CN109557207A - 一种定量测定als/ahas酶催化反应过程中底物的转化及产物的生成及分布的方法 - Google Patents

一种定量测定als/ahas酶催化反应过程中底物的转化及产物的生成及分布的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种定量测定ALS/AHAS酶催化反应过程中底物的转化及产物的生成及分布的方法，明确了1,2‑二氨基苯及其类似物和2,4‑二硝基苯肼(DNPH)及其类似物的组合为适宜的衍生化试剂。本发明不仅可以用于测定ALS/AHAS催化单底物反应时的活性，还可以测定它们催化双底物反应时的活性；更重要的是本发明可以用于ALS/AHAS催化反应中底物的转化及产物的生成及分布情况的全面定量分析，这是已有的UV方法及气相色谱法(GC)无法完成的。

Description

一种定量测定ALS/AHAS酶催化反应过程中底物的转化及产物 的生成及分布的方法
技术领域
本发明属于酶学研究领域，具体涉及一种定量分析乙酰乳酸合酶(Acetolactatesynthase,ALS)及乙酰羟酸合酶(Acetohydroxylic acid synthase,AHAS)催化反应过程中底物的转化及产物的生成及分布的方法。
背景技术
乙酰乳酸合酶(Acetolactate synthase,ALS)/乙酰羟酸合酶(Acetohydroxylicacid synthase,AHAS)是催化生物体内异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸这三种必需支链氨基酸生物合成的第一步反应的限速酶。由于支链氨基酸只能在细菌、真菌、藻类及高等植物体内合成，而动物及人自身无法完成这些化合物的合成，必须从食物中获取，所以常常以支链氨基酸生物合成途径中的关键酶AHAS/ALS为靶标筛选抗菌药物和除草剂。事实上目前广泛使用的除草剂磺酰脲类(Sulfonylureas)化合物及咪唑啉酮类(Imidazolinones)化合物的作用靶点就是植物中的AHAS。
目前，对于AHAS/ALS的催化机理研究已经越来越受到关注。AHAS/ALS是硫胺素焦磷酸(ThDP)依赖酶，其催化机制符合ThDP依赖酶的普遍特征。研究发现，AHAS/ALS除了可催化两分子丙酮酸反应生成乙酰乳酸或一分子丙酮酸与一分子2-丁酮酸反应生成乙酰乳酸及2-乙酰基-2-羟基丁酸外，还可催化丙酮酸与苯甲醛缩合生成L-苯基乙酰基甲醇(L-PAC)这一医药工业中合成a/β-肾上腺素的前体；不仅如此，AHAS/ALS作用底物的广谱性有望使其应用于合成其它手性药物前体。上述研究的顺利进行都要建立在有效的AHAS/ALS分析方法之上。
目前对于AHAS/ALS催化反应的分析方法的研究相对来说较少，最常用的是经典的紫外分光光度法(UV)和气相色谱法(GC)。UV法测定AHAS/ALS酶活性时，只能用于仅以丙酮酸为底物的单底物反应的测定，且当底物丙酮酸浓度小于100μM时，结果的重复性差。对于丙酮酸及丁酮酸同时存在的双底物反应，UV法则不能准确测定。为解决该问题，Gollop等人建立了一种用GC法同时测定AHAS/ALS催化的双底物反应中的产物2-乙酰乳酸(AL)和2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB)的方法，并以此研究不同种类的AHAS/ALS的底物偏好性和稳态动力学参数。然而该方法也存在一些不足：1)在气相色谱分析过程中溶剂峰会对产物2,3-丁二酮的测定产生较大干扰，影响测定结果的准确性；2)GC法需要通过“气洗”装置将产物2,3-丁二酮及2,3-戊二酮从反应容器中分离纯化出来后才能进行下一步检测，过程中需要不断通入空气，而且“气洗”的过程中也会导致产物的损失；3)对于反应中同时生成的偶姻类化合物无法同时检测。所以，这种方法测定步骤繁琐，耗时且结果准确程度欠佳。这些不足严重阻碍了对AHAS/ALS催化过程的全面分析以及其抑制剂的寻找，也在很大程度上限制了其在许多重要工业领域内的广泛应用。
1,2-二氨基苯及其类似物目前主要被用作荧光标记试剂，可用于测定α-酮酸和邻二酮类化合物，在实际的应用中这些试剂主要用于测定食品及人和动物体液中的相关化合物。Masatoshi等人将皮质类固醇激素，比如泼尼松龙和强的松等转化为乙二醛类化合物，然后通过被该类化合物，如1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)衍生后测定人体血浆中的糖皮质激素；同时，科研人员利用该类试剂标记人血浆中的乙二醛、甲基乙二醛及3-脱氧葡萄糖等化合物，通过测定人体内这些邻二酮的水平来判断人体血浆的生理水平，并将之与氧化应激过程相关联。目前，尚未见1,2-二氨基苯及其类似物在定量检测ALS/AHAS酶催化活性方面的报道。
2,4-二硝基苯肼(DNPH)目前主要应用于醛酮类化合物的定量分析，已有近百年的历史；而其类似物N-正丙胺-4-肼基萘二甲酰亚胺(NPHNA)则是近年来才出现的试剂。目前，也未见2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物在定量检测ALS/AHAS酶催化活性方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于建立全面系统分析AHAS/ALS催化反应过程的简便可靠方法，其中利用1,2-二氨基苯及其类似物和2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物分别作为衍生化试剂，以柱前衍生-HPLC法来全面定量测定AHAS/ALS催化的丙酮酸为单底物反应及以丙酮酸加丁酮酸作为双底物反应过程中底物的消耗量和产物的分布及生成量，从而使我们对AHAS/ALS催化反应的整个过程有一个更加全面的认识，也为AHAS/ALS酶催化机制的深入研究及其抑制剂的发现提供有力的保障。
