CN109563496A - 用于重组蛋白和/或病毒载体生产的细胞系 - Google Patents

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Abstract

公开了能够产生治疗性蛋白、抗体、载体和病毒载体的细胞和细胞系，病毒载体例如慢病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。细胞和/或细胞系可以在内源性二氢叶酸还原酶(DHFR‑/‑)或谷氨酰胺合成酶(GS‑/‑)基因中的一者或两者中具有突变或缺失，使得DHFR和/或GS表达或功能显著降低或消除。

Description

用于重组蛋白和/或病毒载体生产的细胞系
相关申请
本申请要求于2016年3月30日提交的美国临时专利申请No.62/315,480的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
谷氨酰胺合成酶(GS)是合成氨基酸L-谷氨酰胺的酶。因此，GS阴性细胞系对L-谷氨酰胺是营养缺陷型。已经报道GS作为基于CHO细胞的重组蛋白表达系统中的选择标记基因(Wurm et al.(2004)Nature Biotechnology 22:1393-1398)。当将盒引入GS阴性CHO系时，可以使用GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺选择含有GS基因的表达盒。
二氢叶酸还原酶(DHFR，5,6,7,8-四氢叶酸：NADP+氧化还原酶)是真核生物和原核生物两者中的酶，并且催化将二氢叶酸还原为四氢叶酸的NADPH依赖性还原，四氢叶酸是在胸苷酸、嘌呤核苷酸、甘氨酸和甲基化合物的生物合成中的一碳单元的必需载体。DHFR缺陷细胞仅在补充有叶酸代谢中涉及的某些因子的培养基中生长，或者如果向细胞提供DHFR，则例如作为转基因。
发明内容
本文公开了能够产生治疗性蛋白、抗体、载体和病毒载体(例如慢病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体)的细胞和细胞系。细胞和/或细胞系可以在内源性二氢叶酸还原酶(DHFR-/-)或谷氨酰胺合成酶(GS-/-)基因中的一者或两者中具有突变或缺失，使得DHFR和/或GS表达或功能显著降低或消除。
例如，降低可以通过DHFR和/或GS基因的单个等位基因敲除来实现。降低可以通过DHFR和/或GS基因中的突变(例如，取代或缺失)来实现，所述突变降低相应蛋白的功能或活性。消除可以通过DHFR和/或GS基因的双等位基因敲除来实现。
在具体的实施方案中，本发明的细胞和/或细胞系基于或衍生自人胚肾(HEK)细胞或细胞系，例如HEK293。如本文所公开的人胚胎肾(HEK)细胞或细胞系(例如HEK293)在内源性二氢叶酸还原酶(DHFR-/-)或谷氨酰胺合成酶(GS-/-)基因中的一者或两者中具有突变或缺失，使得DHFR和/或GS蛋白表达和/或功能显著降低或消除。
在具体的实施方案中，本发明的细胞和/或细胞系基于或衍生自人腺癌肺泡基底上皮细胞或细胞系。如本文所公开的，人A459细胞或细胞系在内源性二氢叶酸还原酶(DHFR-/-)或谷氨酰胺合成酶(GS-/-)基因中的一者或两者中具有突变或缺失，使得DHFR和/或GS蛋白表达和/或功能显著降低或消除。
在具体的实施方案中，本发明的细胞和/或细胞系基于或衍生自非洲绿猴的肾。如本文所公开的Vero细胞或细胞系在内源性二氢叶酸还原酶(DHFR-/-)或谷氨酰胺合成酶(GS-/-)基因中的一者或两者中具有突变或缺失，使得DHFR和/或GS蛋白表达和/或或功能显著降低或消除。
可以从单个细胞(克隆)中选择细胞系。克隆可以扩增，进而可以提供HEK细胞(如HEK293)、人A459细胞和/或Vero细胞的稳定的细胞系，其中内源性二氢叶酸还原酶(DHFR-/-)或谷氨酰胺合成酶(GS-/-)基因中的一者种或两者的突变或缺失使得DHFR和/或GS表达和/或功能显著降低或消除。
在一些方面，本文公开了人胚胎肾(HEK)细胞、人A459细胞和Vero细胞，其不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。在某些方面，本文提供了人胚胎肾(HEK)细胞系、人A459细胞系和Vero细胞系，其不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。
在一些实施方案中，HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系用第一异源核酸序列稳定或瞬时转染，并且任选地用第二异源核酸序列稳定或瞬时转染。在一些实施方案中，HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系用第一异源核酸序列和第一选择标记稳定或瞬时转染，并任选地用第二异源核酸序列和第二选择标记稳定或瞬时转染。在某些实施方案中，第一异源核酸序列编码治疗性蛋白或多核苷酸序列，并且在某些实施方案中，第二异源核酸序列编码治疗性蛋白或多核苷酸序列。由第一异源核酸序列编码的治疗性蛋白或多核苷酸序列和由任选的第二异源核酸序列编码的治疗性蛋白或多核苷酸序列可以相同或不同。在一些实施方案中，第一和/或第二选择标记不提供对抗生素的抗性。在某些实施方案中，第一和/或第二选择标记提供扩增第一和/或第二异源核酸序列的手段。在一些方面，第一和/或第二选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸。在一些方面，第一和/或第二选择标记包含编码具有GS功能的蛋白的核酸。在一些实施方案中，第一选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸，而第二选择标记包含编码具有GS功能的蛋白的核酸。
在本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系的一些方面，第一异源核酸序列包含第一载体，并且在一些实施方案中，任选的第二异源核酸序列包含第二载体。第一载体和任选的第二载体可以相同或不同。在一些实施方案中，第一载体和任选的第二载体各自包含选择标记，其包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸或编码具有GS功能的蛋白的核酸。在某些实施方案中，第一载体包含第一病毒载体，并且任选的第二载体包含第二病毒载体。在一些实施方案中，第一和/或第二病毒载体包含AAV载体基因组。在一些实施方案中，当HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系包含第一和第二病毒载体时，每种病毒载体包含AAV载体基因组或其部分。在某些实施方案中，AAV载体基因组包含位于异源核酸序列的5'和/或3'末端侧翼的一个或两个AAV ITR。
在某些方面，HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中的异源核酸序列和/或载体和/或病毒载体和/或AAV载体基因组的拷贝数为每个细胞介于10至5000个之间的拷贝。在一些实施方案中，HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中的异源核酸序列和/或载体和/或病毒载体和/或AAV载体基因组的拷贝数为介于每个细胞1-5个拷贝之间，介于每个细胞5-10个拷贝之间，介于每个细胞10-50个拷贝之间，介于每个细胞50-100个拷贝之间，介于每个细胞100-250个拷贝之间，介于每个细胞250-500个拷贝之间，介于每个细胞500-1000个拷贝之间，介于每个细胞1000-2000个拷贝之间，或每个细胞约2000、3000、4000或5000个拷贝，或大于每个细胞2000、3000、4000或5000个拷贝。在某些实施方案中，HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中的AAV载体基因组的拷贝数为每个细胞至少1000个拷贝，并且来自HEK细胞或HEK细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系的滚瓶(Roller Bottle)的所述rAAV载体颗粒产率任选为至少1×108vg/ml，或至少1×109vg/ml，或至少1×1010vg/ml，或至少1×1011vg/ml或至少2×1011vg/ml。在一些实施方案中，拷贝数在许多传代中表现稳定，例如，在至少或大于5、10、15、20、30、40、50或更多次传代中表现稳定且一致，例如，在约从任何较少的细胞传代产生的量的10-30％内。
在一些方面，本文提供的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系还包含AAV rep和/或cap序列。在一些实施方案中，AAV rep和/或cap序列由质粒提供，所述质粒瞬时或稳定转染到HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中。在一些实施方案中，本文提供的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系还包含AAV辅助功能序列。
