的癌症和用于治疗它们的抗癌药物。例如，胃或胃食管结合处的腺癌可以用但不限于曲妥珠单抗、雷莫芦单抗或其组合治疗。基底细胞癌可以用但不限于维莫德吉、索尼德吉或其组合治疗。膀胱癌可以用例如但不限于阿特朱单抗、依维莫司、西罗莫司及其组合治疗。脑癌可以用但不限于贝伐单抗、依维莫司或其组合治疗。乳腺癌可以用但不限于依维莫司、他莫昔芬、托瑞米芬、曲妥珠单抗、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、林西替尼、拉帕替尼、来曲唑、帕妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗、帕博西尼、阿哌利西及其组合治疗。宫颈癌可以用例如但不限于贝伐单抗治疗。结肠直肠癌可用但不限于西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、阿柏西普、瑞戈非尼、雷莫芦单抗及其组合治疗。皮肤纤维肉瘤突起可以用例如但不限于甲磺酸伊马替尼治疗。内分泌/神经内分泌肿瘤可以用例如但不限于醋酸兰瑞肽治疗。头颈癌可以用但不限于西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、阿哌利西、林西替尼、布帕尼西、艾代拉里斯、达克替尼、拉帕替尼及其组合治疗。胃肠基质肿瘤可以用但不限于甲磺酸伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼和其组合治疗。骨的巨细胞肿瘤可以用例如但不限于狄诺塞麦治疗。卡波西肉瘤可用例如但不限于阿力视黄酸治疗。肾癌可以用但不限于贝伐单抗、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、替西罗莫司、依维莫司、阿西替尼、纳武单抗、卡波替尼、甲磺酸乐伐替尼及其组合治疗。白血病可以用例如但不限于维甲酸、甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼、博舒替尼、利妥昔单抗、阿仑单抗、奥法木单抗、奥滨尤妥珠单抗、依鲁替尼、艾地拉立尼、博纳吐单抗、维奈托克及其组合治疗。肝癌可以用例如但不限于索拉非尼治疗。肺癌可以用例如但不限于贝伐单抗、克里唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、二马来酸阿法替尼、色瑞替尼、雷莫芦单抗、纳武单抗、派姆单抗、奥斯美替尼、耐昔妥珠单抗、艾乐替尼和其组合治疗。淋巴瘤可以用例如但不限于替伊莫单抗、地夫替康(denileukin diftitox)、本妥昔单抗、利妥昔单抗、伏立诺他、罗米替辛、贝沙罗汀、硼替佐米、普拉曲沙、依鲁替尼、司妥昔单抗、艾地拉斯替、贝利诺他、奥滨尤妥珠单抗、纳武单抗及其组合治疗。黑素瘤可以用例如但不限于易普利单抗、维莫非尼、曲美替尼、达拉菲尼、派姆单抗、纳武单抗、考比替尼、依维莫司、西罗莫司及其组合治疗。多发性骨髓瘤可以用例如但不限于硼替佐米、卡非佐米、帕比司他、达雷木单抗、埃沙佐米柠檬酸盐、埃罗妥珠单抗及其组合治疗。骨髓增生异常/骨髓增生性疾病可以用例如但不限于甲磺酸伊马替尼、磷酸鲁索利替尼及其组合治疗。成神经细胞瘤可以用例如但不限于地努图希单抗治疗。卵巢上皮/输卵管/原发性腹膜癌可以用例如但不限于贝伐单抗、奥拉帕尼及其组合治疗。胰腺癌可以用例如但不限于埃罗替尼、依维莫司、舒尼替尼及其组合治疗。前列腺癌可以用例如但不限于卡巴他赛、恩杂鲁胺、醋酸阿比特龙、二氯化镭223、林西替尼和其组合治疗。软组织肉瘤可以用例如但不限于帕唑帕尼治疗。全身性肥大细胞增多症可以用例如但不限于甲磺酸伊马替尼治疗。甲状腺癌可以用例如但不限于卡波替尼、凡德他尼、索拉非尼、甲磺酸乐伐替尼及其组合来治疗。列出了上述类别中的特定抗癌药物但并不排除它用于治疗其他类型的癌症。