本发明主要基于以下理论以及实验分析研究：
在生物体内AHAS/ALS催化的支链氨基酸合成的关键反应及其体外催化的L-苯基乙酰基甲醇(L-PAC)生成反应过程如下：
如上式所示，AHAS/ALS有两个天然底物，分别为丙酮酸和2-丁酮酸。一般认为，AHAS/ALS能够利用一分子丙酮酸为供体底物，与另一分子作为受体分子的丙酮酸作用形成乙酰乳酸(AL)，或与另一分子作为受体分子的2-丁酸酮作用形成2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB)。而以上反应的产物AL和AHB都不稳定，不仅易通过非酶氧化反应分解为丁二酮和2,3-戊二酮，也可以通过自脱羧反应生成乙偶姻和3-羟基-2-戊酮。该脱羧反应及非酶氧化反应可描述如下：
由以上讨论可见，AHAS/ALS催化的反应体系复杂，尤其是双底物的催化反应体系，而要全面系统地定量分析这一反应，就必须首先建立一个简便可靠的方法。那么，从以上分析我们可以发现，AHAS/ALS催化的反应体系中可能存在的化合物类型有底物为α-酮酸，如丙酮酸和2-丁酮酸；产物中有AL和AHB等α-羟基-β-酮酸，而这些α-羟基-β-酮酸类化合物既可通过自脱羧形成邻羟基酮(偶姻)类化合物，也可以被彻底氧化生成邻二酮化合物。1,2-二氨基苯及其类似物与α-酮酸及邻二酮化合物均可以在温和条件下反应形成喹喔啉类衍生物，而2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物可以与偶姻类化合物在温和条件下反应形成苯腙类衍生物，反应过程可描述如下：
1)1,2-二氨基苯及其类似物与α-酮酸及邻二酮化合物的反应：以1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)为例：
2)2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物与偶姻类化合物的反应：2,4-二硝基苯肼(DNPH)为例：
由此，我们就可以利用1,2-二氨基苯及其类似物为衍生化试剂来测定AHAS/ALS催化的反应中未反应的底物α-酮酸及生成的邻二酮化合物(由产物α-羟基-β-酮酸类化合物彻底氧化产生)，同时以2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物为衍生化试剂来测定AHAS/ALS催化的反应中生成的偶姻类化合物(由产物α-羟基-β-酮酸类化合物自脱羧产生)，然后综合两个测定的结果就可以全面系统地分析AHAS/ALS催化反应过程中底物的转化及产物的生成及分布，这是之前报道的UV法和GC法无法完成的。
本发明给出的技术方案具体如下：
1,2-二氨基苯及其类似物和2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物的组合，作为衍生化试剂以柱前衍生-HPLC法定量检测乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应底物的转化和产物的生成及分布特征的用途。
其中，1,2-二氨基苯及其类似物可包括1,2-二氨基苯(OPDA)，1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)，1,2-二氨基-4,5-乙二氧基苯(DEB)，4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)，4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)，4-甲氧基-1,2-二氨基苯(MPDA)，4,5-二氯-1,2-二氨基苯(DCPDA)，4,5-二甲氧基-1,2-二氨基苯(DMPDA)，它们的结构如下：
其中，2,4-二硝基苯肼及其类似物可包括2,4-二硝基苯肼(DNPH)，N-正丙胺-4-肼基萘二甲酰亚胺(NPHNA)，它们的结构如下：
需要说明的是，相应的权利要求保护方案应当理解为1,2-二氨基苯及其类似物中的任意选择与2,4-二硝基苯肼及其类似物中的任意选择的两者组合具有这种用途，而不应将“及其”理解为“组合”。
进一步的，所述1,2-二氨基苯及其类似物以1.0-3.0M盐酸配制为5.0-10.0mM储备液；2,4-二硝基苯肼及其类似物以甲醇配制为5.0-10.0mM储备液。
进一步的，乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰羟酸合酶(AHAS)均从微生物获得；这两种酶催化反应类似，均包括两种反应类型：
1)单底物反应：丙酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及ALS或AHAS酶加入到缓冲液中，进行孵育；
2)双底物反应：丙酮酸、丁酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及ALS或AHAS酶加入到缓冲液中，进行孵育。