在某些方面，本文提供的HEK细胞或HEK细胞系是HEK293。
在一些实施方案中，本文提供的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系在培养物或生长培养基中或适于长期储存的培养基中。在一些实施方案中，培养基或生长物包含甲氨蝶呤(MTX)和/或甲硫氨酸磺胺(MSX)。
在某些方面，本文提供的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系产生其中包装有一种或多种异源核酸序列(例如，如本文所述的第一和/或第二异源核酸)的rAAV载体颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV载体颗粒以比表达功能性内源性DHFR和/或GS的HEK293细胞生产的量大的量生产并且用具有所述异源核酸序列的AAV载体基因组瞬时转染。在某些实施方案中，与已经包装了由表达功能性内源DHFR和/或GS的HEK293细胞生产的污染DNA并且用具有所述异源核酸序列的rAAV载体基因组瞬时转染的AAV空衣壳和/或rAAV颗粒的量比，所生产的所述AAV载体颗粒含有已经包装污染DNA的较少量(例如，少至少1％，少至少10％或少至少50％)的rAAV空衣壳和/或较少量(例如，少至少1％，少至少10％或少至少50％)的rAAV颗粒。
在某些方面，异源核酸序列编码一种或多种治疗性蛋白。在某些方面，异源核酸序列编码一种或多种抑制因子。在一些实施方案中，异源核酸序列包含一种或多种抑制性核酸序列。在一些实施方案中，异源核酸序列编码治疗性蛋白和/或包含抑制性核酸序列。在某些实施方案中，治疗性蛋白包含凝血因子。在某些实施方案中，治疗性蛋白包含免疫球蛋白序列(例如，免疫球蛋白的氨基酸序列)。在一些实施方案中，抑制性核酸序列包含小或短发夹(sh)RNA、微小RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA。
在某些方面，用第一异源核酸序列稳定转染本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系。在一些实施方案中，用第一和/或第二异源核酸序列稳定转染本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系。
在一些方面，本文提供了从本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系分离和/或纯化的病毒或rAAV载体颗粒。
在一些方面，本文提供了从本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系分离和/或纯化的治疗性蛋白。
在一些方面，本文提供了生产治疗性蛋白、病毒载体和/或rAAV载体颗粒的方法，该方法包括在允许生产和/或分泌本文所述的治疗性蛋白、病毒载体或rAAV载体颗粒的条件下培养本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，并且从细胞培养物、培养基或细胞培养物和培养基(例如，包含HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系的细胞培养物、培养基或细胞培养物和培养基)中分离或纯化所述治疗性蛋白、病毒载体或rAAV载体颗粒。
在一些方面，本文提供了生产rAAV载体颗粒的方法，该方法包括在允许生产和/或分泌所述rAAV载体颗粒的条件下培养本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，并且从所述细胞培养物、培养基或细胞培养物和培养基中分离或纯化所述rAAV载体颗粒，其中当所述HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系具有至少1000个拷贝/细胞的AAV载体基因组时，来自HEK细胞或HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系的滚瓶的所述rAAV载体颗粒的产率为至少1×108vg/ml，或至少1×109vg/ml，或至少1×1010vg/ml，或至少1×1011vg/ml或至少2×1011vg/ml。
在一些方面，本文所述的第一和/或第二异源核酸序列编码基因产物，所述基因产物选自：胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲状旁腺激素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑制素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，TGFβ，激活素，抑制素，骨形态发生蛋白(BMP)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子NT-3和NT4/5，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养因子，集聚蛋白，导蛋白-1(netrin-1)和导蛋白-2(netrin-2)，肝细胞生长因子(HGF)，肝配蛋白(ephrins)，头蛋白(noggin)，音猬因子(sonic hedgehog)和酪氨酸羟化酶。
在某些方面，本文提供的是本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，或本文所述的方法，其中rAAV载体颗粒包含编码基因产物的所述第一和/或所述第二异源核酸序列，所述基因产物选自：胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲状旁腺激素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑制素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，TGFβ，激活素，抑制素，骨形态发生蛋白(BMP)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子NT-3和NT4/5，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养因子，集聚蛋白，导蛋白-1和导蛋白-2，肝细胞生长因子(HGF)，肝配蛋白，头蛋白，音猬因子和酪氨酸羟化酶。
在某些方面，本文提供的是本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，或本文所述的方法，其中所述第一和/或第二异源核酸序列编码基因产物，所述基因产物选自：血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL1至IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α，β和γ，干细胞因子，flk-2/flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I类和II类MHC分子。
在某些方面，本文提供的是本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，或本文所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码基因产物的所述第一和/或所述第二异源核酸序列，所述基因产物选自：血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL1至IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α，β和γ，干细胞因子，flk-2/flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I类和II类MHC分子。
在某些方面，本文提供的是本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，或本文所述的方法，其中所述第一和/或第二异源核酸序列编码用于校正天然存在的错误的蛋白，所述蛋白选自：氨基甲酰基合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨酸琥珀酸酯裂解酶，精氨酸酶，富马酰乙酰水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子V，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰辅酶A脱氢酶，丙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，胰岛素，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸盐，肝磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，RPE65，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