本文公开的具体方法还包括施用其他治疗剂(即，除本文公开的抗癌治疗以外的治疗剂)。在某些实例中，抗癌治疗可与至少一种其它治疗剂组合使用。治疗剂包括但不限于抗生素、止吐药、抗抑郁药、抗真菌剂、抗炎药、抗病毒剂、其它抗癌剂、免疫调节剂、表达调节剂、α-干扰素、基因沉默剂、能够抑制RNA转录物或蛋白质表达的试剂、能够影响RNA或蛋白质表达的试剂、β干扰素、烷化剂、激素或细胞因子。在一个实例中，该方法包括施用证明基因沉默活性的其他治疗剂。在另一个实例中，治疗剂具有干扰RNA的能力。在另一个实例中，治疗剂选自但不限于反义寡核苷酸、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、锁核酸(LNAs)核酶、组蛋白修饰、RNA指导的DNA甲基化、副突变或其组合。在一个实例中，治疗剂影响RNA表达。在另一个实例中，公开了治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的影响致癌基因的非编码RNA表达的治疗剂，其中所述突变改变或破坏致癌基因的表达；以及对受试者施用有效量的对致癌基因相关癌症特异的抗癌药物。在另一个实例中，治疗剂影响EGFR-AS1表达。在另一个实例中，影响EGFR-AS1表达的治疗剂包括但不限于miRNA、shRNA、锁核酸(LNA)，例如锁RNA或锁DNA或siRNA。在另一个实例中，治疗剂是一种或多种锁核酸(LNA)。在另一个实例中，抑制EGFR-AS1表达的治疗剂包含靶向EGFR-AS1的锁核酸(LNA)。在另一个实例中，用于增加EGFR同种型D或减少EGFR同种型A的治疗剂包括调节EGFR的可变剪接的试剂。

本文公开的药物和治疗以及其它治疗剂可以相加性或协同地起作用。在一个实例中，抗癌药物与另一种治疗剂同时施用，所述另一种治疗剂可以是相同组合物的一部分或存在于不同的组合物中。在另一个实例中，在施用另一种治疗剂之前或施用另一种治疗剂之后施用抗癌剂。在一个单独的实例中，将抗癌药物施用于先前未经过用另一种治疗剂治疗的受试者或目前未经历用另一种治疗剂治疗的受试者。在一个实例中，本发明的方法包括在没有施用其他治疗剂的情况下施用一种或多种抗癌治疗。在另一个实例中，本发明的方法包括施用一种或多种抗癌治疗剂和至少一种或多种其他治疗剂。

本文公开的方法和治疗可以同时、分别、一个接一个或与其它治疗组合进行或实施。在一个实例中，这些治疗是但不限于放射疗法、化学放射、手术及其组合。在例如实施多次治疗的情况下，这些治疗可以例如一个接一个地进行或实施，其中每个治疗步骤之间具有时间间隔，例如第一治疗步骤和第二治疗步骤之间的时间间隔是至少1至24小时，或至少1、至少4、至少6、至少8、至少12、至少、或至少1或2或3或4或5或6或7天，或至少一周。

对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的差异敏感性是由患者来源的口腔鳞状细胞癌细胞系中的EGFR外显子20中的沉默多态性介导的

使用吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼测试在实验室中建立的6个患者源细胞系对EGFR抑制剂的敏感性(图1A)。如图所示，除了NCCWHN19和NCCWHN64(每个细胞系具有在治疗范围内的吉非替尼IC₅₀值(0.07μM和0.26μM))，大多数细胞系对EGFR抑制不敏感。靶向重测序没有鉴定出敏化EGFR突变，也没有证明药物敏感性和EGFR拷贝数之间的任何相关性(图5)。相反，对于在二期试验中鉴定的相同同义SNP来说，两个敏感系是纯合的(rs10251977，2361G＞A，Q787Q；SEQ ID NO：27)，具有A/A基因型，而不敏感细胞系是纯合野生型(G/G)或杂合(G/A)的(图1B)。与观察到的表型一致，在吉非替尼敏感细胞系NCC-HN19和NCC-HN64(A/A基因型)上进行的Western印迹显示用治疗剂量的吉非替尼治疗后EGFR、AKT、ERK和S6磷酸化显著并一致地降低(图1C)。相反，具有G/G基因型(NCC-HN1和NCC-HN43)的细胞系需要更高的药物剂量才显示出对磷酸化-AKT和磷酸化-S6水平的影响，以及对磷酸化-ERK较小影响(如果有的话)。