在单底物反应中，以反应体系总体积200-400μL计，则底物丙酮酸的浓度为5.0-10.0mM；二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+，浓度为2.0-10.0mM；ThPP浓度为0.5-2.0mM，ALS或AHAS用量为0.1-0.5mg/ml；所用缓冲液为40-200mM的Tris-HCl或磷酸盐或柠檬酸或MOPS(pH 6.0-8.5)缓冲液；孵育温度为30-80℃，孵育时间为0.5-2h；
在双底物反应中，反应体系与单底物反应的反应体系相同，底物丙酮酸及底物丁酮酸的浓度分别为1.0-5.0mM。
一种对乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应底物的转化率的检测方法，包括以下步骤：
1)催化反应中未转化的底物的衍生化：
酶催化反应完成后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟，取上清50-100μL加入到50-200μL的1,2-二氨基苯或其类似物的储备液中，40-80℃孵育0.2-2h；
2)衍生物的HPLC测定：
HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200 HPLC仪或Waters 1525 HPLC仪，色谱柱为4.6×250mm C-18反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为10-50μL；流速为0.5-2.0mL/min；检测波长为240-400nm；柱温为20-40℃；流动相为甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为10-30min；
HPLC梯度洗脱条件为：甲醇/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B；乙腈/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min,80％流动相B；23min,40％流动相B；四氢呋喃/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：四氢呋喃；梯度为0min，35％流动相B；15min，60％流动相B；18min，35％流动相B；20min，35％流动相B。
一种对乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应产物的生成及分布特征的检测方法，包括以下两方面：
1)反应中生成的乙酰乳酸(AL，单底物反应)或AL及2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB，双底物反应)的衍生化及HPLC测定：
酶催化反应完成后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟，取上清50-100μL，加入2M H3PO4 1-5μL，再加入FeCl2及FeCl3的混合液(各10mM)至它们的终浓度均为0.5mM，1M NaOH将反应体系pH调至4，补充水至150-300μL，密封反应体系之后，于80℃反应15min，之后冷却至室温；取冷却后反应液50-100μL与100-200μL的1,2-二氨基苯或其类似物的储备液混合，40-80℃孵育0.2-2h；衍生化完成后产物以HPLC方法进行分析，分析过程与前述步骤2)相同；
2)反应中生成的乙偶姻(3-羟基-2-丁酮，单底物反应)或乙偶姻及3-羟基-2-戊酮(HPO，双底物反应)的衍生化及HPLC测定：
酶催化反应完成后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟，取上清25-50μL，加入2,4-二硝基苯肼或其类似物的储备液50-100μL，1-3M高氯酸10-30μL，蒸馏水补充至200-250μL，混匀后室温放置1小时，10000rpm下离心5分钟；取上清进行HPLC分析，分析过程与前述步骤2)相同。
本发明具有以下优点：
本发明首次将1,2-二氨基苯及其类似物和2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物分别作为衍生化试剂，利用柱前衍生-HPLC法系统定量分析AHAS/ALS催化的反应过程中底物(α-酮酸，包括丙酮酸及丁酮酸)的转化及产物(邻羟基酮(偶姻)类化合物及可被转化为邻二酮类化合物的α-羟基-β-酮酸类化合物)的生成及分布。与已报道的测定ALS/AHAS活性的紫外检测方法(UV)只能用于单底物(丙酮酸)反应的测定相比较，本发明不仅可以用于测定ALS/AHAS催化单底物反应时的活性，还可以测定它们催化双底物(丙酮酸+2-丁酮酸)反应时的活性；更重要的是本方法可以用于ALS/AHAS催化反应中底物的转化及产物的生成及分布情况的全面定量分析，这是已有的UV方法及气相色谱法(GC)无法完成的。
本发明还涉及对两种衍生化试剂分别衍生α-酮酸和邻二酮及偶姻类化合物的反应条件的优化及所形成的衍生物的最佳HPLC测定条件的建立，并利用新建的方法对AHAS/ALS催化的单底物反应和双底物反应的细节，诸如反应底物的转化率、反应产物的组成及各自的产率等进行了全面的评价。这些结果对深入、全面、系统地揭示AHAS/ALS酶的催化性能及其过程都有很大的意义，本发明中建立的柱前衍生-HPLC方法也为后续深入研究AHAS/ALS催化反应的细节提供了坚实的基础。
附图说明
图1为对乙酰乳酸合酶ALS催化的单底物反应的全面定量分析结果。
图2为对乙酰乳酸合酶ALS催化的双底物反应的全面定量分析结果。
