CN109517752A - 一种胞外多糖及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胞外多糖及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的此胞外多糖(EPS)是由保藏编号为CCTCC NO:M 2018426的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)分泌得到的一种由氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖构成的杂多糖，它具有比抗坏血酸更高的清除自由基能力；能够为AAPH以及羟基自由基诱导的氧化应激提供良好的DNA保护作用；同时，还可以防止紫外辐射对DNA活性的直接破坏。

Description

一种胞外多糖及其应用
技术领域
本发明涉及一种胞外多糖及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)作为生物遗传信息贮存中心，控制着细胞的增殖与分化，是生物体内一类重要的活性大分子。辐射和化学诱变剂导致的氧化应激产生的活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)可以造成DNA氧化损伤，从而导致各种疾病的发生，危害人类健康。
ROS主要包括羟基自由基(·OH)，超氧自由基(O2-·)和过氧化氢(H2O2)。在正常情况下，ROS可以被机体的抗氧化防御系统有效地消除，它的产生和消除是平衡的；然而，当外源性ROS侵入或存在辐射氧化应激，ROS的产生和消除平衡受到破坏，过量的ROS会攻击细胞成分(如脂质，蛋白质和核酸)，损害细胞的完整性，引起严重的健康问题，如癌症，阿尔茨海默病，帕金森病和动脉粥样硬化等。
目前，消除过量的ROS最常用的方法是使用抗氧化剂，然而，大多数合成的抗氧化剂被发现具有细胞毒性，如丁基羟基茴香醚(Butylated hydroxyanisole，BHA)和丁基羟基甲苯 (Butylated hydroxytoluene，BHT)等。
因此，急需找到一种既能够消除过量的ROS，又没有细胞毒性的新型抗氧化剂。
微生物胞外多糖(EPS)是由细菌和微藻分泌到生长培养基中的长链多糖，具有安全性以及多种特殊的物理化学性质，被广泛应用于化妆品、药品和食品添加剂的生产。现在，已经报道了许多由微生物菌株产生的EPS，例如，植物乳杆菌YW32产生的EPS具有清除羟自由基和超氧自由基的能力且对多种致病菌生物膜的形成具有浓度依赖性的抑制作用；植物乳杆菌BR2在显示有效抗氧化活性的同时，对样品H9C2的正常细胞没有产生任何毒性；多粘类芽孢杆菌SQR-21产生的EPS表现出良好的超氧化物清除活力、絮凝能力和金属螯合能力。
因此，我们可以从微生物入手，尝试找到一种既能够消除过量ROS能力，又没有细胞毒性新型胞外多糖作为抗氧化剂以保护DNA不受损伤。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种胞外多糖及其应用。此胞外多糖(EPS)是由保藏编号为CCTCC NO:M 2018426的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)分泌得到的一种由氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖构成的杂多糖，它具有比抗坏血酸更高的清除自由基能力；能够为AAPH以及羟基自由基诱导的氧化应激提供良好的DNA保护作用；同时，还可以防止紫外辐射对DNA活性的直接破坏。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种胞外多糖，所述胞外多糖(EPS)是由丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) 产生的；所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)已于2018年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018426，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述胞外多糖(EPS)的成分包含氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖的摩尔比为7:1:4.5:2.1:9:5。
在本发明的一种实施方式中，所述胞外多糖(EPS)的分子量为1.23×104Da。
本发明提供了一株可产胞外多糖的丁酸梭菌，所述丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)已于2018年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018426，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是从鸡肠道中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株与丁酸梭菌的同源性为99％，通过构建系统发育树判定菌株为丁酸梭菌，命名为丁酸梭菌RO-07 (Clostridium butyricum RO-07)。