在同基因细胞系中靶向单核苷酸的反向EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性表型

利用Horizon AAV靶向系统在同基因细胞系系统中遗传敲入单核苷酸变异并将抗性系(NCC-HN1)转化为敏感系(图6和7)。表达的EGFR cDNA的Sanger测序确认与载体随机整合的阴性对照(G/G^AAV：NCC-HN1CL12、CL76和CL77)相比在成功靶向的克隆中(G/A^AAV：分别为NCC-HN1CL16、CL63和CL19)表达A基因型(数据未显示)。与阴性对照相比，G/A^AAV克隆的药物治疗显示对吉非替尼的敏感性增加。与范围为6.4μM-7.2μM的阴性对照(G/G^AAV)相比(NCC-HN1亲本细胞系的IC₅₀的范围为7μM-11μM；图1D)，G/A^AAV克隆的IC₅₀值的范围为0.1μM-0.3μM，具有一致的下游途径调节(图1E)。

EGFR-AS1长非编码RNA体外和体内驱动EGFR成瘾(addiction)

计算机分析显示没有可能影响EGFR mRNA转录或翻译的潜在miRNA靶向位点(数据未显示)。然而，发现这个所描述的SNP位于EGFR-AS1 lncRNA的转录部分中(图2A)。实时RT-PCR显示，与敏感的A/A基因型(NCC-HN19和NCC-HN64；图2B)相比，具有G/G基因型的抗性株系((NCC-HN1和NCC-HN43)中的EGFR-AS1 lncRNA的转录水平显著更高。在NCC-HN1同基因克隆中观察到类似的发现：与对照G/G^AAV克隆相比，G/A^AAV中的EGFR-AS1转录水平较低。使用放线菌素D阻断转录，接下来证明，与A/A基因型(被重现于具有基因型转换的同基因NCC-HN1克隆中)相比，具有G/G基因型的株系中的EGFR-AS1 lncRNA转录物更稳定(图2C)。最后，表明EGFR-AS1的敲低(图9)足以显著增加G/G细胞系对吉非替尼的敏感性，针对NCC-HN1的平均IC₅₀值从8.9μM降到2.3μM，针对NCC-HN43的平均IC₅₀值从9.6μM降到2.8μM(图2D)。为了测试EGFR-AS1是否是真正的驱动因子，通过在患者来源的异种移植(PDX)系统中进行体内敲低来确定具有G/A基因型的肿瘤或具有G/G基因型的肿瘤是否依赖于lncRNA水平。设计了一组针对EGFR-AS1的锁核酸(LNA)，并且通过体外筛选选择最有效的候选物用于有效地敲低(数据未显示)。随后将体内级别形式的该靶向AS1的LNA和对照非靶向LNA注射(每周剂量5mg/kg)到NOD-scid-γ(NSG)小鼠的尾静脉中，该NOD-scid-γ(NSG)小鼠含有患者来源的肿瘤(HN124)异种移植物，具有G/A Q787Q基因型以及高AS1水平(图4B)。在仅用LNA治疗一周后，在其余实验过程中开始每天向小鼠施用吉非替尼剂量(25mg/kg)治疗。与非靶向对照相比，用靶向AS1的LNA治疗一周后，在患者来源的异种移植物中观察到成功的AS1水平的敲低(图8)。甚至在吉非替尼开始之前，体内AS1敲低就足以引起肿瘤消退，这种消退在治疗后持续(图2E)，相比于对照(对照LNA和吉非替尼均未显示任何作用)。在不同的患者来源的异种移植物(HN159-G/G基因型，高AS1水平)中重复同样的实验，这次省略了用吉非替尼治疗。再次，显示用靶向AS1的LNA治疗的小鼠(成功敲低)导致与对照相比持续的肿瘤消退，证明肿瘤对lncRNA成瘾。

