CN109513040A - 一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料及制备方法 - Google Patents

一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料及制备方法，在以金为基材，将聚乙二醇和抗凝血多肽连接到金表面，抗凝血多肽为ACH11，得具有良好抗血栓性能的医用材料。研究显示，本发明改性的材料表面亲水性大大提高，表现出优异的血液相容性。改性后材料不仅能抑制凝血因子X的激活，而且还可以抵抗血小板的粘附和激活。本发明的方法制备得到了一种性能优良的抗凝血改性表面，解决材料血液相容性问题。

Description

一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料及制备方法
技术领域
本发明属于血液接触性材料及生物相容性改性领域，更加具体地说，特别是涉及抗凝血生物材料表面改性技术领域，具体地涉及一种亲水性聚乙二醇和抗凝血多肽修饰金材料及制备方法。
背景技术
心血管类疾病已经成为威胁人们健康的一种主要疾病。因此，血液接触材料是目前临床上最为紧缺的生物材料医疗器械，尤其是心血管支架。然而，人工心血管支架接触血液后经常会引起溶血、凝血、血栓等现象以及远期的组织炎症反应、慢性内膜增生和支架再狭窄等问题。出现这些问题的主要原因是支架表面较差的亲水性能和血液相容性，因此，如何构建优异生物相容性的心血管人工支架已成为一个研究热点。对心血管人工支架进行抗凝血改性的方法包括本体改性和表面改性。本体改性是先将支架材料进行抗凝改性后,继而加工成型的一种改性方法。由于本体改性较为复杂,难以实施,在加工成型过程中抗凝效果极易受到影响,故难以满足临床上的要求。表面改性是通过各种物理、化学或者生物等手段,在材料表面形成具有抗凝血效果的涂层。表面改性方法简单易行,应用比较广泛。其中化学接枝法的得到的抗凝血涂层以其超强稳定性和高效功能性得到最为广泛的应用。
聚乙二醇(PEG)是一种被广泛应用的亲水性聚合物，以其高度的亲水性及柔顺性,一方面可以与水形成水合链,很容易形成水化层,形成稳定的空间位阻,阻碍血液成分在材料表面的吸附,从而具有抗非特异性蛋白吸附、抗血小板吸附以及抗细菌粘附的能力；另一方面,水合链在水中具有较低的表面能,形成的水微流可以阻止蛋白质的粘附与变形。因此,通过化学接枝等方法在材料表面引入PEG，能够有效改善材料表面亲水性，赋予材料表面优异的抗蛋白质吸附能力,提高材料的血液相容性。
近年来，在人工血管支架表面接枝一系列具有生物活性的抗凝分子,比如凝血酶抑制剂、血栓调节蛋白及抗血小板药物等，这些抗凝分子能够有效抑制材料对凝血因子的激活及血小板聚集活性，达到优异的抗血栓目的。一类新型的血栓抑制剂，记为ACH11多肽。该多肽来源于蛇毒液的水解产物，由11个氨基酸组成，序列为LTFPRIVFVLG。ACH11多肽一方面可以直接抑制凝血因子Ⅹ的激活，减缓凝血酶原向凝血酶的持续转化，从而避免血栓形成；另一方面对血小板粘附和聚集以及纤维蛋白原的激活也有明显的抑制作用。同时，进一步的体外实验表明ACH11多肽尚无明显的出血风险。因此，ACH11是一类性能优良、应用前景良好的血栓抑制剂。
为了同时赋予材料表面良好的亲水性及抗凝血性，在其表面共同接枝亲水性PEG和抗凝血多肽ACH11，有望构建一个具有良好血液相容性的血管支架表面。目前，尚未有基于PEG和ACH11共同接枝改性Au材料表面的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有优良亲水性及抗凝性的聚乙二醇和抗凝血多肽共同修饰的金材料。
本发明的第二个目的是提供一种聚乙二醇和抗凝血多肽修饰金材料的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种聚乙二醇和抗凝血多肽修饰金材料在提高心血管支架血液相容性方面的应用。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料，以金为基材，将聚乙二醇和抗凝血多肽连接到金表面，具体来说：