所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)经厌RCM固体培养基培养后，其菌落特征为表面光滑，淡黄色，菌落有明显拉丝，其生长特性为厌氧生长
在本发明的一种实施方式中，所述胞外多糖的成分包含氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖的摩尔比为7:1:4.5:2.1:9:5。
在本发明的一种实施方式中，所述胞外多糖的分子量为1.23×104Da。
本发明提供了上述一种胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述方法为使用上述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将权利要求5所述的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)接种至发酵培养基中，于30℃下厌氧培养48～72h，获得含有丁酸梭菌胞外多糖的发酵液；所述发酵培养基的成分包含蔗糖30g、蛋白胨10g、十二水合磷酸氢二钠4g、二水合磷酸二氢钠1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、七水合硫酸镁0.2g、酵母无氨基氮2g、蒸馏水 1000ml，pH为7.0。
本发明提供了上述一株可产胞外多糖的丁酸梭菌或上述一种胞外多糖的制备方法在制备胞外多糖方面的应用。
本发明提供了上述一种胞外多糖在清除自由基、抗氧化、防紫外辐射、保护DNA以及制备化妆品、制备药品、制备食品方面的应用。
本发明提供了含有上述一种胞外多糖的抗氧化剂、防辐射剂、DNA保护剂、化妆品添加剂、药品添加剂以及食品添加剂。
有益效果：
(1)本发明提供的这种胞外多糖(EPS)具有比抗坏血酸更高的清除自由基能力；
(2)本发明提供的这种胞外多糖(EPS)能够为AAPH以及羟基自由基诱导的氧化应激提供良好的DNA保护作用；
(3)本发明提供的这种胞外多糖(EPS)可以防止紫外辐射对DNA活性的直接破坏；
(4)本发明提供的这种胞外多糖(EPS)对细胞无毒害、无损伤；
(5)本发明提供的这种胞外多糖(EPS)在清除自由基、抗氧化、防紫外辐射、保护DNA以及制备化妆品、制备药品、制备食品方面有极高的应用价值；
(6)本发明提供的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)能够生产具有清除自由基、抗氧化、防紫外辐射以及保护DNA作用的胞外多糖；
(7)本发明提供的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)菌落有明显拉丝，可产生较多的胞外多糖；
(8)本发明提供的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)在制备化妆品、制备药品、制备食品方面有极大的应用潜力。
生物材料保藏
一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，分类学命名为丁酸梭菌RO-07(Clostridium butyricum RO-07)，已于2018年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018426，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1为从丁酸梭菌RO-07得到的粗EPS的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱洗脱图；
图2为从丁酸梭菌RO-07得到的粗EPS在Sepharose CL-6B柱上的进一步凝胶渗透色谱图；
图3为丁酸梭菌RO-07产生的EPS的FT-IR光谱；
图4为丁酸梭菌RO-07产生的EPS的甲基化GC图；
图5为丁酸梭菌RO-07产生的EPS的MS图谱分析结果；
图6为丁酸梭菌RO-07产生的EPS以抗坏血酸为阳性对照的还原力；
图7为丁酸梭菌RO-07产生的EPS以抗坏血酸为阳性对照的羟自由基清除活性；
图8为丁酸梭菌RO-07产生的EPS以抗坏血酸为阳性对照的超氧自由基清除活性；
图9为丁酸梭菌RO-07产生的EPS对AAPH(10mM)诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响；
其中，泳道1为空白组、泳道2为对照组、泳道3为含有15.6μg/mL多糖组、泳道4为含有31.2μg/mL多糖组、泳道5为含有62.5μg/mL多糖组、泳道6为含有125μg/mL多糖组、泳道7为含有250μg/mL多糖组、泳道8为含有500μg/mL多糖组、泳道9为含有1000μg/mL 多糖组；