通过EGFR同种型的差异表达调节EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性

考虑到lncRNA对转录物、蛋白质稳定性没有影响，或导致EGFR的异常剪接(数据未显示)，继续检测lncRNA对四种已知EGFR同种型(A-D)的表达水平的影响(图10)。实时PCR显示，具有A/A基因型(NCC-HN19和NCC-HN64)的两个株系中同种型D：同种型A转录水平比具有G/G基因型的株系(NCC-HN1和NCC-HN43；图3A)高。这些结果重现于NCC-HN1基因型转换的G/A^AAV克隆中。此外，尽管在G/G基因型(NCC-HN1和NCC-HN43)中更显著，在所有被检测的株系中靶向敲低EGFR-AS1 lncRNA都足以增加同种型D：同种型A的比值(图3B)。在体内还观察到通过LNA介导的EGFR-AS1的敲低的两种患者来源的异种移植物(HN124和HN159)中的同种型D：同种型A比值增加的相同效果(图8)。接着，确定同种型D的表达对EGFR敏感性是否是必要的。使用外显子16B的独特序列，设计了特异性靶向同种型D的shRNA。NCC-HN19、NCC-HN64、NCC-HN1和NCC-HN43中的稳定转染子显示特异性靶向同种型D而不是同种型A(图11)。

在这些模型中，先前吉非替尼敏感的NCC-HN19和NCC-HN64(A/A)被赋予更强的抗性(图3C)，而对G/G基因型株系(NCC-HN1和NCC-HN43)没有显著影响。类似地，在基因型转换的G/A^AAV克隆中靶向同种型D显示敏感性降低，且对阴性对照没有影响。相对于非靶向对照，同种型D的表达降低也减弱了吉非替尼在具有AA基因型的HNSCC细胞系中对下游途径调节的影响(图3D)。重要的是，在具有G/G基因型的细胞系中EGFR-AS1敲低促进吉非替尼敏感性的作用被同时发生的同种型D敲低所消除(图3E)。为了确定对吉非替尼的敏感性是否是配体依赖性的，在含有血清的正常培养基、不含血清的培养基和补充有表皮生长因子(EGF)的培养基中培养细胞系，并用吉非替尼治疗。具有A/A基因型的细胞系和基因型转换的G/A^AAV克隆中的IC₅₀值在富含血清的培养基和富含EGF的培养基中比在不含血清的条件下显著更低(图3F)。该数据确认EGFR-AS1 lncRNA的作用是通过EGFR同种型A和EGFR同种型D的改变介导的，并且该作用可能是配体依赖性的。

EGFR-AS1水平和同种型D：同种型A比值确定吉非替尼响应

为了评价潜在生物标记物，分别使用RNAscope技术和实时PCR使用RNA原位杂交在原发性肿瘤组织中进行AS1(1+或0)(图4A)和相对EGFR同种型A和D水平的半定量评价。在A/A基因型中，未检测到AS1以及同种型D/同种型A比值增加。相反，在G/A或G/G基因型中，AS1水平高(1+)，同种型D/同种型A比值低。如果可获得，患者来源的肿瘤系的IC₅₀值与基因型状况、AS1水平和同种型D/同种型A比值一致(图4B)。来自该群组的一个患者表现出复发性转移性疾病，因此接受IMPACT-SG下联合临床试验。该患者(HN137)最初被诊断患有T4N2BM0口腔鳞状细胞癌，并经手术，随后进行辅助化学放射治疗。在辅助治疗后6个月他随后发展皮肤和肺转移。测序确认了Q787Q的A/A基因型，实时PCR显示与对照相比，在他的原始原发并转移性肿瘤中EGFR-AS1水平低且EGFR同种型D：同种型A比值高(图4B)。已经移植原始和转移性肿瘤作为患者来源的异种移植物(PDX)，将其扩大培养，并且在NSG小鼠中进行使用口服吉非替尼(50mg/kg，通过口服管饲法)的临床试验。当用吉非替尼治疗时，患者来源的原发和转移性异种移植肿瘤均显示出与未处理的对照相比肿瘤显著消退(图4C)。同时开始向患者施用250mg每日剂量的吉非替尼；临床和放射学评估显示出吉非替尼单药治疗6周后皮肤和肺转移显著消退(图4D)。