(1)在金表面依次连接PEG和抗凝血多肽，即在金表面先连接PEG，再连接抗凝血多肽(Au-PEG-ACH11)，在金和PEG之间为酰胺键连接，抗凝血多肽为ACH11，PEG和抗凝血多肽之间通过二硫键、—CH2CH NH2CO—和两个甘氨酸，与ACH11连接，PEG-ACH11的化学式如下：
(2)在金表面依次连接抗凝血多肽和PEG，即在金表面先连接抗凝血多肽，再连接PEG(即Au-ACH11-PEG)，抗凝血多肽为ACH11，金和抗凝血多肽之间通过金硫键连接，抗凝血多肽为ACH11，CGG-ACH11多肽序列中半胱氨酸(C)的巯基和金形成金硫键，通过两个甘氨酸(GG)与ACH11相连；利用抗凝血多肽另一端的羧基与氨基封端PEG反应，通过酰胺键将PEG连接到抗凝血多肽的另一端；
(3)在金表面连接PEG和抗凝血多肽，即PEG和抗凝血多肽分别连接到金表面(Au-PEG和Au-ACH11)，如金和PEG之间通过金硫键连接，金和抗凝血多肽之间通过金硫键连接，抗凝血多肽为ACH11，CGG-ACH11多肽序列中半胱氨酸(C)的巯基和金形成金硫键，通过两个甘氨酸(GG)与ACH11相连，PEG分子选择如下所示：
如对金表面功能化，利用巯基丙酸或者2-氨基乙硫醇使金表面产生羧基或者氨基，利用巯基丙酸或者2-氨基乙硫醇使金表面产生羧基或者氨基，氨基化的金与甲氧基和NHS活性酯封端的聚乙二醇反应，或者与甲氧基和羧基封端的聚乙二醇反应，依靠酰胺键将PEG连接到金表面。羧基化的金与氨基封端的PEG反应，依靠酰胺键将PEG连接到金表面；PEG分子式如下：
其中抗凝血多肽为ACH11多肽，序列为LTFPRIVFVLG，聚乙二醇的数均分子量为800—4000，优选2000—4000。
聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料(Au-PEG-ACH11)的制备方法，按照下述步骤进行：
将表面氨基化的金浸在PEG-ACH11溶液中进行反应，以得到聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料(记为Au-PEG-ACH11)，其中：
表面氨基化的金采用如下方法进行制备：在惰性保护气氛下(氮气、氦气、氩气)，将金基材浸于2-氨基乙硫醇的水溶液进行反应，以得到表面氨基化的金(记为Au-NH2)，其中反应温度为20—30℃，反应时间为6—12h，2-氨基乙硫醇的浓度为10—50mg/mL，反应结束后使用去离子水、无水乙醇清洗3遍并真空干燥6h，得到产物。
在表面氨基化的金浸在PEG-ACH11溶液中进行反应时，反应温度为15—30℃，反应时间为1—6小时，优选反应温度为20—30℃，反应时间为4—6小时。
PEG-ACH11溶液为PEG-ACH11作为溶质，溶剂为DMSO和0.01M PBS水溶液的混合溶液，其中DMSO和0.01M PBS水溶液的体积比为1：(1—5)，PEG-ACH11的浓度为0.5-5.0mg/mL。
PEG-ACH11按照下述步骤进行制备：将CGG-ACH11溶液滴入到OPSS-PEG-NHS溶液中并持续搅拌，密闭静置后进行透析，再将透析液冷冻干燥得到，CGG-ACH11的氨基酸序列为CGG-LTFPRIVFVLG，OPSS-PEG-NHS为(邻二硫吡啶)-聚乙二醇-(N-羟基丁二酰亚胺)，即CGG-ACH11中CGG与OPSS-PEG-NHS中NHS反应，以使ACH11与PEG相连，其中：
滴入速度为10—15s一滴(1ml)，搅拌速度为每分钟100—200转，密封静置10—15h，移入截留分子量(数均)为3000的透析袋中，透析2天(每天24小时)后，将透析液冷冻干燥。
