CN109536419A - 一株促进零价铁降解土壤多氯联苯的非脱羧勒克氏菌及其应用 - Google Patents

一株促进零价铁降解土壤多氯联苯的非脱羧勒克氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌及其应用。该菌株名称为Leclercia adecarboxylata LA surf，于2018年3月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60341。该菌株可在缺氧/厌氧条件下生长，具有较好的铁及多氯联苯抗性，并产生表面活性物质，具有降低体系表面张力的能力，且其生长能力对零价铁含量变化不敏感，从而改变多氯联苯在土壤‑溶液‑零价铁表面的分配，提高土壤中多氯联苯与零价铁的接触效率。本发明方法简便易行、成本低廉、无二次污染，适用于大量污染土壤或底泥的修复；在多氯联苯污染土壤的化学‑生物联合修复中具有很好的应用前景。

Description

一株促进零价铁降解土壤多氯联苯的非脱羧勒克氏菌及其 应用
技术领域
本发明涉及土壤环境有机污染物化学和生物处理技术领域，具体涉及一株促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌及其在污染土壤修复中的应用。
背景技术
多氯联苯(PCBs)是一类憎水性有机污染物，低水溶性是造成这类化合物持久性的主要原因。由于这类化合物具有高毒性、难降解性、持久性以及生物累积和放大效应等特点而备受关注。有报道称，近三十年来全球PCBs的人体暴露量呈现持续下降的趋势，环境介质和食物网中PCBs的含量亦大幅降低(Ross G.,The public health implications ofpolychlorinated biphenyls(PCBs)in the environment.Ecotoxicology andEnvironmental Safety,2004.59(3):p.275-291)。但电子电器产品不当拆解等活动导致局部地区存在严重的PCBs污染问题，造成了一些区域亟待解决的环境风险(Wong M.H.,WuS.C.,Deng W.J.,Yu X.Z.,Luo Q.,Leung A.O.W.,Wong C.S.C.,Luksemburg W.J.,andWong A.S.,Export of toxic chemicals–A review of the case of uncontrolledelectronic-waste recycling.Environmental Pollution,2007.149(2):p.131-140)。
目前PCBs污染土壤修复技术主要分为物理、化学和生物修复技术等。物理法主要是通过填埋、换土、客土等工程方法转移污染物，不能从根本上解决在环境中的污染问题；生物修复技术主要是利用细菌、真菌等微生物降解、矿化PCBs，但生物法修复污染土壤的关键问题是修复效率低。
化学修复法中，零价铁作为一种高效易得的修复材料具有极强的还原性，在厌氧或低氧条件下可作为电子供体还原降解多氯联苯、多溴联苯醚、简单氯代烃等卤代有机物，在地下水和土壤修复中已得到大规模应用。然而该修复方法存在一些制约因素，尤其对于疏水性有机污染物(如多氯联苯等)，污染物和零价铁接触不充分等因素使其应用受到较大限制。目前已有技术通过表面活性剂提高污染物的流动性，但在使用过程中，表面活性剂回收困难，不利于修复成本控制，且可能造成土壤二次污染。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌。该菌株可在缺氧/厌氧条件下生长，具有较好的铁及多氯联苯抗性，并产生表面活性物质，从而改变多氯联苯在土壤-溶液-零价铁表面的分配，提高土壤中多氯联苯与零价铁的接触效率。
本发明的另一目的是提供上述非脱羧勒克氏菌在污染土壤修复中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌，命名为非脱羧勒克氏菌(Leclercia adecarboxylata)LA surf，是从清远市某电子废弃物拆解污染地土壤(0～50cm)，经人工富集、筛分及纯化所得到。
所述的Leclercia adecarboxylata LA surf的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2018年3月14日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60341。
所述的LAsurf菌株具有以下分类学特征：在无机盐平板培养基的生长形态为：菌落表面为乳白色，逐渐变为淡黄色，老后变为黄色；菌落呈圆形，表面光滑湿润，边缘平滑；革兰氏染色阴性，兼性厌氧环境中生长。
本发明还提供一种促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌在污染土壤修复中的应用。
优选的，所述的促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌在促进零价铁降解土壤多氯联苯中的应用。
所述的多氯联苯优选为三氯联苯和四氯联苯中的至少一种。
所述的三氯联苯包括但不限于PCB-28、PCB-18、PCB-20、PCB-31和PCB-37中的至少一种；