图10为抗坏血酸对AAPH(10mM)诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响；
其中，泳道1为空白组、泳道2为对照组、泳道3为含有15.6μg/mL的抗坏血酸组、泳道4为含有31.2μg/mL的抗坏血酸组、泳道5为含有62.5μg/mL的抗坏血酸组、泳道6为含有125μg/mL的抗坏血酸组、泳道7为含有250μg/mL的抗坏血酸组、泳道8为含有500μg/mL 的抗坏血酸组、泳道9为含有1000μg/mL的抗坏血酸组；
图11为丁酸梭菌RO-07产生的EPS对羟基自由基诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响；
其中，泳道1为空白组、泳道2为对照组、泳道3为含有15.6μg/mL多糖组、泳道4为含有31.2μg/mL多糖组、泳道5为含有62.5μg/mL多糖组、泳道6为含有125μg/mL多糖组、泳道7为含有250μg/mL多糖组、泳道8为含有500μg/mL多糖组、泳道9为含有1000μg/mL 多糖组；
图12为抗坏血酸对羟基自由基诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响；
其中，泳道1为空白组、泳道2为对照组、泳道3为含有15.6μg/mL的抗坏血酸组、泳道4为含有31.2μg/mL的抗坏血酸组、泳道5为含有62.5μg/mL的抗坏血酸组、泳道6为含有125μg/mL的抗坏血酸组、泳道7为含有250μg/mL的抗坏血酸组、泳道8为含有500μg/mL 的抗坏血酸组、泳道9为含有1000μg/mL的抗坏血酸组；
图13为由丁酸梭菌RO-07产生的EPS对紫外线辐射诱导的pBR322质粒DNA链断裂的影响；
其中，泳道1为空白组、泳道2为对照组、泳道3为含有15.6μg/mL多糖组、泳道4为含有31.2μg/mL多糖组、泳道5为含有62.5μg/mL多糖组、泳道6为含有125μg/mL多糖组、泳道7为含有250μg/mL多糖组、泳道8为含有500μg/mL多糖组、泳道9为含有1000μg/mL 多糖组；
图14为抗坏血酸对紫外线辐射诱导的pBR322质粒DNA链断裂的影响；
其中，泳道1为空白组、泳道2为对照组、泳道3为含有15.6μg/mL的抗坏血酸组、泳道4为含有31.2μg/mL的抗坏血酸组、泳道5为含有62.5μg/mL的抗坏血酸组、泳道6为含有125μg/mL的抗坏血酸组、泳道7为含有250μg/mL的抗坏血酸组、泳道8为含有500μg/mL 的抗坏血酸组、泳道9为含有1000μg/mL的抗坏血酸组；
图15为菌株RO-07基于16S rDNA序列的系统发育树。
具体实施方式
本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
实施例1：本发明菌株的鉴定
具体步骤如下：
(1)将鸡盲肠内容物通过85℃热处理后，用梭菌强化培养基富集培养，再经筛菌固体培养基厌氧培养后分离得到了53个分离株；
(2)将分离株经过菌落形态、生长特性、革兰氏染色、菌落拉丝实验，筛选出一株在厌氧平板上能够良好生长、表面光滑、革兰氏阳性、产酸、产气、能利用淀粉、不能水解明胶并且产多糖较高的菌株；
(3)提取该菌株的基因组DNA，并将该菌株16S rRNA基因扩增后回收测序，所得16SrRNA核苷酸序列提交NCBI做BLAST分析，结果表明该菌株与丁酸梭菌同源性均在99％以上；
(4)挑选出与该菌序列同源性相近的序列，将结果构建系统进化树(系统进化树如图 15)，最终确定该菌株属于丁酸梭菌，将其命名为Clostridium butyricum RO-07。
实施例2：本发明胞外多糖的制备
(1)将实施例1中的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)RO-07进行活化、扩大培养；
(2)将步骤(1)制得的扩培菌株接种至发酵培养基中，30℃有厌氧培养48～72h，获得含有丁酸梭菌胞外多糖的发酵液；
(3)将步骤(2)制得的液体发酵液离心，收集上清液；
(4)将步骤(3)制得的上清液超滤浓缩至原体积的1/5，得浓缩液，然后向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，经醇沉后，离心，收集沉淀；
(5)将步骤(4)收集的沉淀用水溶解，加入1/4体积的Seveage试剂去除蛋白质，制得粗糖溶液；
(6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱获得酸性多糖分级，再经过Sepharose CL-6B凝胶层析柱分离，收集多糖分级(图1为从丁酸梭菌RO-07得到的粗EPS的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱洗脱结果；图2为 Sepharose CL-6B柱上的进一步凝胶渗透色谱)；
(7)将步骤(6)制得的胞外多糖溶液经透析真空冷冻干燥后，制得纯化的胞外多糖；
其中，发酵培养基组分如下：蔗糖30g、蛋白胨10g、十二水合磷酸氢二钠4g、二水合磷酸二氢钠1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、七水合硫酸镁0.2g、酵母无氨基氮2g、蒸馏水1000ml， pH为7.0。