在CGG-ACH11溶液中，以甲醇为溶剂，CGG-ACH11的浓度为0.5-5.5mg/mL，优选1—4mg/mL。
在OPSS-PEG-NHS溶液中，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，OPSS-PEG-NHS的浓度为2.0-6.0mg/mL。
在将CGG-ACH11溶液滴入到OPSS-PEG-NHS溶液中时，两种溶液为等体积比。
在将表面氨基化的金浸在PEG-ACH11溶液中进行反应时，金表面氨基和PEG-ACH11中OPSS反应，以使PEG和PEG另一端的ACH11接枝到金表面。
聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料(Au-PEG+Au-ACH11)的制备方法，按照下述方式之一进行：
直接制备方法：选择将金浸到聚乙二醇和抗凝血多肽的PBS水溶液中进行反应，反应温度为20—30摄氏度，反应时间为1—6小时，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂(提供反应氛围体系)，聚乙二醇为端基分别为甲氧基和巯基的聚乙二醇，抗凝血多肽为CGG-ACH11多肽，两者通过金硫键直接连接在金表面，依靠巯基和金表面之间形成金硫键完成；
间接制备方法：首先对金表面功能化得到表面氨基化的金，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂(提供反应氛围体系)，利用金表面的氨基与PEG封端官能团反应，依靠酰胺键将PEG连接到金表面，再将抗凝血多肽(一端的CGG基团中半胱氨酸提供巯基)和金表面进行连接，依靠金硫键进行连接，两步反应的反应温度为20—30摄氏度，反应时间为1—6小时。
聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料(Au-ACH11-PEG)的制备方法，按照下述步骤进行：
选择将金浸到抗凝血多肽的PBS水溶液中进行反应，反应温度为20—30摄氏度，反应时间为1—6小时，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂(提供反应氛围体系)，CGG-ACH11多肽序列中半胱氨酸的巯基和金形成金硫键，通过两个甘氨酸(GG)与ACH11相连；加入氨基封端PEG，与连接到金表面的抗凝血多肽另一端的羧基与反应，通过酰胺键将PEG连接到抗凝血多肽的另一端。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明改性的材料表面水接触角明显减小，表现出优异的亲水性能；(2)本发明改性的材料能够抑制凝血因子X的激活；(3)本发明改性的材料能够抵抗血小板的粘附和激活。
附图说明
图1为本发明实施例中聚乙二醇和/或抗凝血多肽表面修饰Au材料的制备方法示意图。
图2为不同表面修饰Au材料的光电子能谱图(XPS)，其中：A为Au的XPS谱图；B为Au-NH2的XPS谱图；C为的Au-PEG的XPS谱图；D为Au-ACH11的XPS谱图，E为Au-PEG-ACH11的XPS谱图。
图3为实施例1聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料水接触角测定结果示意图。
图4为实施例2聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料水接触角测定结果示意图。
图5为实施例3聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料水接触角测定结果示意图。
图6为本发明实施例2聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料表面凝血因子Ⅹ的激活情况测试结果示意图，1为血浆；2为Au；3为Au-PEG；4为Au-ACH11；5为Au-PEG-ACH11。
