CN109517803A - 一种适用于卤虫无节幼体的噬菌体强化方法 - Google Patents

一种适用于卤虫无节幼体的噬菌体强化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于卤虫无节幼体的噬菌体强化方法，包括以下步骤噬菌体裂解液的制备，吸附时间以及噬菌体滴度对噬菌体强化的影响，强化后的卤虫无节幼体能够减少水产致病菌在水产品肠道中的定植，并且这些噬菌体也能够在鱼类肠道中保持稳定，从而避免或减少抗菌素在水产养殖中的使用，促进水产养殖业的健康发展。

Description

一种适用于卤虫无节幼体的噬菌体强化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，设计一种适用于卤虫无节幼体的噬菌体强化方法。
背景技术
我国是水产养殖大国，养殖产量约占全世界总产量的2/3。细菌性疾病是水产养殖业面临的重大问题，养殖的水产品时刻面临着微生物感染的威胁。在水产养殖业，每年因病害损失的水产品占总产量的30％，直接经济损失超过百亿元，其中细菌性鱼类疾病的发病率和致死率都接近50％。
重要的水产病原菌包括弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、黄杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、爱德华菌属、耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属等。
虽然抗菌素在治疗和预防细菌性感染上具有快速且有效的特性，但是抗菌素在水产养殖业的过度使用已经造成了多重耐药性细菌的出现。抗菌素的长期滥用，造成了约90％的细菌对1种以上抗菌素具有耐药性，20％的细菌对5种以上抗菌素具有耐药性，对食品安全造成了威胁。为了缓解抗菌素滥用带来的危害，亟需研发对环境和人类健康无害的抗菌素替代产品。
噬菌体是能够通过细菌裂解来调节细菌种群的天然抗菌剂。噬菌体对多重耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有杀菌活性。由于噬菌体的杀菌机制与抗生素的完全不同，所以噬菌体可以杀死多重耐药的细菌。由于其特异性的限制，噬菌体疗法的抗菌谱较窄，仅能抑制单一物种，甚至在某些情况下，某种噬菌体仅能抑制种内的某些菌株。但是，由于抗菌素的广谱性，抗生素改变了患者整个微生物种群，而不是目标病原体。
虽然噬菌体容易与普通颗粒饲料混合，但普通饲料对仔苗的诱食性很差，所以噬菌体很难进入到仔鱼消化道起到保护作用。本发明设计的方法，采用特定的卤虫无节幼体强化方法，使开口饲料的卤虫无节幼体作为噬菌体的载体，携带噬菌体进入仔鱼消化道，消除水产致病菌的威胁，从而起到保护作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速高效的卤虫无节幼体的噬菌体强化方法，采用本方法可以快速高效地使开口饲料的卤虫无节幼体作为噬菌体的载体，携带噬菌体进入鱼类消化道，
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一株能够裂解维氏气单胞菌的噬菌体，其特征在于：噬菌体名称为ΦA8-29，分类名称为Aeromonas veronii phage，保藏编号：CGMCC No.9152；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
噬菌体ΦA8-29裂解的维氏气单胞菌，名称为A8-29，分类名称为Aeromonasveronii，保藏编号：CGMCC No.9093，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
一株能够裂解潘氏变形杆菌的噬菌体，其特征在于：噬菌体名称为ΦP4-3，分类名称为：Proteus pennea phage。
噬菌体ΦP4-3裂解的宿主菌，名称为：P4-3，分类名称为Proteus pennea。
一株能够裂解类志贺邻单胞菌的噬菌体，其特征在于：噬菌体名称为ΦP4-7，分类名称为：Plesiomonas shigelloides phage。
噬菌体ΦP4-7裂解的宿主菌，名称为：P4-7，分类名称为Plesiomonasshigelloides。
一种适用于卤虫无节幼体的噬菌体强化方法，步骤如下：
(1)噬菌体裂解液的制备