实施例3：本发明胞外多糖的鉴定
1、分子量的测定
具体步骤如下：
(1)以针头过滤器过滤实施例2得到的EPS样品(5mg/mL，200μL)(孔径0.22μm)；
(2)将过滤后的EPS样品注入两个Ultrahydrogel TM线性串联柱(ID 7.8mm×300mm) 中，用NaNO3溶液(0.1M)以0.9mL/min流速进行洗脱，得到响应值数据；
(3)将得到的数据用Empower(Waters，USA)收集和处理，分子量(Mw)直接根据每个洗脱体积的分子量和RI信号值的的定义Mw来计算Mw。
测定结果为：EPS的平均分子量为1.23×104Da；EPS的色谱图显示为单一对称的窄峰，表明EPS是均质材料；同时，在220、260、280nm处从UV检测器未检测到峰，表明EPS 没有蛋白质或核酸。
2、单糖组成的测定
具体步骤如下：
(1)将10mg实施例2得到的EPS用10mL三氟乙酸(TFA)(2M)在105℃水解8小时；
(2)通过减压蒸发除去EPS中的TFA；
(3)以标准岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和果糖作为对比，通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)连同脉冲安培检测器(Thermo Scientific，USA)和CarboPac PA20柱(ID 3mm×150mm)测定水解产物的单糖组成和单糖含量；
其中，HPAEC操作条件如下：
流动相A：250mmol/L的NaOH；流动相B：水；流动相C：1mol/L的NaAc；流速：0.5mL/min
梯度洗脱条件如下：0-21.1min，98.2％A、1.8％B；21.1-30min，93.2％A、1.8％B、5％C； 30-30.1min，78.2％A、1.8％B、20％C；30.1-50min，20％A、80％B。
将测定结果与标准品对比计算，结果发现：EPS由氨基葡糖，阿拉伯糖，氨基半乳糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖约以7：1：4.5：2.1：9：5的不同摩尔比组成，结果表明，EPS是杂多糖。
3、FT-IR光谱检测
具体步骤如下：
将实施例2得到的EPS和KBr分别以1：100的比例混合研磨，然后通过抽真空压成薄片；将压成薄片的EPS在4000-400cm-1的范围内的Nexus Nicolet 470傅里叶变换红外分光光度计(Thermo Nicolet，USA)上测定(图3为丁酸梭菌RO-07产生的EPS的FT-IR光谱)。
测定结果为：如图3，在3384.94cm-1附近的宽拉伸峰归因于羟基；2933.43cm-1处的不对称C-H伸缩振动峰表明蛋白质或者糖类等有机物质的存在；在1700-1775cm-1附近没有峰表明EPS中不存在葡萄糖醛酸和二酰基酯；在1651.25cm-1处的吸收归因于C＝O组；在1548.23cm-1处的弱峰可能归因于N-H弯曲振动；在1200-1000cm-1区域的广泛吸收被认为是C-O-C和C-O伸展，表明存在碳水化合物；在1055.37cm-1处的强吸收峰表明样品是多糖。
结果表明，在EPS有羧基和羟基等主要官能团。
4、甲基化分析
具体步骤如下：
(1)在20μg实施例2得到的EPS中使用玻璃移液管加入无水二甲基亚砜(150μL)，涡旋混合并超声处理15分钟以溶解糖；
(2)加入细粉状氢氧化钠约10mg，(研钵充分研磨)，甲基碘(50μL)，超声反应15 分钟；
(3)加入氯仿(1mL)和水(2mL)并涡旋混合，短暂离心(1000-2000rpm，2分钟) 然后丢弃上清，用水(2mL)重复洗涤氯仿相5次；
(4)制备新鲜的2M三氟乙酸溶液(0.5ml TFA+2.75mL水)并向样品中加入等分试样(100μL)，涡旋混合并在120℃下加热1小时；
(5)蒸发至干燥并用三份甲醇(100-200μL)冲洗反应物的侧面，每次添加后通过吹氮气干燥样品；
(6)将硼氘化钠(10mg)溶于0.01M氢氧化钠(1mL)中，并将等分试样(300μL)加入样品中,在4℃下过夜，用乙酸消除过量的硼化氘并蒸发至干；
(7)用含有1％乙酸的甲醇除去硼酸盐；
(8)将乙酸酐(75μL)和无水吡啶(75μL)加入到干燥的残余物中，并在100℃下加热90分钟；
(9)将样品吹至干燥并加入氯仿(200μL)和水(200μL)和旋涡以溶解样品。将有机相转移至5mL离心管。将另外的等分试样(3次)氯仿和水加入到原始的1mL反应性，旋涡混合物中，并将有机相转移至5mL反应物中；
(10)将5mL离心管中有机层的体积调至1mL(+200μlCHCl3)并加入2mL水，旋涡震荡后离心分离，丢弃水层，重复4次洗涤氯仿相，并将氯仿相吹干；
(11)用二氯甲烷(100μL)溶解样品进行GC-MS检测。
测定结果如下：如图4-5，GC图谱的6个峰表明多糖是由6种不同单糖组成，结合MS结果分析该多糖是由氨基葡糖，阿拉伯糖，氨基半乳糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖，并以1，6,和1，2糖苷键连接。