在某些方面，本文提供的是本文所述的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，或本文所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码用于校正天然存在的错误的蛋白的所述第一和/或所述第二异源核酸序列，所述蛋白选自：氨基甲酰基合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨酸琥珀酸酯裂解酶，精氨酸酶，富马酰乙酰水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子V，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰辅酶A脱氢酶，丙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，胰岛素，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸盐，肝磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，RPE65，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
在一些实施方案中，本文提供了生产不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)的人胚胎肾(HEK)细胞系、人A459细胞系和/或Vero细胞系的方法，该方法包括使内源性DHFR基因突变或敲除内源性DHFR基因。
在一些实施方案中，本文提供了生产不表达功能性内源性谷氨酰胺合成酶(GS)的人胚胎肾(HEK)细胞系、人A459细胞系和/或Vero细胞系的方法，其包括使所述内源性GS基因突变或敲除所述内源性GS基因。
在一些实施方案中，本文提供了生产不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的人胚肾(HEK)细胞系、人A459细胞系和/或Vero细胞系的方法，其包括使所述内源DHFR基因和GS基因突变或敲除所述内源DHFR基因和GS基因。
附图说明
图1显示了人胚肾(HEK)细胞或细胞系(例如HEK293)的产生的简要概述，以及用于产生重组蛋白和病毒载体(例如AAV)的用途。
图2显示了由本发明的示例性HEK293克隆(稳定细胞系)产生的rAAV载体的量。Y轴显示由滚瓶中的每个HEK293克隆产生的AAV载体(载体基因组，vg)。
具体实施方式
具有这种经修饰的基因或从HEK细胞(例如HEK293细胞)敲除的基因的细胞克隆是具有DHFR-/-和/或GS-/-基因组背景的人细胞的第一克隆。这些细胞和细胞系可用于产生许多不同的重组生物材料，例如重组蛋白(例如抗体，例如单克隆抗体)和病毒载体。所产生的重组蛋白和病毒载体可用于治疗疾病。在特定应用中，所产生的病毒载体(例如，lenti-或AAV)可用于敲入(例如，引入异常或缺失的功能性蛋白)基因治疗应用。在特定应用中，所产生的病毒载体(例如，慢AAV或AAV)可用于敲除(例如，引入抑制性序列，例如反义序列，以靶向表达或功能异常或不合乎要求的内源蛋白，例如导致病理或疾病或与病理或疾病相关的突变蛋白)基因治疗应用。
本发明将通过充分表征的人类细胞系中的基因扩增系统为生物产品(例如蛋白)和其他生物材料(包括重组蛋白、抗体，包括AAV，慢病毒和其他病毒的病毒载体)的生产提供益处。另外的益处是用于生产需要人细胞内环境以进行折叠、修饰(翻译后)和运行的蛋白。
本发明使用充分表征的人细胞或细胞系创建新的生产系统。选择用于创建产生rAAV的细胞系的亲本克隆是从HEK(例如，HEK293)细胞、人A459细胞或Vero细胞工程改造出来的，具有显著减少或消除的DHFR和/或GS基因，例如单敲除或双敲除DHFR和/或GS基因。本发明的具有显著减少或消除的DHFR和/或GS基因(例如单敲除或双敲除DHFR和/或GS基因)的人HEK(例如，HEK293)、人A459和/或Vero细胞和细胞系将使生物产品的翻译后修饰更接近于其在人体中的天然修饰，并因此提高生物产品的安全性和生物活性。
消除(例如，敲除)DHFR和GS基因中的一者或两者而为HEK293细胞、人A459细胞和/或Vero细胞产生一个或两个选择标记。可以通过在培养基中培养细胞来选择其内已稳定整合有DHFR选择标记的本发明的HEK细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系。此外，与DHFR选择标记分开的异源核酸序列(例如，两个分开的质粒)或作为单个多核苷酸序列的异源核酸序列(例如，在相同的质粒上，例如AAV载体质粒)都可以在引入细胞时整合。因此，当DHFR转基因添加或包含异源核酸序列(例如，编码感兴趣的蛋白或核酸)时，可以选择表达DHFR和感兴趣的蛋白或核酸的细胞。
可以通过在培养基中培养细胞来选择其内已稳定整合有GS选择标记的本发明的HEK细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系。与GS选择标记分开的异源核酸序列(例如，两个分开的质粒)或作为单个多核苷酸序列的异源核酸序列(例如，在相同的质粒上，例如AAV载体质粒)都可以在引入细胞时整合。因此，当GS转基因添加或包含异源核酸序列(例如，编码感兴趣的蛋白或核酸)时，可以选择表达GS和感兴趣的蛋白或核酸的细胞。
响应于诸如甲氨蝶呤(MTX)之类的抑制剂，DHFR基因拷贝数以及因此在DHFR基因的近侧整合的异源核酸序列可以在本发明的HEK细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系中扩增。响应于诸如甲硫氨酸亚砜亚胺(MS)之类的抑制剂，GS基因拷贝数以及因此在GS基因近侧整合的异源核酸序列可以在本发明的HEK细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系中扩增。
因此，通过将细胞逐渐暴露于浓度递增的MTX和/或MS，可以扩增编码感兴趣的蛋白或核酸序列的在外源DHFR和/或GS近侧整合或与外源DHFR和/或GS共同整合的感兴趣的序列，导致编码的感兴趣的蛋白或核酸的表达增加。
本文公开的研究显示获得了具有高拷贝数rAAV基因组的HEK293克隆。在特定示例中，rAAV基因组编码治疗性人FIX，rAAV基因组的拷贝达到超过千拷贝的水平，这显著高于报道的大多数稳定细胞系中的水平。rAAV基因组的高拷贝数导致高的rAAV-hFix生产量。该高拷贝数在许多传代中表现稳定，例如，在至少或大于5、10、15、20、30、40、50或更多次传代中表现稳定。
除了高的rAAV生产量之外，还评估了由生产HEK293rAAV载体的细胞系生产的rAAV制剂的质量。似乎在HEK293的稳定克隆中的高rAAV基因组拷贝可以进一步减少包装在rAAV颗粒中的DNA杂质并降低空颗粒的相对于基因组包装载体的比例。
除稳定产生HEK293克隆中的高拷贝rAAV基因组外，本发明的HEK(例如，HEK293)细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系也能够通过诱导MTX和/或MSX进行基因扩增，这将进一步扩增在HEK(例如，HEK293)细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系中的rAAV基因组。扩增将进而增加rAAV基因组的数量，从而通过工程化HEK(例如HEK293)细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系增加rAAV的产量。
本发明的HEK细胞或细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系，例如HEK细胞的敲入克隆(HEK293单DFHR-/-或GS-/-或双DFHR-/-/GS-/-)，可用于生产任何AAV血清型的rAAV载体。例如，本发明的HEK细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系，例如HEK293r AAV-hFix DFHR-/-/GS-/-的病毒(例如，AAV)载体敲入克隆，可用于生产任何AAV血清型的rAAV-hFix载体，并且所产生的载体可通过基因疗法用于治疗血友病B。
其中本发明的HEK细胞或细胞系可用于制备病毒(例如AAV)载体的特定非限制性方法描述于US 2013/0072548(USSN 13/561,753)；US2014/0349403(USSN 14/364,623)；和US 2014/0323556(USSN 14/216,778)中。
“选择标记”是指多核苷酸或基因，其在引入时和在由细胞表达时，在适当的选择性培养条件下，允许选择表达所述选择标记的细胞。选择标记可以是DHFR和/或GS，特别是编码具有DHFR和/或GS功能或活性的蛋白的多核苷酸或基因，例如编码由本发明的HEK(例如，HEK293)细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系或在其内表达的DHFR和/或GS蛋白的多核苷酸或基因。