图7为本发明实施例3聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料表面凝血因子Ⅹ的激活情况测试结果示意图，1为血浆；2为Au；3为Au-PEG；4为Au-ACH11；5为Au-PEG-ACH11。
图8为本发明实施例1聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料表面血小板的粘附和激活情况照片。
图9为本发明实施例3聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料表面血小板的粘附和激活情况照片。
图10为本发明中OPSS-PEG-NHS的核磁共振谱图。
图11为本发明中CGG-ACH11的核磁共振谱图。
图12为本发明中PEG-ACH11的核磁共振谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。金基材(片)购于北京晶川电子技术发展有限公司；OPSS-PEG-NHS购于北京键凯科技有限公司；CGG-ACH11多肽序列为CGG-LTFPRIVFVLG(即在ACH11的11个氨基酸前端设计CGG三个氨基酸，半胱氨酸、甘氨酸、甘氨酸，再接上LTFPRIVFVLG的氨基酸序列，形成十四个氨基酸酰胺键相连的结构)。
OPSS-PEG-NHS的化学式如下：
2-氨基乙硫醇的化学式如下：
CGG-ACH11的化学式如下：
实施例1
首先对金基材进行处理—将直径10mm、厚度2mm、经表面抛光处理的金基材，在乙醇中超声处理5min后，置于过氧化氢和硫酸的混合溶液中，浸渍处理10min，然后用沸水清洗干净，备用；其中过氧化氢为过氧化氢质量百分数15％的水溶液，硫酸为浓度3mol/L的硫酸水溶液，过氧化氢和硫酸的体积比为3:7；以甲醇为溶剂，配制浓度为0.5mg/mL的CGG-ACH11溶液，CGG-ACH11的氨基酸序列为CGG-LTFPRIVFVLG。
其次，配制浓度为2.0mg/mL OPSS-PEG-NHS溶液，溶剂为DMSO和0.01M PBS水溶液的混合溶液，两者体积比为1:1，DMSO为二甲基亚砜的简称，OPSS-PEG-NHS为(邻二硫吡啶)-聚乙二醇-(N-羟基丁二酰亚胺)的简称(即PEG两端连接官能团结构)，数均相对分子质量为2294Da。
第三，制备PEG-ACH11产物，将浓度为0.5mg/mL的CGG-ACH11溶液滴入2.0mg/mLOPSS-PEG-NHS溶液中并持续搅拌(滴入速度为10s一滴，搅拌速度为每分钟100—200转)，密封、静置10h，移入截留分子量为3000的透析袋中，透析2天(每天24小时)，透析液冷冻干燥得到；浓度为0.5mg/mL的CGG-ACH11溶液与2.0mg/mLOPSS-PEG-NHS溶液的体积比为1：1，在2.0mg/mL OPSS-PEG-NHS溶液中，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，溶质为OPSS-PEG-NHS—(邻二硫吡啶)-聚乙二醇-(N-羟基丁二酰亚胺)的简称，数均相对分子质量为2294Da。
最后，将制备的PEG-ACH11产物作为溶质，溶剂为DMSO和0.01M PBS水溶液的混合溶液，两者体积比为1:1，配制浓度为0.5mg/mLPEG-ACH11溶液。
(1)Au-ACH11产物的制备
在氮气气氛下，将金基材干燥后浸于浓度为0.5mg/mL的CGG-ACH11溶液中，15℃反应12h，得到Au-ACH11产物(即金硫配位，以使金和ACH11连接)。
(2)Au-NH2产物的制备
在氮气气氛下，将金基材干燥后浸于10mg/mL AET水溶液，30℃反应12h后，用去离子水、无水乙醇清洗3遍并真空干燥6h，得到Au-NH2产物，AET为2-氨基乙硫醇的简称，即金表面氨基化。
(3)Au-PEG产物的制备