通过LB液体培养基，将宿主菌培养至对数期中期(OD600＝0.6)，加入适量噬菌体裂解液，使感染复数(multiplicity of infection，MOI)约等于1，振荡培养4～6h，4000×g离心10min，上清液即为噬菌体裂解液。将噬菌体裂解液进行梯度稀释，100μL不同浓度的噬菌体稀释液与200μL对应的指示菌混合，双层平板法测定噬菌体滴度。
(2)卤虫的孵化
将2g卤虫卵(Artemia salina)加入到1L终浓度为2.8％(ω/v)的氯化钠溶液中，pH 7.8，在水温28℃的条件下，通气24～36h即可得到卤虫无节幼体。
(3)滴度对噬菌体强化的影响
在密度为100只/mL的卤虫无节幼体悬液中添加不同浓度(103～108pfu/mL)的噬菌体，吸附30min后，收集并匀浆无节幼体，用2mL盐度为2％的NaCl溶液重悬研磨液，梯度稀释后稀释液与指示菌混合倒双层平板，每个滴度三个平行。
(4)时间对噬菌体强化的影响
在盐度为20‰的盐水中，将刚孵化的密度为100只/mL的卤虫无节幼体与终浓度为107pfu/mL的噬菌体混合。每5min取一次样，用200目的滤网收集卤虫，匀浆后用2mL无菌盐水(2％，ω/v)重悬，稀释后倒双层平板。每5min取一次样，每个时间点三个平行。
(5)噬菌体强化：
在密度为1000只/mL的卤虫无节幼体悬液中添加终浓度为109pfu/ml的噬菌体，吸附40min后，用200目尼龙滤网收集卤虫无节幼体。
作为优选，卤虫无节幼体的噬菌体强化时间为40min，此时间条件下，卤虫吸附较为彻底。
作为优选，卤虫无节幼体的噬菌体强化时，噬菌体滴度控制为109pfu/ml，此滴度下，卤虫无节幼体吸附的噬菌体最多。
附图说明
图1是本发明中实施例1的滴度对噬菌体强化的影响
图2是本发明中实施例2的时间对噬菌体强化的影响
图3是本发明中实施例3的宿主菌P4-3在鱼类消化道中的相对存活率。
图4是本发明中实施例3的噬菌体ΦP4-3在鱼类消化道中的相对存活率。
图5是本发明中实施例4的宿主菌P4-7在鱼类消化道中的相对存活率。
图6是本发明中实施例4的噬菌体phiP4-7在鱼类消化道中的相对存活率。
具体实施方式
实施例1：
按照上述实施方案，使用三种噬菌体测定滴度对噬菌体强化的影响。其中噬菌体名称为ΦA8-29，分类名称为Aeromonas veronii phage，保藏编号：CGMCC No.9152；维氏气单胞菌名称为A8-29，分类名称为Aeromonas veronii，保藏编号：CGMCC No.9093，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
(1)噬菌体裂解液的制备
通过LB液体培养基，将宿主菌培养至对数期中期(OD600＝0.6)，加入适量噬菌体裂解液，使感染复数(multiplicity of infection，MOI)约等于1，振荡培养4～6h，4000×g离心10min，上清液即为噬菌体裂解液。将噬菌体裂解液进行梯度稀释，100μL不同浓度的噬菌体稀释液与200μL对应的指示菌混合，双层平板法测定噬菌体滴度。
(2)卤虫的孵化
将2g卤虫卵(Artemia salina)加入到1L终浓度为2.8％(ω/v)的氯化钠溶液中，pH 7.8，在水温28℃的条件下，通气24～36h即可得到卤虫无节幼体。
(3)滴度对噬菌体强化的影响
在密度为100只/mL的卤虫无节幼体悬液中添加不同浓度(103～108pfu/mL)的噬菌体，吸附30min后，收集并匀浆无节幼体，用2mL盐度为2％的NaCI溶液重悬研磨液，梯度稀释后稀释液与指示菌混合倒双层平板，每个滴度三个平行。
如图1所示，当噬菌体终浓度为103～106pfu/ml时，卤虫无节幼体仅能吸附少量的噬菌体，当噬菌体终浓度为107～108pfu/ml时，卤虫无节幼体吸附的逐渐增加。所以，噬菌体的浓度越高，卤虫无节幼体能够吸附的噬菌体就越多。
实施例2：
(1)采用相同的噬菌体裂解液的制备方法以及卤虫的孵化方法。
(2)时间对噬菌体强化的影响
在盐度为20‰的盐水中，将刚孵化的密度为100只/mL的卤虫无节幼体与终浓度为107pfu/mL的噬菌体混合。每5min取一次样，用200目的滤网收集卤虫，匀浆后用2mL无菌盐水(2％，ω/v)重悬，稀释后倒双层平板。每5min取一次样，每个时间点三个平行。
如图2所示，吸附40min内，卤虫无节幼体对噬菌体的吸附数量呈爆发式增长，吸附40min后，吸附数量趋于稳定。
实施例3：
(1)采用相同的噬菌体裂解液的制备方法以及卤虫的孵化方法。