其中，PCB-28为2,4,4′-三氯联苯，PCB-18为2,2′,5-三氯联苯，PCB-20为2,3,3′-三氯联苯，PCB-31为2,4,5-三氯联苯，PCB-37为3,4,4′-三氯联苯；
所述的四氯联苯包括但不限于PCB-52、PCB-77和PCB-47中的至少一种。
其中，PCB-52为2,2',5,5'-四氯联苯，PCB-77为3,3′,4,4′-四氯联苯，PCB-47为2,2′,4,4′-四氯联苯。
所述的非脱羧勒克氏菌的添加量为至少106个细胞/g土(干重)，优选为108个细胞/g土(干重)。
所述的零价铁的添加量为0.05～0.2g/g土(干重)，优选为0.1g/g土(干重)。
一种降解多氯联苯的土壤修复剂，包含上述非脱羧勒克氏菌和零价铁。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的非脱羧勒克氏菌可在7d内将零价铁降解PCBs的效率从44.29％～45.58％提高至54.88％～57.99％。该菌对PCBs具有较好的耐性，在PCB-28浓度小于或等于20mg/L的培养体系中仍能正常的生长，并具有降低体系表面张力的能力，且其生长能力对零价铁含量变化不敏感。与只有零价铁的处理相比，添加该菌株可显著提高零价铁对多氯联苯的降解效率；与其他改良的零价铁技术相比，本方法简便易行、成本低廉、无二次污染，适用于大量污染土壤或底泥的修复。该菌在多氯联苯污染土壤的化学-生物联合修复中具有很好的应用前景。
附图说明
图1是Leclercia adecarboxylata LA surf对零价铁降解土壤PCBs的影响。
图2是Leclercia adecarboxylata LA surf在不同含量PCB-28的无机盐液体培养基中的生长曲线。
图3是不同含量零价铁对Leclercia adecarboxylata LAsurf在100mL无机盐液体培养基培养12小时后生长的影响。
图4是Leclercia adecarboxylata LA surf对液体表面张力的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中所用的PCB-65为2,3,5,6-四氯联苯；PCB-82为2,2′,3,3′,4-五氯联苯。
实施例1：Leclercia adecarboxylata LA surf的筛选分离及其性能
采集清远市某电子废弃物拆解污染地土壤(0～50cm)。取PCB-28标准液0.5mL于干燥的灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完全，量取90mL无机盐液体培养基于三角瓶中，再量取土壤悬液10mL于三角瓶中，使PCB-28浓度为2mg/L，于30℃，180rpm培养箱中避光培养3～5d。依次提高PCB-28浓度为5mg/L、10mg/L、20mg/L，转接液为10mL，培养周期为5d。无机盐液体培养基由磷酸盐浓缩液(PA)、矿物盐(PAS)培养基和0.005％的酵母膏提取物配制而成，pH调节为7.0。磷酸盐浓缩液(PA)培养基(g/L)：K2HPO4 56.77，KH2PO4 21.94，NH4Cl 27.61，NaCl 38.71；100倍浓缩矿物盐(100*PAS)培养基(g/L)：MgSO419.5，MnSO4·H2O 5.0，FeSO4·7H2O 1.0，CaCl2·2H2O 0.3，并滴加几滴浓硫酸防止沉淀。
经反复驯化并分离纯化得到一株PCBs耐性细菌，菌落表面为乳白色，逐渐变为淡黄色，老后变为黄色；菌落呈圆形，表面光滑湿润，边缘平滑；革兰氏染色阴性，兼性厌氧环境中生长。结合以上分类学形态特征，及该菌的16S rDNA序列与GenBank中的已知序列进行同源性比对，经鉴定该菌为非脱羧勒克氏菌(Leclercia adecarboxylata)。
综上所述，本发明分离纯化得到的菌株命名为非脱羧勒克氏菌(Leclerciaadecarboxylata)LA surf，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2018年3月14日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60341。
所述的非脱羧勒克氏菌(Leclercia adecarboxylata)LA surf的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
将纯化后的LA surf菌种接种到含有20mg/L PCB-28的无机盐液体培养基中，于30℃，180rpm培养箱中避光培养24h，4000r/min离心20min，弃上清液加入磷酸盐缓冲液振荡均匀后再次离心，重复2～3次，将细胞浓度调整到109个/mL，即LA surf菌悬液，备用。
将LA surf菌种接种到含有不同含量(0mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L)PCB-28的无机盐液体培养基中，于30℃，180rpm培养箱中避光培养28h，每4h测定一次OD600值，结果如图2所示，PCB-28对菌株的生长有一定的影响，但对稳定期菌株数量影响不显著，表明LA surf对PCB-28具有较强的耐性。