尽管FDA批准的EGFR靶向治疗可用于头颈鳞状细胞癌和肺来源鳞状细胞癌，但是还没有建立强有力的预测性生物标记。本文报道了由lnc RNA EGFR-AS1介导的EGFR成瘾的机制。还进一步证明了同义单核苷酸变体如何可以通过调节lnc RNA EGFR-AS1来介导EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性，并随之增加同种型D：同种型A比值，导致配体驱动的EGFR依赖性。这由3名患有EGFR野生型口腔鳞状细胞癌的患者支持，这些患者是对吉非替尼的异常响应者，所有这些患者都是A/A基因型的。迄今为止，癌症中的大多数预测性生物标记是基于基因组的，并且很大程度上限于改变蛋白质结构和功能的非同义突变。不受理论束缚，本报告描述了“沉默”SNP如何影响lncRNA水平且显著影响对EGFR抑制剂的易损性。进一步的描述是针对EGFR激活的可能路线图，定义了用于准确预测哪些患者可能响应于EGFR酪氨酸激酶抑制剂的全面的生物标志物套组。

最近的几项研究也鉴定了对肿瘤发生来说关键的lncRNA，并提示这些lncRNA可针对治疗目的。不受理论束缚，本文所示数据指出导致lncRNA内的单核苷酸变体的外显子20SNP的关键作用，该变体可能由于高级结构的改变而影响EGFR-AS1的稳定性。一个结果是顺式介导的对EGFR可变剪接的作用，其中同种型D：同种型A比值增加。当然，EGFR-AS1转录物在细胞核中的定位为这种效应提供了地理上的支持(由RNA原位杂交可见；图4A)，其中这种定位可以影响转录和/或前mRNA加工。

操纵基因型从AA至GA、或降低AS-1lncRNA的水平足以以一致和可预测的方式增加对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的敏感性，并且这种作用可以通过敲低EGFR同种型D而消除，EGFR同种型D可能是这种表型的效应物。

迄今为止，对天然存在的EGFR同种型研究得很少，一些研究表明，替代的同种型被分泌到血浆中(作为分泌的EGFR或sEGFR)，并且可能在肺癌和宫颈癌中具有预后。用厄洛替尼治疗的非小细胞肺癌患者中sEGFR水平的分析支持了这样的观点，即较高水平的sEGFR预示酪氨酸激酶抑制剂响应，尽管在所测量的特定同种型之间没有区别。相对于全长同种型A，缺少本文所见的酪氨酸激酶结构域的同种型D的相对增加，以及配体驱动的EGFR激活的需要，表明了涉及胞外域区域的机制，例如受体二聚化。尽管缺少针对每种EGFR同种型的特异性抗体限制了空间定位和定量，但如本文所示使用实时RT-PCR或RNAscope的mRNA转录物的分析是可行的替代方法。然而，EGFR-AS1增强可变剪接以产生高同种型D：同种型A比值的精确机制仍然不清楚。

本文公开的数据有几个重要的含义。值得注意的是，这种SNP(纯合A/A基因型)的流行率在亚洲背景下为4％(如本文所测定的)，但在白种人群体中为30％(http://exac.broadinstitute.org)，突出了基因组生物标记物的重要地理差异。此外，已经建立了EGFR途径激活的生物标记物路线图-从基因型、EGFR-AS1 lncRNA水平、相对EGFR同种型表达和配体表达开始-从而强调了对建立用于高精确度患者富集策略的多维生物标记物套组的需要。而且，“沉默”同义变异影响EGFR成瘾的能力打开了发现现有靶向治疗的新生物标记物的新途径，具有即刻重新目的化和临床影响的巨大潜力。

最后，可能通过已经进入临床试验的基于RNAi的策略，lnc RNA EGFR-AS1已被证明是EGFR成瘾的真正的驱动者并且代表了鳞状细胞癌亚组中的新治疗靶标。

本文说明性描述的发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地而非限制地理解。另外，本文所用的术语和表达方式已经用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达方式时，无意排除所示以及所述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可以采用本文公开的发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。

本发明已在本文中广泛且一般性地描述。落入所述一般性公开内容中的各种更窄的种类和亚属分组亦形成本发明的一部分。这包括具有从该属中去除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般描述，无论是否在本文中具体记载了被移除的材料。