明确包括所有哺乳动物和非哺乳动物形式的DHFR蛋白和GS蛋白以及编码核酸。可以使用本领域技术人员已知的合适的DHFR蛋白和GS蛋白以及相应的基因。DHFR和GS蛋白可以衍生自任何物种，只要其保留在发明的HEK(例如，HEK293)细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系中的至少部分功能或活性即可。DHFR和/或GS蛋白包括天然存在的多态形式。
DHFR和/或GS可以是野生型DHFR和/或GS或其功能变体或衍生物。术语“变体”或“衍生物”包括具有一个或多个氨基酸序列交换物(例如缺失、取代或添加)的DHFR和/或GS蛋白(该术语也可以指编码此类蛋白的核酸序列)，含有DHFR和/或GS蛋白或其功能片段的融合蛋白，其中，所述氨基酸序列交换物与相应的DHFR和/或GS蛋白的氨基酸序列相关。变体包括保留DHFR和/或GS蛋白的至少部分功能或活性的DHFR和/或GS蛋白。
DHFR和/或GS蛋白的变体和衍生物已被修饰以提供仍具有DHFR和/或GS蛋白的至少一种功能的额外的结构和/或功能，以及前述的功能片段。例如，DHFR和/或GS蛋白可以用作选择标记，例如其相应地与野生型DHFR或GS蛋白相比和/或与由HEK(例如，HEK293)细胞、人A459细胞和/或Vero细胞内源性表达的DHFR或GS蛋白相比，对于抗叶酸剂(如MTX)更敏感或更不敏感，或者对MS更敏感或更不敏感。
例如，相比于在本发明的HEK(例如，HEK293)细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系中表达的内源DHFR酶，用作选择标记的DHFR蛋白对DHFR抑制剂(如MTX)更敏感。这种DHFR进而提供了用于稳健扩增DHFR选择标记并进而稳健扩增异源核酸/载体序列的手段。
术语“载体”是指小载运体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)、或可以通过插入或掺入核酸来操作的其他载体。载体可用于遗传操作(即“克隆载体”)，以将多核苷酸引入/转移到细胞中，以及在细胞中转录或翻译插入的多核苷酸。“表达载体”是含有具有在宿主细胞中表达所需的必需调节区的基因或核酸序列的载体。载体核酸序列通常包含至少一个用于在细胞中增殖的复制起点和任选的其他元件，例如异源核酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、内含子、反向末端重复序列(ITR)、可选的选择标记(例如DHFR、GS等)、多腺苷酸化信号。
病毒载体衍生自或基于包含病毒基因组的一种或多种核酸元件。具体的病毒载体包括慢病毒、假型慢病毒和细小病毒载体，如腺相关病毒(AAV)载体。包括AAV的细小病毒可用作基因治疗载体，因为它们可以穿透细胞并引入核酸/遗传物质，使得核酸/遗传物质可以稳定地保持在细胞中。此外，这些病毒可以将核酸/遗传物质引入特定位点，例如19号染色体上的特定位点。由于AAV与人类的致病性疾病无关，因此AAV载体能够传递异源核酸序列(例如，治疗性蛋白和药剂)给人类患者而不引起实质性AAV发病机理或疾病。
作为载体的修饰物，例如重组病毒，例如慢病毒或细小病毒(例如rAAV)载体，以及序列的修饰物，例如重组多核苷酸和多肽，术语“重组”意指组合物已经被以通常不在自然界中发生的方式操纵(即，工程化)。重组载体(例如AAV载体)的具体示例会是通常在野生型病毒(例如AAV)基因组中不存在的多核苷酸插入病毒基因组中的情形。重组载体的示例是将编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的核酸(例如基因)克隆到载体中的情况，其具有或不具有通常在病毒(例如AAV)基因组内缔合该基因的5'、3'和/或内含子区。尽管在本文提及载体，例如病毒和AAV载体以及序列诸如多核苷酸时，不总是使用术语“重组”，但包括多核苷酸在内的重组形式明确地被包括，虽然存在任何此类省略。
通过使用分子方法从病毒(例如AAV)基因组中移除野生型基因组，并用非天然(异源)核酸(例如编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的核酸)替代而由病毒(例如AAV)的野生型基因组衍生出重组病毒“载体”或“rAAV载体”。通常，对于AAV而言，AAV基因组中的反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”病毒载体(例如rAAV)区别于病毒(例如AAV)基因组，因为病毒基因组的全部或一部分已用关于病毒(例如AAV)的基因组核酸的非天然序列(例如用编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的异源核酸)替代。因此，并入非天然序列将病毒载体(例如AAV)定义为“重组”载体，其在AAV的情况下可被称为“rAAV载体”。
重组载体(例如慢AAV或细小AAV)序列可以被包装-在本文中称为“颗粒”，其用于随后在离体、体外或体内感染(转导)细胞。当重组载体序列被衣壳化或包装到AAV颗粒中时，该颗粒也可以称为“rAAV”。这样的rAAV颗粒包括衣壳化或包装矢量基因组的蛋白。具体示例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下，包括衣壳蛋白。
载体“基因组”指重组质粒序列的部分，其最终被包装或衣壳化以形成病毒(例如rAAV)颗粒。在使用重组质粒构建或制造重组载体的情况下，载体基因组不包含“质粒”的不对应于重组质粒的载体基因组序列的部分。这种重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增(其是繁殖和重组病毒生产所需的过程)而言是重要的，但其本身不被包装或衣壳化成病毒(例如rAAV)颗粒。因此，载体“基因组”是指由病毒(例如rAAV)包装或衣壳化的核酸。
如本文所使用的，术语“血清型”是区别点，其用于指具有在血清学上与其它AAV血清型不同的衣壳的AAV。血清学特殊性基于与另一种AAV相比，对一种AAV缺乏抗体之间的交叉反应性来确定。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的不同(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)导致。
在传统定义下，血清型意指感兴趣的病毒已经针对对于所有现存和已表征的血清型具有特异性的血清进行了中和活性的测试，并且未发现中和感兴趣的病毒的抗体。随着更多的自然出现的病毒分离物被发现和/或衣壳突变体生成，可能存在或可能不存在与当前存在的血清型中任一种的血清学差异。因此，在新病毒(例如AAV)不具有血清学差异的情况下，这种新病毒(例如AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，中和活性的血清学测试尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行，以根据传统血清型定义确定它们是否是另一种血清型。因此，为了方便和避免重复，术语“血清型”广义上是指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及可能在给定血清型的亚群或变体内的，不是血清学上不同的病毒(例如AAV)。
重组载体(例如rAAV)包括任何病毒株系或血清型。作为非限制性示例，重组载体(例如AAV)质粒或载体(例如AAV)基因组或颗粒(衣壳)可基于任何AAV血清型，例如AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11。此类载体可以基于相同的株系或血清型(或亚组或变体)，或彼此不同。作为非限制性示例，基于一种血清型基因组的重组载体(例如rAAV)质粒或载体(例如AAV)基因组或颗粒(衣壳)可以与包装载体的衣壳蛋白中的一种或多种相同。另外，重组载体(例如AAV)质粒或载体(例如AAV)基因组可以基于AAV(例如，AAV2)血清型基因组，其不同于包装载体基因组的衣壳蛋白中的一种或多种，在这种情况下，三种衣壳蛋白中的至少一种可以是例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10，AAV11或其变体。因此，AAV载体包括与特定血清型以及混合血清型特征的基因/蛋白序列相同的基因/蛋白序列。
在各种示例性实施方案中，rAAV载体包含与一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白具有至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同一性的序列或由其组成。在各种示例性实施方案中，rAAV载体包含与一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11ITR具有至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)的序列或由其组成。