5、还原能力的测定
具体步骤如下：
(1)将反应体系进行混合并将混合物在50℃水浴20分钟；
(2)将1mL三氯乙酸(TCA)加入到混合物中终止反应，然后离心(5000g，10分钟)；
(3)在上清液中加入0.25ml新鲜的0.1％FeCl3，摇动混匀并在700nm处测量吸光度；
(4)使用去离子水和抗坏血酸分别作为空白和阳性对照(图6为丁酸梭菌RO-07产生的EPS以抗坏血酸为阳性对照的还原力)；
其中，反应体系由1mL K3Fe(CN)6(1％)、1mL 0.2M的磷酸盐缓冲液(pH6.6)、0.5mLEPS溶液(分别含有0.05mg、0.25mg、0.5mg、0.75mg、1mg实施例2所得EPS)组成。
测定结果如下：如图6，尽管抗坏血酸的还原能力高于EPS，但EPS也以剂量依赖性方式表现出显著的还原能力。
结果表明，EPS具有很高的供氢能力，能与自由基反应以终止自由基连锁反应。
6、羟自由基清除活性的测定
具体步骤如下：
(1)将反应体系进行混合并将混合物在37℃水浴60分钟；
(2)在510nm处测量吸光度并使用去离子水和抗坏血酸分别作为空白和阳性对照(图7 为丁酸梭菌RO-07产生的EPS以抗坏血酸为阳性对照的羟自由基清除活性)；
其中，反应体系由1mL 75mM FeSO4、1mL 6mM水杨酸钠、1mL 18mM H2O2、实施例2 得到的EPS(质量分别为0.05mg、0.25mg、0.5mg、0.75mg、1mg)组成；
清除率(％)＝(1-A/B)×100；
其中，A为试样，B为对照。
测定结果如下：如图7，EPS的羟自由基清除活性从34.5％到75.2％，比剂量依赖性的抗坏血酸羟自由基清除活性从5.7％到62％高得多。
结果表明，EPS能够防止由羟基自由基引起的损伤。
7、超氧化物自由基清除活性的测定
具体步骤如下：
(1)将反应体系进行混合并将混合物在25℃下温育4分钟；
(2)每隔30秒测定其在325nm处的吸光度，并且计算每分钟的增加量作为邻苯三酚酸的自氧化速率；
(3)使用去离子水和抗坏血酸分别作为空白和阳性对照(图8为丁酸梭菌RO-07产生的EPS以抗坏血酸为阳性对照的超氧自由基清除活性)；
其中，反应体系由在25℃温育20min的2.89mL的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.2)、10μL的45mM邻苯三酚、100μL EPS溶液(此EPS溶液为通过分别将0.05mg、0.25mg、0.5mg、0.75mg、1mg实施例2所得EPS与水混合得到的)组成；
超氧阴离子自由基清除率(％)＝(1-A/B)×100；
其中，A为样品邻苯三酚自氧化速率，B为空白邻苯三酚自氧化速率。
测定结果如下：如图8，从剂量依赖性的8.2％增加到95％，当反应体系中的EPS为1mg 时，可以达到95％的超氧自由基清除活性。
结果表明，EPS具有明显的超氧自由基清除活性。
8、防止AAPH破坏活性的测定
具体步骤如下：
(3)将2μL pBR322质粒DNA(50μg/mL)与6μL PBS，8μL AAPH(10mM)和8μL 实施例2的EPS(16.5-1000μg/mL)混合；
(2)将2μL pBR322质粒DNA(50μg/mL)与6μL PBS，8μL AAPH(10mM)和8μL 抗坏血酸(16.5-1000μg/mL)混合；
(3)将混合物涡旋并在黑暗中孵育(37℃，60分钟)，然后装载混合物，电泳紫外观察并分析。
(图9为丁酸梭菌RO-07产生的EPS对AAPH(10mM)诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响；图10为抗坏血酸对AAPH(10mM)诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响)
其中，DNA链断裂的抑制(％)＝(未损伤的DNA含量(带强度))/(泳道的总DNA 含量)*100％。
检测结果如下：如图9-10，EPS在15.6和1000μg/mL浓度之间以剂量依赖性方式显示对 AAPH诱导的氧化应激有着显著的保护作用；然而，抗坏血酸在较低浓度下表现出较高的保护作用，这可能与其强还原力有关。
结果表明，EPS对AAPH诱导的氧化应激有着显著的保护作用。
9、防止羟基自由基破坏活性的测定
具体步骤如下：
(1)将2μL的pBR322质粒DNA(50μg/mL)与10μL的PBS、2μL的H2O2(10mM)， 2μL的FeSO4(1.75mM)和8μL实施例2的EPS(16.5-1000μg/mL)混合；
(2)将2μL的pBR322质粒DNA(50μg/mL)与10μL的PBS、2μL的H2O2(10mM)， 2μL的FeSO4(1.75mM)和8μL抗坏血酸(16.5-1000μg/mL)混合作为对照；
(3)用PBS代替上述H2O2和FeSO4作为空白对照；