图3为对乙酰羟酸合酶AHAS催化的单底物反应的全面定量分析结果。
图4为对乙酰羟酸合酶AHAS催化的双底物反应的全面定量分析结果。
具体实施方式
实施例一
一、1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)及2,4-二硝基苯肼(DNPH)为衍生化试剂HPLC法检测乙酰乳酸合酶(ALS)催化的单底物反应：
1、酶反应的反应体系：50mM K3PO4(pH 7.0),10mM MgCl2,1mM ThDP，10mM丙酮酸钠，40μg ALS酶(从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中获得)，总体系300μL。37℃水浴1h后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟得到酶催化反应化合物的上清。
2、反应中未转化的底物丙酮酸的测定：
1)衍生化：取前述步骤1中得到的上清50μL加入到100μL的DMB的储备液中，80℃孵育1h；
2)衍生物的HPLC测定：HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200 HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为254nm；进样量为20μL；流速为0.75mL/min；柱温为25℃；流动相为甲醇/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为25min。
3)甲醇/水为流动相时HPLC梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B。
3、反应中生成的乙酰乳酸(AL)的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入2M H3PO4 2μL，再加入FeCl2及FeCl3的混合液(各10mM)至它们的终浓度均为0.5mM，1M NaOH将反应体系pH调至4，补充水至200μL。反应体系密封后于80℃反应15min，之后冷却至室温(此步操作的目的是将反应生成的AL氧化为丁二酮)；取冷却后反应液50μL与100μL的DMB的储备液混合，80℃孵育1h；衍生化完成后产物以HPLC方法进行分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
4、反应中生成的乙偶姻的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入DNPH的储备液100μL，2M高氯酸20μL，蒸馏水补充至200μL，混匀后室温放置1小时，10000rpm下离心5分钟，取上清进行HPLC分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
5、测定结果：
图1中列举的是柱前衍生-HPLC法测定ALS催化单底物反应的结果。从图中可以看出，柱前衍生-HPLC法测定ALS底物丙酮酸的转化率为98.5％，而产物乙酰乳酸的产率为63.9％，乙偶姻的产率为33.3％，故反应的总产率为97.2％。由此可见，用本发明中建立的柱前衍生-HPLC法测定ALS催化的单底物反应时，底物的转化率及产物的产率可以完美吻合。
二、1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)及2,4-二硝基苯肼(DNPH)为衍生化试剂HPLC法检测乙酰乳酸合酶(ALS)催化的双底物反应：
1、酶反应的反应体系：50mM K3PO4(pH 7.0),10mM MgCl2,1mM ThDP，5mM丙酮酸钠，5mM丁酮酸，40μg ALS酶(从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中获得)，总体系300μL。37℃水浴1h后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟得到酶催化反应化合物的上清。
2、反应中未转化的底物丙酮酸及丁酮酸的测定：
1)衍生化：取前述步骤1中得到的上清50μL加入到100μL的DMB的储备液中，80℃孵育1h；
2)衍生物的HPLC测定：HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200 HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为254nm；进样量为20μL；流速为0.75mL/min；柱温为25℃；流动相为甲醇/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为25min。
3)甲醇/水为流动相时HPLC梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B。
3、反应中生成的乙酰乳酸(AL)及2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB)的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入2M H3PO4 2μL，再加入FeCl2及FeCl3的混合液(各10mM)至它们的终浓度均为0.5mM，1M NaOH将反应体系pH调至4.0，补充水至200μL。反应体系密封后于80℃反应15min，之后冷却至室温(此步操作的目的是将反应生成的AL及AHB分别氧化为丁二酮及2,3-戊二酮)；取冷却后反应液50μL与100μL的DMB的储备液混合，80℃孵育1h；衍生化完成后产物以HPLC方法进行分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