重组载体(例如rAAV)，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11及其他，以及变体，杂合和嵌合序列，可以使用本领域技术人员已知的重组技术构建，以包括与一个或多个功能性AAV ITR序列侧接的一个或多个异源多核苷酸序列(转基因)。这些载体具有一个或多个全部或部分缺失的野生型AAV基因，例如rep和/或cap基因，但保留至少一个功能性侧接ITR序列，这是将重组载体拯救、复制和包装到rAAV载体颗粒中所必需的。因此，rAAV载体基因组将包括顺式复制和包装所需的序列(例如，功能性ITR序列)。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以指称所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。核酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸。核酸可以为单链、双链或三链的、线性或环状的，并且可以具有任何长度。在讨论核酸时，可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例在本文中描述具体多核苷酸的序列或结构。
“异源”核酸序列是指多核苷酸，其插入载体(例如AAV)中，以用于将多核苷酸经载体介导转移/递送到细胞中。异源核酸序列通常不同于载体(例如AAV)核酸，即相对于病毒(例如AAV)核酸是非天然的。一旦转移/递送到细胞中，可以表达载体内包含的异源核酸序列(例如，如果合适的话，转录并且翻译)。替代地，不需要表达在细胞内的在载体内包含的转移/递送的异源多核苷酸。尽管本文在提及核酸序列和多核苷酸时，并未总是使用术语“异源”，但即使在不存在修饰语“异源”的情况下提及核酸序列或多核苷酸也意味着包括异源核酸序列和多核苷酸，尽管省略也如此。
由“核酸序列”编码的“多肽”、“蛋白”或“肽”包括全长天然序列，如天然存在的蛋白，以及功能性子序列、修饰形式或序列变体，只要子序列、修饰形式或变体保留一定程度的天然全长蛋白的功能性即可。此类由核酸序列编码的多肽，蛋白和肽可以但不必要与内源蛋白相同，所述内源蛋白是缺陷的，或其在经处理的哺乳动物中表达不充分或不足。
本文使用“转基因”以方便地表示旨在或已被引入细胞或生物体的核酸(例如异源的)。转基因包括任何核酸，例如编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的异源核酸。
在具有转基因的细胞中，已经通过细胞的质粒或载体(例如AAV)、“转导”或“转染”引入/转移转基因。术语“转导”和“转染”是指将分子(诸如核酸)引入细胞(例如HEK293)或宿主生物体中。转基因可以整合或可以不整合到受体细胞的基因组核酸中。如果引入的核酸整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，则其可稳定保持在该细胞或生物体中并且进一步传代到后代细胞或受体细胞的生物体或生物体的细胞中或由后代细胞或受体细胞的生物体或生物体遗传。
“转导细胞”是其中已引入转基因的细胞。因此，“转导的”细胞意指在外源分子例如核酸(例如转基因)并入细胞中之后，细胞中的基因变化。因此，“转导的”细胞是其中已引入外源核酸的细胞或其后代。细胞可以繁殖(培养)，并且表达引入的蛋白或转录核酸，或者由细胞产生载体，例如rAAV。对于基因治疗用途和方法，转导细胞可以在受试者中。
如本文所使用的，关于细胞的术语“稳定的”或“稳定整合的”是指核酸序列，例如可选择标记或异源核酸序列，或质粒或载体已(例如，通过同源重组、非同源末端连接、转染等)插入染色体中或者维持在受体细胞或宿主生物中在染色体外，并且维持在染色体中或维持在染色体外持续了一段时间。在培养细胞的情况下，可以在多个细胞传代过程中维持已插入染色体的核酸序列，例如选择标记或异源核酸序列、或质粒或载体。
“表达控制元件”是指影响可操作地连接的核酸的表达的核酸序列。控制元件，包括本文所述的表达控制元件，诸如启动子和增强子。包括rAAV载体的载体序列可包括一个或多个“表达控制元件”。通常，包括此类元件以有利于适当的异源多核苷酸转录和适当情况下的翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、维持基因的正确阅读框以允许mRNA的框内翻译和终止密码子等)。这些元件通常以顺式作用，其被称为“顺式作用”元件，但也可以反式作用。
表达控制可以在转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平下实现。通常，调节转录的表达控制元件靠近转录核酸的5'端(即“上游”)并置。表达控制元件也可位于转录序列的3'末端(即“下游”)处或转录物内(例如在内含子中)。表达控制元件可以邻近或远离转录序列定位(例如，距多核苷酸1-10个、10-25个、25-50个、50-100个、100-500个或更多个核苷酸)，甚至以相当远的距离定位。然而，由于某些载体(例如rAAV载体)的长度限制，表达控制元件通常在距离转录核酸1至1000个核苷酸内。
在功能上，可操作地连接的核酸的表达至少部分地可由元件(例如启动子)控制，使得元件调节核酸的转录以及适当时调节转录物的翻译。表达控制元件的具体示例是启动子，其通常位于转录序列的5'端。与不存在启动子时表达的量相比，启动子通常增加从可操作地连接的核酸表达的量。
如本文所用的“增强子”可以指邻近核酸序列，例如可选择标记，或异源核酸序列定位的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也在序列的下游或序列内起作用且能位于序列的下游或序列内。因此，增强子元件可位于上游或下游，例如，在可选择标记和/或编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的异源核酸的100个碱基对、200个碱基对、或300个或更多个碱基对内。增强子元件通常使可操作连接的核酸的表达增加高于由启动子元件提供的表达。
术语“可操作地连接”是指将核酸序列表达所必需的调控序列置于相对于该序列的适当位置，以便实现核酸序列的表达。有时将相同的定义施用于表达载体(例如rAVV载体)中核酸序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。
在与核酸可操作连接的表达控制元件的示例中，所述关系使得控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两个DNA序列意指两个DNA以使得至少一个DNA序列能够对另一个序列施加生理效应的这样的关系(顺式或反式)排列。
因此，载体的附加元件包括但不限于表达控制(例如启动子/增强子)元件、转录终止信号或终止密码子、侧接序列如AAV ITR序列中的一个或多个拷贝的5'或3'非翻译区(例如聚腺苷酸化(polyA)序列)、或内含子。
其他元件包括例如填料或填充物多核苷酸序列，例如以改善包装并减少污染核酸的存在。AAV载体通常接受具有一般为约4kb至约5.2kb或略多的尺寸范围的DNA插入片段。因此，对于较短的序列而言，包含填充物或填料以便将长度调整至对于包装入rAAV颗粒的载体而言可接受的病毒基因组序列的正常大小或接近正常大小。在各种实施方案中，填料/填充物核酸序列是核酸的未翻译(非蛋白编码)区段。对于小于4.7Kb的核酸序列，填料或填充物多核苷酸序列具有当与该序列组合(例如插入载体中)时具有介于约3.0-5.5Kb之间、或介于约4.0-5.0Kb之间、或介于约4.3-4.8Kb之间的总长度的长度。
在一实施方案中，“治疗性蛋白”是可以减缓或减轻由细胞或受试者中蛋白的量不足、缺乏或缺陷引起的症状的肽或蛋白。由转基因编码的“治疗性”蛋白可赋予受试者益处，例如，以纠正遗传缺陷，纠正基因(表达或功能)缺陷等。
编码可根据本发明使用的基因产物(例如治疗性蛋白)的异源核酸的非限制性示例包括可用于治疗包括但不限于以下项在内的疾病或病症的那些：“止血”或血液凝固障碍，例如血友病A，具有抑制性抗体的血友病A患者，血友病B，凝血因子VII、VIII、IX和X、XI、V、XII、II、血管性血友病因子中的缺陷，组合的FV/FVIII缺陷，地中海贫血，维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症、γ-羧化酶缺陷；贫血，与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血障碍、弥漫性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药(即FXa抑制剂)相关的过度抗凝；和血小板功能障碍如Bernard Soulier综合征、Glanzman血小板功能障碍和储存池缺损。