(4)涡旋上述混合物并在室温下放置10分钟，然后装载混合物，电泳紫外观察并分析 (图11为丁酸梭菌RO-07产生的EPS对羟基自由基诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响；图12为抗坏血酸对羟基自由基诱导pBR322质粒DNA链断裂的影响)。
检测结果如下：如图11-12，pBR322质粒会受Fenton反应产生的羟基自由基的攻击，然而，EPS对这种损伤具有保护作用，并且其效果优于抗坏血酸，重要的是，当浓度为93.2％时，EPS浓度的有效范围比抗坏血酸广泛得多，在500μg/mL时效果最好；另外，当EPS浓度达到1000μg/mL时，对DNA没有观察到保护作用，相应地，抗坏血酸对DNA的保护作用随着浓度的增加而降低。
结果表明，EPS对羟基自由基诱导的氧化应激有着显著的保护作用。
10、防止紫外线辐射破坏活性的测定
具体步骤如下：
(1)将2μL的pBR322质粒DNA(50μg/mL)与14μL的PBS和8μL实施例2的EPS (16.5-1000μg/mL)混合；
(2)将将2μL的pBR322质粒DNA(50μg/mL)与14μL的PBS和8μL的抗坏血酸 (16.5-1000μg/mL)混合作为对照；
(3)用内部自然光代替紫外线来控制，涡旋混合物并在室温下在UV灯照射(8W，20cm) 中温育20分钟，然后装载混合物，电泳紫外观察并分析(图13为由丁酸梭菌RO-07产生的 EPS对紫外线辐射诱导的pBR322质粒DNA链断裂的影响；图14为抗坏血酸对紫外线辐射诱导的pBR322质粒DNA链断裂的影响)。
检测结果如下：如图13-14，EPS具有良好的DNA保护活性，且在250μg/mL时效果最佳，但抗坏血酸对比无明显效果；EPS和抗坏血酸都能防止辐射引起的DNA降解，在没有添加EPS和VC时图13-14的泳道2都很暗。
结果表明，EPS能够防止由UV辐射引起的损伤。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种胞外多糖及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1567
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attggagatc ggtacttcgc gaatgcgtcg gtgtcgccct tagagtttga tcctggctca 60
ggacgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgag cgatgaagct ccttcgggag 120
tggattagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctaataga ggggaatagc 180
ctttcgaaag gaagattaat accgcataag attgtagtac cgcatggtac agcaattaaa 240
ggagtaatcc gctatgagat ggacccgcgt cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 300
accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacattgg gactgagaca 360
cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggg gaaaccctga 420
tgcagcaacg ccgcgtgagt gatgacggtc ttcgaattgt aaagctctgt ctttagggac 480
gataatgacg gtacctaagg aggaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 540
acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttac tgggcgtaaa gggagcgtag gtggatattt 600
aagtgggatg tgaaataccc gggcttaacc tgggtgctgc attccaaact ggatatctag 660
agtgcaggag aggaaaggag aattcctagt gtagcggtga aatgcgtaga gattaggaag 720
aataccagtg gcgaaggcgc ctttctggac tgtaactgac actgaggctc gaaagcgtgg 780
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat actaggtgta 840
ggggttgtca tgacctctgt gccgccgcta acgcattaag tattccgcct ggggagtacg 900
gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg 960
tttaattcga agcaacgcga agaaccttac ctagacttga catctcctga attactctgt 1020