4、反应中生成的乙偶姻及3-羟基-2-戊酮(HPO)的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入DNPH的储备液100μL，2M高氯酸20μL，蒸馏水补充至200μL，混匀后室温放置1小时，10000rpm下离心5分钟，取上清进行HPLC分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
5、测定结果：
图2中列举的是柱前衍生-HPLC法测定ALS催化双底物反应的结果。从图中可以看出，HPLC法测定ALS底物丙酮酸与丁酮酸的转化率分别为95.9％及45.2％，而产物中以丙酮酸为底物的生成物(乙偶姻+AL)的产率为50.8％，以丙酮酸及丁酮酸为底物的生成物(3-羟基-2-戊酮(HPO)及2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB))的产率为46.6％，由此可见，用本发明中建立的柱前衍生-HPLC法测定ALS催化的双底物反应时，底物的转化率及产物的产率可以完美吻合。
在该实施例中，我们仅仅用DMB及DNPH的组合为衍生化试剂，以柱前衍生-HPLC法对乙酰乳酸合酶ALS催化的反应进行了全面的定量分析，得到了令人满意的结果。由于化合物DMB及其类似物OPDA、DEB、CPDA、NPDA、MPDA、DCPDA及DMPDA的结构中均含有1,2-二氨基苯结构片段且它们与α-酮酸类化合物及邻二酮化合物均具有类似的反应活性，而化合物DNPH及其类似物NPHNA的结构中均含有苯肼结构片段且它们与偶姻类化合物均具有类似的反应活性，因此参考DMB及DNPH组合的应用结果可以预期，1,2-二氨基苯及其类似物中的任意一种与2,4-二硝基苯肼及其类似物中的任意一种的组合用于全面定量分析ALS酶催化的反应时均可以取得令人满意的结果。
实施例二
一、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)及N-正丙胺-4-肼基萘二甲酰亚胺(NPHNA)为衍生化试剂柱前衍生-HPLC法检测乙酰羟酸合酶(AHAS)催化的单底物反应：
1、酶反应的反应体系：50mM K3PO4(pH 7.0),10mM MgCl2,1mM ThDP，10mM丙酮酸钠，40μg AHAS酶(从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中获得)，总体系300μL。80℃水浴1h后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟得到酶催化反应化合物的上清。
2、反应中未转化的底物丙酮酸的测定：
1)衍生化：取1中得到的上清50μL加入到100μL的NPDA的储备液中，40℃孵育40min；
2)衍生物的HPLC测定：HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200 HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为265nm；进样量为20μL；流速为0.75mL/min；柱温为25℃；流动相为甲醇/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为25min。
3)甲醇/水为流动相时HPLC梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B。
3、反应中生成的乙酰乳酸(AL)的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入2M H3PO4 2μL，再加入FeCl2及FeCl3的混合液(各10mM)至它们的终浓度均为0.5mM，1M NaOH将反应体系pH调至4，补充水至200μL。反应体系密封后于80℃反应15min，之后冷却至室温(此步操作的目的是将反应生成的AL氧化为丁二酮)；取冷却后反应液50μL与100μL的NPDA的储备液混合，40℃孵育40min；衍生化完成后产物以HPLC方法进行分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
4、反应中生成的乙偶姻的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入NPHNA的储备液100μL，2M高氯酸20μL，蒸馏水补充至200μL，混匀后室温放置1小时，10000rpm下离心5分钟，取上清进行HPLC分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
5、测定结果：
图3中列举的是柱前衍生-HPLC法测定AHAS催化单底物反应的结果。从图中可以看出，柱前衍生-HPLC法测定AHAS底物丙酮酸的转化率为93.8％，而产物乙酰乳酸的产率为5.4％，乙偶姻的产率为89.8％，故反应的总产率为94.2％。由此可见，用本发明中建立的柱前衍生-HPLC法测定AHAS催化的单底物反应时，底物的转化率及产物的产率可以完美吻合。