可以通过使用重组DNA技术方法来制备核酸分子、诸如克隆的载体、表达载体(例如载体基因组)和质粒。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过各种手段制备核酸分子。例如，可使用各种标准克隆、重组DNA技术，经由细胞表达或体外翻译和化学合成技术来制备编码因子IX(FIX)的核酸。多核苷酸的纯度可以通过测序、凝胶电泳等来测定。例如，可使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术来分离核酸。这些技术包括但不限于：(1)基因组DNA或cDNA库与探针杂交以检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛选以检测具有共享结构特征的多肽，例如使用表达文库；(3)使用能够对感兴趣的核酸序列退火的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)；(4)针对相关序列对序列数据库进行计算机搜索；和(5)减去的核酸库的差异筛选。
如本文所公开的，根据本发明的产生重组病毒载体(如rAAV载体)的方式是在发明的HEK(例如，HEK293)细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中表达编码治疗性蛋白或多核苷酸的异源核酸。细胞或细胞系将为病毒(例如AAV)载体包装提供辅助功能，并在适当的培养条件下产生rAAV。因此，本发明提供产生重组病毒载体(例如rAAV载体)的HEK(例如，HEK293)细胞和细胞系、人A459细胞和细胞系和/或Vero细胞和细胞系，以及产生重组病毒载体(例如rAAV载体)的方法。本发明的HEK(例如，HEK293)细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系包括异源核酸的表达以及为病毒(例如AAV)载体包装提供辅助功能。该方法包括在本发明的为病毒(例如AAV)载体包装提供辅助功能的HEK(例如，HEK293)细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中表达异源核酸。
如本文还公开的，根据本发明的产生重组蛋白的方法将在发明的HEK(例如，HEK293)细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中表达编码这种蛋白的核酸。因此，本发明还提供了产生重组蛋白的细胞以及制备重组蛋白的方法。本发明的HEK(例如，HEK293)细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系包括编码重组蛋白的核酸的表达。该方法包括在发明的HEK(例如，HEK293)细胞或细胞系、人A459细胞或细胞系和/或Vero细胞或细胞系中表达编码重组蛋白的核酸。
当用作组合物的改性剂时，术语“分离的”是指组合物由人工制造或完全或至少部分地从其天然存在的体内环境中分离。通常，分离的组合物基本上不含一种或多种其通常天然与之缔合的物质，例如一种或多种蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。
关于蛋白，本文中有时使用术语“分离的蛋白”或“分离和纯化的蛋白”。该术语主要指通过表达核酸分子产生的蛋白。另选地，该术语可指已经与可与其天然缔合的其它蛋白充分分离，以便以“基本上纯”的形式存在的蛋白。
术语“分离的”不排除由人工制备的组合，例如重组载体序列，或包装或包裹载体基因组(例如rAAV)的病毒颗粒和药物制剂。术语“分离的”也不排除组合物的另选物理形式，例如杂合体/嵌合体、多聚体/寡聚体、修饰(例如磷酸化、糖基化、脂质化)或衍生化形式，或在由人工产生的宿主细胞中表达的形式
当提及具体核苷酸序列或氨基酸序列时，短语“基本上由...组成”是指具有给定序列的特性的序列。例如，当在提及氨基酸序列使用时，该短语包括序列本身和不影响该序列的基本特性和新型特征的分子修饰。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但本文描述了适宜的方法和材料。
本文引用的所有申请、出版物、专利和其它参考文献、基因库(GenBank)引用和ATCC引文以参考形式全文并入。在冲突的情况下，说明书(包括定义)将起控制作用。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征结构可由用于相同、等同或相似用途的另选的特征结构替代。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征结构(例如，核酸序列、载体、病毒载体、rAAV载体等)是具有等同或相似特征结构的示例。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“核酸序列”或“选择标记”包括多个这样的核酸序列和选择标记，并且提及“一载体”包括多个这样的载体，例如rAAV载体。
如本文所用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或数值范围包括此类范围内的整数和值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，提及80％或更多的同一性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。
提及具有更多(更大)或更少的整数分别包括大于或小于参考数值的任何数值。因此，例如，提及小于100，包括99、98、97等，一路下降到数值一(1)；并且小于10，包括9、8、7等，一路下降到数值一(1)。
如本文所使用的，所述的数值或范围都是包含端值的。此外，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括此类范围内的值和整数的分数，以及此类范围内的整数的分数。因此，为了说明，提及数值范围，诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此提及1-50的范围包括11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最多至并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等。
提及一系列范围包括将该系列内的不同范围的边界的值组合的范围。因此，为了说明提及的一系列范围，例如范围1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5500-6000、6000-7000、7000-8000、或8000-9000，包括范围10-50、50-100、100-1000、1000-3000、2000-4000等。
本文通常使用肯定语言描述多个实施方案和方面来公开本发明。本发明还具体地包括其中全部或部分排除特定主题，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，尽管本发明在本文中一般不就本发明不包括的内容进行表达，但本发明中未明确排除的方面在本文中公开。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
该实施例描述了生产本发明的HEK细胞和细胞系，以及随后的病毒基因组的转移和病毒(AAV)载体产量。
本发明的HEK细胞和细胞系可以通过敲除细胞的内源DHFR基因和/或GS基因以多种方式产生。例如，某些非限制性方法包括用于靶向切割和基因失活的锌指核酸酶(ZFN)(参见，例如，美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；2008/0015164；和国际公布WO 07/014275)。ZFN提供了在选定的基因组地址处放置双链DNA断裂(DSB)的能力。当提供供体DNA时，或通过非同源末端连接(NHEJ)，通过细胞自身的DNA修复机制经由同源定向修复过程进行该位点特异性DSB的去除-参见例如Urnov et al.(2005)Nature 435:646-651(2005)；Moehle et al.(2007)ProcNatl Acad Sci USA104:3055-3060(2007)；Bibikova,et al.(2001)Mol Cell Biol 21:289-297；Bibikova et al.(2003)Science 300:764；Porteus et al.(2005)NatureBiotechnology 23:967-973；Lombardo et al.(2007)Nature Biotechnology 25:1298-1306；Perez et al.(2008)Nature Biotechnology 26:808-816；Bibikova et al.(2002)Genetics 161:1169-1175；Lloyd et al.(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102:2232-2237；Morton et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103:16370-16375。