其他实施方案均在所附权利要求和非限制性实施例中。另外，当以马库什群组的方式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识的是，本发明也因此以所述马库什群组中的任何单独要素或要素亚组的方式来描述。

在本公开中，某些实施方案可以以范围形式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对所公开范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围如1至6的描述应当被认为具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及在该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这适用于任何宽度的范围。

实验部分

肿瘤样本和原代细胞培养物

收集患者来源的肿瘤并如先前所述进行处理(Leong HS,et al.Stem CellsTranslational Medicine 2014；3:1055-65)。在添加10％胎牛血清(FBS)(Hyclone,ThermoScientific Inc.,Fremont,CA)和1％青霉素-链霉素(Life Technologies,Amsterdam,Netherlands)的RPMI培养基(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)中在5％CO₂的潮湿气氛中在37℃培养所有的细胞系。细胞系来源和作为细胞系的来源的患者的临床病理特征的细节概述于图12中。通过对细胞系和原发性肿瘤进行靶向测序来鉴定细胞系的身份，以确定相同的SNP以及图13所示的显著突变。

细胞增殖测定和IC₅₀值的测定

细胞以2,000-4,000个细胞/孔密度接种于96孔组织培养板中的100μl完全生长培养基中。在连续稀释后，将100μl含有吉非替尼或厄洛替尼的完全生长培养基(BioVision，Milpitas，CA)添加到细胞中。DMSO用作对照。平板培养48小时，之后根据制造商的方案(Promega，Madison，WI)使用

发光测定法评估细胞生存力。

RNA复制的抑制

细胞在不含血清的培养基中饥饿24小时。溶解于二甲基亚砜中的最终浓度为5μg/ml的放线菌素D(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)与新鲜的不含血清的培养基一起添加，并在0小时、1小时、2小时和4小时间隔时收获细胞。

突变分析

根据厂商说明书(Qiagen，Valencia，CA)，使用QIAamp DNA mini试剂盒从原代细胞系中提取总基因组DNA。10ng DNA用于在离子湍流平台(Life Technologies,Amsterdam,Netherlands)上运行Ion AmpliSeq Colon和Lung Cancer Panel v1(Life Technologies,Amsterdam,Netherlands)。该组由靶向涉及结肠癌和肺癌的22个已知基因中的热点的引物对组成。22个基因为KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA、AKT1、ERBB2、PTEN、NRAS、STK11、MAP2K1、ALK、DDR2、CTNNB1、MET、TP53、SMAD4、FBX7、FGFR3、NOTCH1、ERBB4、FGFR1、FGFR2。

rAAV生产

在原代患者来源的细胞系中，使用Horizon AAV系统(Horizon Discovery Group，Cambridge，UK)进行例如NCC-HN1细胞系中的Q787Z基因型的靶向敲入。在转染前24小时，将1×10⁶HEK293细胞接种在100mm培养皿中，然后于5％CO₂培养箱中的具有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)中转染。根据制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies,Amsterdam,Netherlands)，将pAAV-EGFR(G或A)转染载体(Horizon Discovery Group，Cambridge，UK)以及来自AAV Helper-Free系统(Stratagene，La Jolla，CA)的pAAV-RC和pHelper质粒(各10μg)共转染。根据制造商的方案转染后48小时收获病毒。简言之，将培养基与HEK293细胞一起从烧瓶中吸出，并进行三次冷冻和融化循环。通过在4℃以13,000rpm离心来澄清裂解物以去除细胞碎片，将含有rAAV的上清液分成等分试样并在-80℃冷冻以供随后使用。

病毒感染和筛选重组体

细胞在100mm培养皿中生长直至70-80％汇合。除去已有的培养基后，将200μlrAAV裂解物和4ml Opti-MEM培养基(Life Technologies，Amsterdam，Netherlands)添加到细胞中。使病毒在37℃感染细胞4小时，之后用5ml新鲜培养基替换培养基。感染的细胞被允许生长48小时，然后通过胰蛋白酶消化被收获并被分配到12个具有含遗传霉素的培养基的96孔板中(Life Technologies，Amsterdam，Netherlands)。在收获和针对重组事件筛选之前，将平板在37℃温育2-3周。为了确认Horizon载体在预期位点成功整合到EGFR基因中，设计了位于载体中的新霉素开放阅读框的侧翼部分和EGFR的内含子20的引物，如图6所示。如前所述，使用基因组DNA进行PCR(Zhao Y,et al.Oncogene 2008；27:1-8)。