该菌的生长对体系中零价铁的含量不敏感。如图3，LA surf在含有不同含量(0、0.05、0.25、0.50、0.75、1.00g)零价铁的100mL无机盐液体培养基中培养12h；其中在无零价铁的溶液中生长最佳，但在含0.05～1.0g零价铁的培养基中，其生长没有显著性差异。
随着该菌生长过程，可降低溶液表面张力，实验结果见图4。当菌液在无机盐液体培养基开始培养时(30℃，180rpm培养箱中避光培养)，溶液表面张力变化不大；随着细菌生长，表面张力不断降低。培养12h后，表面张力从70.5mN/m下降至57.3mN/m。
表面张力检测方法：分别移取不同生长期的菌液至50mL容量瓶中，测定其OD600值，并使用DT-102(A)型全自动界面张力仪(淄博华坤电子仪器有限公司)进行菌液表面张力的测定。该仪器利用铂金环法测定液体表面活性张力，其方法为：用直径0.37mm的铂金丝做成周长为60mm的环。测试时先将铂金环浸入液面下2～3mm，然后再慢慢将铂金环向上提，环与液面会形成一个膜。膜对铂金环会有一个向下拉的力，测量整个铂金环上提过程中膜对环的所作用的最大力值，再换算成真正的表面(界面)张力值。
本实施例说明分离所得到的非脱羧勒克氏菌(Leclercia adecarboxylata)LAsurf对PCBs具有较好的耐性，在PCB-28浓度小于或等于20mg/L的培养体系中仍能正常的生长，并具有降低体系表面张力的能力，且其生长能力对零价铁含量变化不敏感。
实施例2：Leclercia adecarboxylata LAsurf对零价铁降解PCBs的影响
将5.0g污染土S1或S2置于聚四氟乙烯瓶中，在厌氧箱中，添加下述溶液或药剂：
处理 添加溶剂或药剂
添加微生物 9.5mL高纯水+0.5mL LA surf菌悬液
添加零价铁 10mL高纯水+0.5g零价铁
添加微生物和零价铁 9.5mL高纯水+0.5mL LA surf菌悬液+0.5g零价铁
其中S1和S2均为人工染毒土壤，S1含有5.23mg/kg PCB-28，S2含有3.30mg/kgPCB-52。
不调节体系pH，拧紧聚四氟乙烯旋塞后充分混合；随后将样品置于室温(30±1℃)条件下以160rpm震荡7天；在设定的时间点取出悬浊液，过0.45μm玻璃纤维滤膜使固液二相分离以终止浸提反应，测定瓶中多氯联苯的总量。每个处理3个平行。
实施例中对多氯联苯的测定通过气相色谱－质谱联用仪(GC-MS，Thermo-UltraTrace GC-DSQ)完成。色谱柱采用DB-5ms(J&W Scientific Inc.)，规格为30m×0.32mm×0.25μm。色谱升温程序设置：不分流进样，初始温度100℃，保持2min；15℃/min升温至180℃；3℃/min升温至240℃；10℃/min升温至285℃，保持10min。载气为高纯氦气(纯度>99.999％)、进样口温度300℃、传输线温度280℃、离子源温度220℃。为保证提取质量，样品前处理过程中添加PCB-65作为回收率指示物。GC-MS检测前，添加PCB-82作为内标。方法的回收率为65.5～82.6％。
经过7天反应后，实施例中多氯联苯处理前后的含量变化如图1所示。添加Leclercia adecarboxylata LA surf的处理分别只有9.06％和12.73％的PCB-28和PCB-52去除率；添加零价铁的处理分别有45.58％和44.29％的PCB-28和PCB-52去除率；同时添加Leclercia adecarboxylata LAsurf和零价铁的处理分别有54.88％和57.99％的PCB-28和PCB-52去除率。由此可见，零价铁具有较好的多氯联苯降解去除能力，Leclerciaadecarboxylata LAsurf本身对多氯联苯的降解去除能力较差；但二者联用可显著提高多氯联苯的降解率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 环境保护部华南环境科学研究所
<120> 一株促进零价铁降解土壤多氯联苯的非脱羧勒克氏菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1373
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Leclercia adecarboxylata LA surf的16S rDNA序列
<400> 1
gtagcacaga gagcttgctc tcgggtgacg agtggcggac gggtgagtaa tgtctgggaa 60
actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat aacgtcgcaa 120
gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcagatg tgcccagatg ggattagcta 180
gtaggtgggg taatggctca cctaggcgac gatccctagc tggtctgaga ggatgaccag 240
ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 300
acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtatg aagaaggcct tcgggttgta 360
aagtactttc agcggggagg aaggtgttgt ggttaataac cgcagcaatt gacgttaccc 420
gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag ggtgcaagcg 480
ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtc tgtcaagtcg gatgtgaaat 540
ccccgggctc aacctgggaa ctgcattcga aactggcagg ctagagtctt gtagaggggg 600
gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc ggtggcgaag 660
gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 720
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgacttgg aggttgttcc cttgaggagt 780
ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac 840
tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac 900
gcgaagaacc ttacctactc ttgacatcca gagaacttag cagagatgct ttggtgcctt 960
cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt 1020
taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggttaggc cgggaactca 1080
aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc 1140
ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg acctcgcgag 1200
agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1260
gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca gaatgctacg gtgaatacgt tcccgggcct 1320
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt agc 1373

Claims (8)

1.一株促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌，其特征在于：所述非脱羧勒克氏菌为Leclercia adecarboxylata LAsurf，于2018年3月14日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60341。
2.权利要求1所述的促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌在污染土壤修复中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的促进零价铁降解多氯联苯的非脱羧勒克氏菌在促进零价铁降解土壤多氯联苯中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述的多氯联苯为三氯联苯和四氯联苯中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述的三氯联苯包括PCB-28、PCB-18、PCB-20、PCB-31和PCB-37中的至少一种；
所述的四氯联苯包括PCB-52、PCB-77和PCB-47中的至少一种。
6.根据权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于：
所述的非脱羧勒克氏菌的添加量为至少106个细胞/g干重土；
所述的零价铁的添加量为0.05～0.2g/g干重土。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述的非脱羧勒克氏菌的添加量为108个细胞/g干重土；
所述的零价铁的添加量为0.1g/g干重土。
8.一种降解多氯联苯的土壤修复剂，其特征在于：包含权利要求1所述的非脱羧勒克氏菌和零价铁。
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CN114887273A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 浙江大学 纳米零价铁促进假单胞菌jd37降解多氯联苯的方法及其应用

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