CRISPR/Cas9编辑是能够被用于生产本发明的降低表达内源性DHFR和/或GS或敲除内源DHFR基因和/或GS基因的HEK、人类A459和/或Vero细胞、细胞系和细胞克隆的另一种方法。用于靶向基因修改/删除的CRISPR/Cas9系统已经被广泛描述(参见，例如，Qi LS,etal.Cell.152(5),1173–1183(2013)；Cong L,et al.Science.339(6121),819–823(2013)；Hsu PD,et al.Cell.157(6),1262–1278(2014)；Hsu PD,et al.Nat Biotechnol.31(9),827–832(2013)；和Doudna JA,Charpentier E.Science.346(6213),1258096(2014))。
与DHFR基因表达盒或GS表达盒相关的rAAV-hFix构建体被构建并被转染到HEK293DHFR-/-/GS-/-细胞系中。使用MTX或MSX作为选择标记分离稳定的克隆。克隆含有高拷贝数的rAAV-hFiX基因组，并且维持产生更多的rAAV载体以用于进一步表征。许多分离的细胞克隆是稳定的并且证明是高AAV生产量的(图2)。
实施例2
该实施例描述了本发明的HEK细胞和细胞系的某些非限制性特征。
例如，一般情况下：
A.稳定的生产者克隆。
B.敲除DHFR和/或GS基因的人哺乳动物生产细胞克隆将能够选择稳定的克隆以使用DHFR或GS基因(或两者)作为选择标记来表达感兴趣的基因，对于任何感兴趣的基因或病毒载体可以创建克隆。
C.更安全生产人细胞系，其适合于制造具有基因扩增功能的生物产品以提供高生产率。
D.产生的细胞系的DHFR和/或GS阴性基因组背景将使得能对感兴趣的基因进行基因扩增，因此导致高比生产率。
E.清洁基因组背景，不需要引入抗生素标记来选择阳性生产者克隆，因此更安全的克隆用来制造重组蛋白，病毒载体，如rAAV载体。
F.显著降低劳动力成本和材料成本。
例如，对于rAAV生产：
A.增加rAAV产量
B.易于扩大生产规模以进行大批量/大规模的rAAV生产。
C.与涉及辅助病毒的生产系统比较的更安全的生产系统，例如使用腺病毒作为辅助生产系统或基于杆状病毒的生产系统。
D.通过减少空颗粒和减少rAAV载体中包装的DNA杂质，生产具有少量空衣壳的rAAV载体。
E.对于某些细胞克隆获得了高拷贝数的rAAV基因组，鉴定了高rAAVhFix生产者克隆。
F.用DHA/GS双敲入rAAVhFix基因组允许rAAVhFix基因组的大量扩增，因此导致高rAAV产量。
例如，对于蛋白生产：
A.HEK、人A459和/或Vero细胞和细胞系可折叠和修饰生物产品以更接近其天然条件，如同在人类中生产，因此自HEK、人A459和/或Vero细胞和细胞系生产的产物会更安全，更有效。
B.自HEK产生的生物产物(例如，所生产的HEK293DHFR-/-/GS-/-细胞克隆)和/或人A459将使得翻译后修饰更接近其来自人体的天然产物，因为HEK(例如，HEK293)和A549细胞是人细胞系，而不是另一种非人类细胞。

Claims (47)

1.一种人胚胎肾(HEK)细胞，其不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。
2.一种人胚胎肾(HEK)细胞系，其不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。
3.根据权利要求1或2所述的HEK细胞或细胞系，其用第一异源核酸序列稳定或瞬时转染，并任选地用第二异源核酸序列稳定或瞬时转染。
4.根据权利要求1或2所述的HEK细胞或细胞系，其用第一异源核酸序列和第一选择标记稳定或瞬时转染，并任选地用第二异源核酸序列和第二选择标记稳定或瞬时转染。
5.根据权利要求3或4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一异源核酸序列编码治疗性蛋白或多核苷酸序列，并且任选的第二异源核酸序列编码治疗性蛋白或多核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中由所述第一异源核酸序列编码的所述治疗性蛋白或多核苷酸序列和由所述任选的第二异源核酸序列编码的所述治疗性蛋白或多核苷酸序列相同或不同。
7.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记不提供对抗生素的抗性。
8.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记提供扩增所述第一和/或第二异源核酸序列的手段。
9.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸。
10.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记包含编码具有GS功能的蛋白的核酸。
11.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸，而所述第二选择标记包含编码具有GS功能的蛋白的核酸。
12.根据权利要求3-11所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一异源核酸序列包含第一载体，并且所述任选的第二异源核酸序列包含第二载体。
13.根据权利要求11或12所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一载体和任选的第二载体相同或不同。
14.根据权利要求11或12所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一载体和任选的第二载体各自包含选择标记，所述选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸或编码具有GS功能的蛋白的核酸。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一载体包含第一病毒载体，而任选的第二载体包含第二病毒载体。
16.根据权利要求12-14中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二病毒载体包含AAV载体基因组。
17.根据权利要求12-14中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其包含第一和第二病毒载体，其中所述病毒载体各自包含AAV载体基因组。
18.根据权利要求17所述的HEK细胞或细胞系，其中所述AAV载体基因组包含位于所述异源核酸序列的5'和/或3'末端侧翼的一个或两个AAVITR。
19.根据权利要求4-18中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中在所述HEK细胞或细胞系中的所述异源核酸序列和/或载体和/或病毒载体和/或AAV载体基因组的拷贝数为每个细胞1-5个拷贝，每个细胞5-10个拷贝，每个细胞10-50个拷贝，每个细胞50-100个拷贝，每个细胞100-250个拷贝，每个细胞250-500个拷贝，每个细胞500-1000个拷贝，每个细胞1000-2000个拷贝，或约2000、3000、4000或5000个拷贝，或大于每个细胞2000、3000、4000或5000个拷贝，并且任选地其中拷贝数在许多传代中表现稳定，例如，在至少或大于5、10、15或更多次传代中表现稳定。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中在所述HEK细胞或细胞系中的所述AAV载体基因组的拷贝数为每个细胞至少1000个拷贝，并且来自HEK细胞或HEK细胞系的滚瓶的所述rAAV载体颗粒产率任选为至少1×108vg/ml，或至少1×109vg/ml，或至少1×1010vg/ml，或至少1×1011vg/ml或至少2×1011vg/ml。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其进一步包含AAV rep和/或cap序列。
22.根据权利要求20所述的HEK细胞或细胞系，其中所述AAV rep和/或cap序列由质粒提供，所述质粒瞬时或稳定地转染到所述HEK细胞或细胞系中。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其进一步包含AAV辅助功能序列。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述HEK细胞或细胞系是HEK 293。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其在培养物或生长培养基中，或在适于长期储存的培养基中。
26.根据权利要求9-25中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其在包含甲氨蝶呤(MTX)和/或甲硫氨酸磺胺(MSX)的培养基或生长物中。
27.根据权利要求6-26中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述HEK细胞或细胞系产生rAAV载体颗粒，所述rAAV载体颗粒已将所述异源核酸序列包装在其内。
28.根据权利要求27所述的HEK细胞或细胞系，其中所述rAAV载体颗粒以比表达功能性内源性DHFR和/或GS的HEK293细胞生产的量大的量生产并且用具有所述异源核酸序列的AAV载体基因组瞬时转染。