aatggaggaa gccacttcgg tggcaggaag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1080
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttattgtta gttgctacca 1140
tttagttgag cactctagcg agactgcccg ggttaaccgg gaggaaggtg gggatgacgt 1200
caaatcatca tgccccttat gtctagggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacaatga 1260
gatgcaacct cgcgagagtg agcaaaacta taaaaccgat ctcagttcgg attgtaggct 1320
gaaactcgcc tacatgaagc tggtgttgct agtaatcgcg aatcagaatg tcgcggtgaa 1380
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagttggca atacccaaag 1440
ttcgtgagct aaccgcaagg aggcagcgac ctaaagtagg gtcagcgatt ggggtgaagt 1500
cgtaacaagg taaccaaggg cgacacatgc cgggaccgac gagtgcagag gcgtgcaagc 1560
gagcttg 1567

Claims (10)

1.一种胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖(EPS)是由丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)产生的；所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)已于2018年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018426，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
2.如权利要求1所述的一种胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖(EPS)的成分包含氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖。
3.如权利要求2所述的一种胞外多糖，其特征在于，所述氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖的摩尔比为7:1:4.5:2.1:9:5。
4.如权利要求1-3任一所述的一种胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖(EPS)的分子量为1.23×104Da。
5.一株可产胞外多糖的丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)已于2018年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018426，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
6.如权利要求1-4任一所述的一种胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求5所述的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
7.如权利要求6所述的一种胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述方法为将权利要求5所述的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)接种至发酵培养基中，于30℃下厌氧培养48～72h，获得含有丁酸梭菌胞外多糖的发酵液；所述发酵培养基的成分包含蔗糖30g、蛋白胨10g、十二水合磷酸氢二钠4g、二水合磷酸二氢钠1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、七水合硫酸镁0.2g、酵母无氨基氮2g、蒸馏水1000ml，pH为7.0。
8.权利要求5所述的一株可产胞外多糖的丁酸梭菌或权利要求6或7所述的一种胞外多糖的制备方法在制备胞外多糖方面的应用。
9.权利要求1-4任一所述的一种胞外多糖在清除自由基、抗氧化、防紫外辐射、保护DNA以及制备化妆品、制备药品、制备食品方面的应用。
10.含有权利要求1-4任一所述的一种胞外多糖的抗氧化剂、防辐射剂、DNA保护剂、化妆品添加剂、药品添加剂以及食品添加剂。
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