将(2)制备的Au-NH2产物浸于浓度为2.0mg/mL OPSS-PEG-NHS溶液中，在25℃反应4h，得到Au-PEG产物(即金表面氨基和PEG一端的OPSS反应，以使整个PEG和PEG另一端的NHS集团都接枝到金表面)。
(4)Au-PEG-ACH11产物的制备
将(2)制备的Au-NH2产物浸于浓度为0.5mg/mL PEG-ACH11溶液中，在20℃反应4h，得到Au-PEG-ACH11产物。
对制备的产物即原料金进行表征，XPS结果如图2所示，不同材料表面化学成分含量分析详见下表，在金表面接上不同集团之后，相应元素及其比例均发生变化，得以印证四种产物的成功制备。
再以核磁共振对OPSS-PEG-NHS、CGG-ACH11和PEG-ACH11进行核磁共振测试，如附图10—12所示，(1)OPSS-PEG-NHS的核磁图，其特征峰为：OPSS—10.54ppm，8.44ppm，7.82ppm和7.23ppm，PEG—3.51ppm，NHS—2.58ppm；(2)CGG-ACH11的核磁图，特征峰为：氨基酸残基中的苯基和甲基：7.19ppm和0.83ppm(i对应氨基酸侧链中苯基，h对应氨基酸侧链中甲基)；(3)PEG-ACH11的核磁图，消失峰：OPSS，即10.54ppm，8.44ppm，7.82ppm和7.23ppm消失，新出现的峰：氨基酸残基中的甲基，即0.83ppm，说明PEG-ACH11制备成功(PEG中峰为j，氨基酸中峰为k)。
根据上述实施例的步骤和工艺参数进行调整，分别进行实施例2和3中四种物质的制备。
实施例2
(1)将直径10mm、厚度2mm、经表面抛光处理的金基材，在EtOH中超声10min后，于溶液1中浸渍处理20min，然后用沸水清洗干净。所述EtOH为乙醇的简称；所述溶液1为H2O2(10％)和H2SO4(2M)的混合溶液，体积比为4:6；
(2)以MeOH为溶剂，配制浓度为2.0mg/mL的CGG-ACH11溶液，得到溶液2。所述MeOH为甲醇的简称；所述CGG-ACH11的氨基酸序列为CGG-LTFPRIVFVLG；
(3)在氮气气氛下，将步骤(1)的产物干燥后浸于溶液2中，20℃反应24h，得到Au-ACH11产物。
(4)在氮气气氛下，将步骤(1)的产物干燥后浸于30mg/mL AET溶液，30℃反应24h后，用去离子水、无水乙醇清洗3遍并真空干燥12h，得到Au-NH2产物。所述AET溶液为2-氨基乙硫醇的简称；
(5)以溶液3为溶剂，配制浓度为4.0mg/mLOPSS-PEG-NHS，得到溶液4。所述溶液3为DMSO和0.01mol/L PBS水溶液的混合溶液，体积比为1:3；所述DMSO为二甲基亚砜的简称；所述OPSS-PEG-NHS为(邻二硫吡啶)-聚乙二醇-(N-羟基丁二酰亚胺)的简称；数均相对分子质量为2294Da；
(6)将步骤(4)的产物浸于溶液4中，30℃反应10h，得到Au-PEG产物。
(7)以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制浓度为5.0mg/mL的OPSS-PEG-NHS溶液，得到溶液5。
(8)将溶液2以20s一滴的速度滴入搅拌的溶液5中，密封、静置8h，移入截留分子量为3000的透析袋中，透析2天，透析液冷冻干燥得到PEG-ACH11产物。所述溶液2与溶液5的体积比为1:4；
(9)以溶液3为溶剂，配制浓度为3.0mg/mLPEG-ACH11溶液，得到溶液5。
(10)将步骤(4)的产物浸没于溶液5，制备得到Au-PEG-ACH11产物。
实施例3
(1)将直径10mm、厚度2mm、经表面抛光处理的金基材，在乙醇中超声15min后，于溶液1中浸渍处理30min，然后用沸水清洗干净。所述溶液1为H2O2(20％)和H2SO4(5M)的混合溶液，体积比为3:7；
(2)以MeOH为溶剂，配制浓度为1.5mg/mL的CGG-ACH11，得到溶液2。所述MeOH为甲醇的简称；所述CGG-ACH11的氨基酸序列为CGG-LTFPRIVFVLG；