二、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)及N-正丙胺-4-肼基萘二甲酰亚胺(NPHNA)为衍生化试剂柱前衍生-HPLC法检测乙酰羟酸合酶(AHAS)催化的双底物反应：
1、酶反应的反应体系：50mM K3PO4(pH 7.0),10mM MgCl2,1mM ThDP，5mM丙酮酸钠，5mM丁酮酸，40μg AHAS酶(从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中获得)，总体系300μL。80℃水浴1h后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟得到酶催化反应化合物的上清。
2、反应中未转化的底物丙酮酸及丁酮酸的测定：
1)衍生化：取1中得到的上清50μL加入到100μL的NPDA的储备液中，40℃孵育40min；
2)衍生物的HPLC测定：HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200 HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器，检测波长为265nm；进样量为20μL；流速为0.75mL/min；柱温为25℃；流动相为甲醇/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为25min。
3)甲醇/水为流动相时HPLC梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B。
3、反应中生成的乙酰乳酸(AL)及2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB)的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入2M H3PO4 2μL，再加入FeCl2及FeCl3的混合液(各10mM)至它们的终浓度均为0.5mM，1M NaOH将反应体系pH调至4，补充水至200μL。反应体系密封后于80℃反应15min，之后冷却至室温(此步操作的目的是将反应生成的AL及AHB分别氧化为丁二酮及2,3-戊二酮)；取冷却后反应液50μL与100μL的NPDA的储备液混合，40℃孵育40min；衍生化完成后产物以HPLC方法进行分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
4、反应中生成的乙偶姻及3-羟基-2-戊酮(HPO)的测定：
取前述步骤1中得到的上清50μL，加入NPHNA的储备液100μL，2M高氯酸20μL，蒸馏水补充至200μL，混匀后室温放置1小时，10000rpm下离心5分钟，取上清进行HPLC分析，分析过程与前述步骤2中2)、3)步相同。
5、测定结果：
图4中列举的是柱前衍生-HPLC法测定AHAS催化双底物反应的结果。从图中可以看出，HPLC法测定AHAS底物丙酮酸与丁酮酸的转化率分别为95.9％及96.6％，而产物中以丙酮酸为底物的生成物(乙偶姻+AL)的产率为3.6％，以丙酮酸及丁酮酸为底物的生成物(3-羟基-2-戊酮(HPO)及2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB))的产率为93.1％，由此可见，用本发明中建立的柱前衍生-HPLC法测定ALS催化的双底物反应时，底物的转化率及产物的产率可以完美吻合。
在该实施例中，我们仅仅用NPDA及NPHNA的组合为衍生化试剂，以柱前衍生-HPLC法对乙酰乳酸合酶AHAS催化的反应进行了全面的定量分析，得到了令人满意的结果。由于化合物NPDA及其类似物OPDA、DEB、CPDA、DMB、MPDA、DCPDA及DMPDA的结构中均含有1,2-二氨基苯结构片段且它们与α-酮酸类化合物及邻二酮化合物均具有类似的反应活性，而化合物NPHNA及其类似物DNPH的结构中均含有苯肼结构片段且它们与偶姻类化合物均具有类似的反应活性，因此参考NPDA及NPHNA组合的应用结果可以预期，1,2-二氨基苯及其类似物中的任意一种与2,4-二硝基苯肼及其类似物中的任意一种的组合用于全面定量分析AHAS酶催化的反应时均可以取得令人满意的结果。
以上两个实施例中分别针对乙酰乳酸合酶AHAS及乙酰羟酸合酶ALS进行了讨论，由于这两个酶所能催化的反应具有非常大的相似性，因此完全可以预期，若针对其中一个酶的实施例能够获得令人满意的效果，则更换为针对另一个酶时，同样实验条件下必然也能得到令人满意的效果。

Claims (8)

1.1,2-二氨基苯及其类似物和2,4-二硝基苯肼(DNPH)及其类似物的组合，作为衍生化试剂以柱前衍生-HPLC法定量检测乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应底物的转化和产物的生成及分布特征的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：1,2-二氨基苯及其类似物包括1,2-二氨基苯(OPDA)，1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)，1,2-二氨基-4,5-乙二氧基苯(DEB)，4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)，4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)，4-甲氧基-1,2-二氨基苯(MPDA)，4,5-二氯-1,2-二氨基苯(DCPDA)，4,5-二甲氧基-1,2-二氨基苯(DMPDA)，它们的结构如下：