29.根据权利要求27所述的HEK细胞或细胞系，其中与已经包装了由表达功能性内源DHFR和/或GS的HEK293细胞生产的污染DNA并且用具有所述异源核酸序列的rAAV载体基因组瞬时转染的AAV空衣壳和/或rAAV颗粒的量比，所生产的所述AAV载体颗粒含有已经包装污染DNA的较少量的rAAV空衣壳和/或较少量的rAAV颗粒。
30.根据权利要求3-29中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述异源核酸序列编码治疗性蛋白或抑制性核酸序列。
31.根据权利要求30所述的HEK细胞或细胞系，其中所述治疗性蛋白包含凝血因子或免疫球蛋白序列。
32.根据权利要求30所述的HEK细胞或细胞系，其中所述抑制性核酸序列包含小或短发夹(sh)RNA、微小RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA。
33.根据权利要求3-32中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其用所述第一异源核酸序列稳定转染。
34.根据权利要求3-32中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其用所述第一和所述第二异源核酸序列稳定转染。
35.从权利要求15-34中任一项所述的HEK细胞或细胞系分离或纯化的病毒或rAAV载体颗粒。
36.从权利要求5-34中任一项所述的HEK细胞或细胞系分离或纯化的治疗性蛋白。
37.一种生产治疗性蛋白、病毒载体或rAAV载体颗粒的方法，其包括在允许生产和/或分泌所述治疗性蛋白、病毒载体或rAAV载体颗粒的条件下培养权利要求5-34中任一项所述的HEK细胞或细胞系，并且从所述细胞培养物、培养基或细胞培养物和培养基中分离或纯化所述治疗性蛋白、病毒载体或rAAV载体颗粒。
38.一种生产rAAV载体颗粒的方法，其包括在允许生产和/或分泌所述rAAV载体颗粒的条件下培养权利要求23-25中任一项所述的HEK细胞或细胞系，并且从所述细胞培养物、培养基或细胞培养物和培养基中分离或纯化所述rAAV载体颗粒，其中当所述HEK细胞或细胞系具有至少1000个拷贝/细胞的AAV载体基因组时，所述rAAV载体颗粒的产率为至少2×1011vg/滚瓶的HEK细胞或HEK细胞系。
39.根据权利要求3-38中任一项所述的HEK细胞或细胞系或方法，其中所述第一和/或第二异源核酸序列编码基因产物，所述基因产物选自：胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲状旁腺激素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑制素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，TGFβ，激活素，抑制素，骨形态发生蛋白(BMP)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子NT-3和NT4/5，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养因子，集聚蛋白，导蛋白-1和导蛋白-2，肝细胞生长因子(HGF)，肝配蛋白，头蛋白，音猬因子和酪氨酸羟化酶。
40.根据权利要求23-29、37或38中任一项所述的HEK细胞或细胞系或方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码基因产物的所述第一和/或所述第二异源核酸序列，所述基因产物选自：胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲状旁腺激素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑制素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，TGFβ，激活素，抑制素，骨形态发生蛋白(BMP)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子NT-3和NT4/5，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养因子，集聚蛋白，导蛋白-1和导蛋白-2，肝细胞生长因子(HGF)，肝配蛋白，头蛋白，音猬因子和酪氨酸羟化酶。
41.根据权利要求3-38中任一项所述的HEK细胞或细胞系或方法，其中所述第一和/或第二异源核酸序列编码基因产物，所述基因产物选自：血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL1至IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α，β和γ，干细胞因子，flk-2/flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I类和II类MHC分子。
42.根据权利要求23-29、37或38中任一项所述的HEK细胞或细胞系或方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码基因产物的所述第一和/或所述第二异源核酸序列，所述基因产物选自：血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL1至IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α，β和γ，干细胞因子，flk-2/flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I类和II类MHC分子。
43.根据权利要求3-38中任一项所述的HEK细胞或细胞系或方法，其中所述第一和/或第二异源核酸序列编码用于校正天然存在的错误的蛋白，所述蛋白选自：氨基甲酰基合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨酸琥珀酸酯裂解酶，精氨酸酶，富马酰乙酰水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子V，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰辅酶A脱氢酶，丙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，胰岛素，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸盐，肝磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，RPE65，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
44.根据权利要求23-29、37或38中任一项所述的HEK细胞或细胞系或方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码用于校正天然存在的错误的蛋白的所述第一和/或所述第二异源核酸序列，所述蛋白选自：氨基甲酰基合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨酸琥珀酸酯裂解酶，精氨酸酶，富马酰乙酰水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子V，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰辅酶A脱氢酶，丙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，胰岛素，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸盐，肝磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，RPE65，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
45.一种生产不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)的人胚胎肾(HEK)细胞系的方法，其包括使所述内源性DHFR基因突变或敲除所述内源性DHFR基因。
46.一种生产不表达功能性内源性谷氨酰胺合成酶(GS)的人胚胎肾(HEK)细胞系的方法，其包括使所述内源性GS基因突变或敲除所述内源性GS基因。
47.一种生产不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的人胚肾(HEK)细胞系的方法，其包括使所述内源DHFR基因和GS基因突变或敲除所述内源DHFR基因和GS基因。
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