慢病毒shRNA敲低

在原代患者来源的细胞系中，使用shRNA慢病毒系统(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)进行细胞系例如NCC-HN1中的Q787Z基因型的靶向敲低。在感染前24小时，将细胞以1×10⁵的密度接种于6孔组织培养板中。除去培养基，用1MOI(感染复数)pLKO感染细胞。将1-EGFR同种型D-puro慢病毒颗粒(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)和4ml Opti-MEM培养基添加到细胞中。Lentival pLKO.1-Puro空载体对照转导颗粒用作对照。使病毒在37℃感染细胞4小时，并用5ml新鲜培养基替换。感染的细胞被允许生长48小时，然后用含嘌呤霉素的培养基(Life Technologies,Amsterdam,Netherlands)进行选择。

DNA、RNA和蛋白质分析

基因组DNA提取和PCR/测序如先前所述进行(Zhao Y,et al.Oncogene 2008；27:1-8)。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)和CFX96Real-time PCR系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)根据生产商的说明书进行基因组DNA和cDNA的实时PCR。以肌动蛋白作为标准化对照，重复进行三次反应。使用的引物序列列于表1中，并且使用Sanger测序来确认所有转录物的同一性。如先前所述进行SDS-PAGE蛋白质印迹(Leong HS,et al.Stem Cells Translational Medicine 2014；3:1055-65and Zhao Y,et al.Oncogene 2008；27:1-8)。使用的抗体如下：针对EGFR、磷光体(phosphor)-EGFR(Tyr1068)、AKT、磷光体-AKT(Ser473)、Erk1/2、磷光体-ERK1/2(Thr202/204)、s6、磷光体-S6(Ser235/236)(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)和GAPDH(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)的兔多克隆抗体。如先前所述进行总RNA提取和逆转录(Zhao Y,et al.Oncogene 2008；27:1-8)。

使用RNAscope的RNA原位杂交(ISH)

根据制造商的方案(Advanced Cell Diagnostics，Hayward，DA)，使用RNAscope2.0FFPE测定法进行EGFR AS1的原位杂交。将5μm患者来源的、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片送至新加坡健康服务公司进行RNA原位杂交。观察到棕色点状斑点的阳性染色。针对每个组织样品，进行阳性对照探针人肽基脯氨酰基异构酶B(PPIB)以及针对细菌基因DapB(DAPB)的阴性对照探针。

患者来源的异种移植物(PDX)和治疗研究

将原代且转移性肿瘤组织置于DMEM/F-12培养基中，并用解剖剪刀切成小块(直径0.8mm至1.5mm)。将这些块与20％Matrigel(Corning,Tewksbury,MA)混合，并皮下注射到雄性NOD-scidγ(NSG)小鼠的侧面(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ；005557；JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)。当肿瘤大小达到1.5cm³时，收获、处理并再次注射肿瘤，用于扩增(第1代或P1代)。重复该过程以扩大肿瘤组织。对于联合临床试验，使用P4代。吉非替尼(易瑞沙)(AstraZeneca，London，UK)通过将250mg临床级片剂溶解在含有0.05％Tween-80无菌水中至浓度为20mg/ml(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)来制备。当肿瘤大小达到0.5cm³时(HN137met为24天，HN137pri为12天)，开始用100mg/kg吉非替尼治疗小鼠或用等量的0.05％Tween-80水溶液作为对照。用卡尺每3天测量一次肿瘤大小。用吉非替尼治疗后12天(n＝5小鼠)，当治疗组的肿瘤大小达到2.0cm³时，小鼠被安乐死并被分析。