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：2,4-二硝基苯肼及其类似物包括2,4-二硝基苯肼(DNPH)，N-正丙胺-4-肼基萘二甲酰亚胺(NPHNA)，它们的结构如下：
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述1,2-二氨基苯及其类似物以1.0-3.0M盐酸配制为5.0-10.0mM储备液；2,4-二硝基苯肼及其类似物以甲醇配制为5.0-10.0mM储备液。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰羟酸合酶(AHAS)均从微生物获得；这两种酶催化反应类似，均包括两种反应类型：
1)单底物反应：丙酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及ALS或AHAS酶加入到缓冲液中，进行孵育；
2)双底物反应：丙酮酸、丁酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及ALS或AHAS酶加入到缓冲液中，进行孵育。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：
在单底物反应中，以反应体系总体积200-400μL计，则底物丙酮酸的浓度为5.0-10.0mM；二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+，浓度为2.0-10.0mM；ThPP浓度为0.5-2.0mM，ALS或AHAS用量为0.1-0.5mg/ml；所用缓冲液为40-200mM的Tris-HCl或磷酸盐或柠檬酸或MOPS缓冲液，pH 6.0-8.5；孵育温度为30-80℃，孵育时间为0.5-2h；
在双底物反应中，反应体系与单底物反应的反应体系相同，底物丙酮酸及底物丁酮酸的浓度分别为1.0-5.0mM。
7.一种对乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应底物的转化率的检测方法，包括以下步骤：
1)催化反应中未转化的底物的衍生化：
酶催化反应完成后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟，取上清50-100μL加入到50-200μL的1,2-二氨基苯或其类似物的储备液中，40-80℃孵育0.2-2h；
2)衍生物的HPLC测定：
HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200HPLC仪或Waters 1525HPLC仪，色谱柱为4.6×250mm C-18反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为10-50μL；流速为0.5-2.0mL/min；检测波长为240-400nm；柱温为20-40℃；流动相为甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为10-30min；
甲醇/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B；
乙腈/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min,80％流动相B；23min,40％流动相B；
四氢呋喃/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：四氢呋喃；梯度为0min，35％流动相B；15min，60％流动相B；18min，35％流动相B；20min，35％流动相B。
8.一种对乙酰乳酸合酶(ALS)/乙酰羟酸合酶(AHAS)催化反应产物的生成及分布特征的检测方法，包括以下两方面：
1)单底物反应生成的乙酰乳酸(AL)或双底物反应生成的乙酰乳酸(AL)及2-乙酰基-2-羟基丁酸(AHB)的衍生化及HPLC测定：
酶催化反应完成后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟，取上清50-100μL，加入2M H3PO41-5μL，再加入FeCl2及FeCl3的混合液(各10mM)至它们的终浓度均为0.5mM，1M NaOH将反应体系pH调至4，补充水至150-300μL，密封反应体系之后，于80℃反应15min，之后冷却至室温；取冷却后反应液50-100μL与100-200μL的1,2-二氨基苯或其类似物的储备液混合，40-80℃孵育0.2-2h；衍生化完成后产物以HPLC方法进行分析，分析过程与权利要求7中步骤2)相同；
2)单底物反应中生成的乙偶姻或双底物反应中生成的乙偶姻及3-羟基-2-戊酮的衍生化及HPLC测定：
酶催化反应完成后，反应混合物沸水中加热3分钟终止反应，10000rpm下离心5分钟，取上清25-50μL，加入2,4-二硝基苯肼或其类似物的储备液50-100μL，1-3M高氯酸10-30μL，蒸馏水补充至200-250μL，混匀后室温放置1小时，10000rpm下离心5分钟；取上清进行HPLC分析，分析过程与权利要求7中步骤2)相同。
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