(2)在密度为1000只/mL的卤虫无节幼体悬液中添加终浓度为109pfu/ml的噬菌体ΦP4-3，吸附40min后，用200目尼龙滤网收集卤虫无节幼体。
(3)将噬菌体强化后的卤虫喂食斑马鱼，12小时后喂食混有宿主菌P4-3的颗粒饲料，对照组为单独喂食噬菌体强化后的卤虫以及混有宿主菌的颗粒饲料。研究时间为7天，期间斑马鱼被喂食未强化的卤虫无节幼体。
(4)每天收集斑马鱼的粪便，称取粪便的湿重并将其重悬在1mL的无菌生理盐水中，粪便重悬液被适当稀释后，涂布于含有100μg/mL链霉素，50μg/mL壮观霉素以及8μg/mL四环素的LB平板上，检测粪便中宿主菌的浓度。重悬液被离心，上清液被适当稀释，双层平板法检测粪便中噬菌体浓度。
(5)如图3所示，相对于对照实验组，实验组变形杆菌P4-3的存活率逐渐减少，并且在实验开始之后的第五天，再也检测不到变形杆菌的存在。因此，噬菌体ΦP4-3能够有效减少变形杆菌在斑马鱼肠道中的定殖。
(6)如图4所示，虽然排泄物中的噬菌体浓度逐渐减少，但是在四天内噬菌体仍然能够检测到，并且实验组在实验结束时，仍然能够检测到，暗示噬菌体ΦP4-3在斑马鱼的消化道中能够存活并且保持稳定。
实施例4：
(1)采用与实施例3相同的技术方案和步骤，采用噬菌体ΦP4-7以及指示菌P4-7作为研究对象，观察噬菌体强化过的卤虫无节幼体对斑马鱼的保护效果。
(2)如图5所示，在7天的实验周期中，相对于对照组，实验组能够逐渐减少类志贺邻单胞菌在斑马鱼排泄物中的浓度。虽然在前4天的实验中，治疗实验组的效果不明显，但是在4天之后，治疗实验组的类志贺邻单胞菌的浓度比对照组少一个数量级。因此，噬菌体phiP4-7能够有效减少类志贺邻单胞菌在排泄物中的定殖。
(3)如图6所示，在7天的实验周期中，排泄物中的噬菌体浓度虽然逐渐减少，但是在四天内噬菌体仍然能够检测到，实验组在实验结束时，仍然能够检测到，暗示噬菌体phiP4-7能够存活并且稳定在斑马鱼的消化道中。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一株能够裂解维氏气单胞菌的噬菌体，其特征在于：噬菌体名称为ΦA8-29，分类名称为Aeromonas veronii phage，保藏编号：CGMCC No.9152；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
2.权利要求1所述的噬菌体裂解的宿主菌，名称为A8-29，分类名称为Aeromonasveronii，保藏编号：CGMCC No.9093，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年04月25日。
3.一株能够裂解潘氏变形杆菌的噬菌体，其特征在于：噬菌体名称为ΦP4-3，分类名称为：Proteus pennea phage。
4.权利要求3所述的噬菌体裂解的宿主菌，名称为：P4-3，分类名称为Proteus pennea。
5.一株能够裂解类志贺邻单胞菌的噬菌体，其特征在于：噬菌体名称为ΦP4-7，分类名称为：Plesiomonas shigelloides phage。
6.权利要求5所述的噬菌体裂解的宿主菌，名称为：P4-7，分类名称为Plesiomonasshigelloides。
7.一种适用于卤虫无节幼体的噬菌体强化方法，步骤如下：
(1)噬菌体裂解液的制备：
宿主菌培养至对数期中期(OD600＝0.6)，加入适量噬菌体裂解液，使感染复数(multiplicity of infection，MOI)约等于1，振荡培养4～6h，4000×g离心10min，上清液即为噬菌体裂解液。
(2)卤虫的孵化：
将2g卤虫卵(Artemia salina)加入到1L终浓度为2.8％(ω/v)的氯化钠溶液中，pH7.8，在水温28℃的条件下，通气24～36h即可得到卤虫无节幼体。
(3)滴度对噬菌体强化的影响：
在密度为100只/mL的卤虫无节幼体悬液中添加不同滴度的噬菌体，吸附40min后，收集并匀浆无节幼体，梯度稀释后稀释液与指示菌混合倒双层平板，每个滴度三个平行。
(4)时间对噬菌体强化的影响：
在盐度为20‰的盐水中，将刚孵化的密度为100只/mL的卤虫无节幼体与终浓度为107pfu/mL的噬菌体混合。每5min取一次样，收集并匀浆无节幼体，梯度稀释后稀释液与指示菌混合倒双层平板，每个滴度三个平行。
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