体内锁核酸(LNA)治疗

使用定制的锁核酸(LNA)寡核苷酸(Exiqon、Vedbaek、Denmark)进行体内EGFR-AS1敲低。根据制造商的方案进行使用定制LNA寡核苷酸的治疗。所用的针对EGFR-AS1(LNA-AS1)的LNA(15-mer RNA/LNA寡核苷酸)的定制序列是ATCGCAAAGGTAATC(SEQ ID NO：25)。阴性对照LNA 15-mer寡核苷酸(LNA-i-miR-NC)序列是AACACGTCTATACGC(SEQ ID NO：26)。两种寡核苷酸都含有硫代磷酸酯主链修饰，并通过HPLC纯化，随后进行Na⁺盐交换和冷冻干燥以供体内使用。将选择的患者来源的异种移植物传代，当认为肿瘤生长达到0.5cm³大小时，开始LNA治疗。LNA治疗以每周尾静脉注射5mg/kg的方式进行，并且在治疗的第一周后，处死来自实验和对照组的一只小鼠以确认敲低。当实验臂中的肿瘤不能测量时或当对照臂中的肿瘤超过2.0cm³时，停止治疗。

研究管理

对针对细胞系/患者来源的异种移植物繁殖的组织收集的研究和方案已经由Singhealth中央机构审查委员会(CIRB2007/441/B)批准。患有口腔鳞状细胞癌(OSCC)的患者和植入NSG小鼠的相应的患者来源的异种移植物中的联合临床试验在IMPACT-SG(用于临床试验分配的个体化分子谱)下开始(CIRB2011/441/B)。

表

表1：序列表

Claims

1.用于检测遗传变异的试剂在制备用于在预测患有癌症的受试者对用抗癌药物治疗的敏感性的方法中使用的诊断剂中的用途，其中所述方法包括检测存在于由致癌基因获得的反义链中的长非编码RNA中存在或不存在遗传变异，其中所述致癌基因是编码表皮生长因子受体的EGFR，并且所述遗传变异是SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列第2361位核苷酸的纯合G＞A突变；其中在存在所述纯合G＞A突变的情况下，预测所述受试者显示出与未携带所述纯合G＞A突变的受试者相比改善的对用所述抗癌药物治疗的敏感性；其中所述方法进一步包括测量所述受试者是否具有与对用所述抗癌药物治疗无响应的受试者相比低的EGFR-AS1表达水平并且其中在具有低的EGFR-AS1表达水平的情况下，预测所述受试者显示出与不具有低的EGFR-AS1表达水平的受试者相比改善的对用所述抗癌药物治疗的敏感性；并且其中所述抗癌药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼，并且所述癌症是口腔鳞状细胞癌。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括测量所述受试者是否具有与对用吉非替尼治疗无响应的受试者相比高的EGFR同种型D与EGFR同种型A转录水平的比值以预测敏感性，并且其中在具有高的EGFR同种型D与EGFR同种型A转录水平的比值的情况下，预测所述受试者显示出与不具有高的EGFR同种型D与EGFR同种型A转录水平的比值的受试者相比改善的对用吉非替尼治疗的敏感性。

3.用于检测遗传变异的试剂在制备用于在预测患有EGFR相关癌症的受试者对用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的敏感性的方法中使用的诊断剂中的用途，所述方法包括确定是否给出以下的i）：

i）所述受试者具有与对用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗无响应的受试者相比低的EGFR-AS1表达水平；

其中，在给出i）的情况下，预测所述受试者显示出与未显示i）的受试者相比改善的对用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的敏感性；并且

其中所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼，并且所述癌症是口腔鳞状细胞癌。

4.抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和EGFR酪氨酸激酶抑制剂在制备用于治疗患有癌症的受试者的组合物中的用途，

5.如权利要求4所述的用途，其中所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂是要与所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂同时施用，或者所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂是要在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用。

6.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为1-24小时。

7.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为至少1天。

8.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为至少2天。

9.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为至少3天。

10.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为至少4天。

11.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为至少5天。

12.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为至少6天。

13.如权利要求5所述的用途，其中，当所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂在所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂之后施用时，施用所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂和所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的时间间隔为至少7天。

14.如权利要求4-13中任一项所述的用途，其中所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂包括miRNA、shRNA、LNA或siRNA。

15.如权利要求4-13中任一项所述的用途，其中所述抑制EGFR-AS1表达的治疗剂包括靶向EGFR-AS1的LNA。