(3)在氮气气氛下，将步骤(1)的产物干燥后浸于溶液2中，30℃反应48h，得到Au-ACH11产物。
(4)在氮气气氛下，将步骤(1)的产物干燥后浸于50mg/mLAET溶液，30℃反应48h后，用去离子水、无水乙醇清洗3遍并真空干燥12h，得到Au-NH2产物。所述AET溶液为2-氨基乙硫醇的简称；
(5)以溶液3为溶剂，配制浓度为3.0mg/mL OPSS-PEG-NHS溶液，得到溶液4。所述溶液3为DMSO和0.01mol/L PBS水溶液的混合溶液，体积比为1：1；所述DMSO为二甲基亚砜的简称；所述OPSS-PEG-NHS为(邻二硫吡啶)-聚乙二醇-(N-羟基丁二酰亚胺)的简称，数均相对分子质量为2294Da；
(6)将步骤(4)的产物浸于溶液4中，30℃反应4h，得到Au-PEG产物。
(7)以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制浓度为3.0mg/mL的OPSS-PEG-NHS溶液，得到溶液5。
(8)将溶液2以10s一滴的速度滴入搅拌的溶液5中，密封、静置10h，移入截留分子量为3000的透析袋中，透析3天，透析液冷冻干燥得到PEG-ACH11产物。所述溶液2与溶液5的体积比为1：2；
(9)以溶液3为溶剂，配制浓度为3.7mg/mLPEG-ACH11溶液，得到溶液5。
(10)将步骤(4)的产物浸没于溶液5，制备得到Au-PEG-ACH11产物。
实施例4
利用水接触角实验来评价聚乙二醇和抗凝血多肽修饰的金材料表面的亲水性。本测试采用液滴法，使用接触角仪测定改性材料表面的静态水接触角。
分析结果：图3、图4和图5为材料表面水接触角结果，分别测定了实施例1、实施例2和实施例3得到的不同材料表面的水接触角。
经聚乙二醇和抗凝血多肽修饰的Au材料表面的水接触角(66.2度(实施例1))、70.2度(实施例2)及69.4度(实施例3)小于Au材料表面(75.8度(实施例1))、74.4度(实施例2)及74.0度(实施例3)的水接触角，这说明Au-PEG-ACH11改性材料具有更优的亲水性，这意味着该类改性方法可能使生物材料表面具有更好的生物相容性。
实施例5
利用酶联免疫反应(ELISA)来定量检测聚乙二醇和抗凝血多肽修饰的Au材料表面凝血因子X的激活含量，进而评价其对提高材料表面的抗凝血性能。
实验步骤如下：在不同Au材料与100μL贫血小板血浆孵育不同的时间后，吸取20μL血浆稀释至100μL，加至酶标板各孔中，覆盖板贴，37℃孵育2h。弃去液体后甩干，每孔加入100μL生物素标记抗体工作液，覆盖板贴，37℃孵育1h。然后弃去孔内液体，甩干，用洗涤工作液洗板3次。每次用200μL洗液并浸泡2min，甩干。然后每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记亲和素工作液,覆盖板贴，37℃孵育1h。再次弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次用200μL洗液并浸泡2min，甩干。依序每孔加90μL底物溶液，37℃避光显色20min。依序每孔加50μL终止液，终止反应。在反应终止后5min内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度值。标准液也按照上述步骤同时进行测定。利用Curve Expert软件绘制标准曲线，然后根据测定的样本光密度值，由标准曲线查出相应浓度，最后乘以倍数5得到改性Au材料表面活化凝血因子X的实际浓度。
分析结果：图6为实施例2中不同材料表面凝血因子X的激活含量，图7为实施例3中不同材料表面凝血因子X的激活含量。
在材料与贫血小板血浆孵育不同的时间后，与Au相比，Au-ACH11和Au-PEG-ACH11表面凝血因子Ⅹ的激活量都有明显减少，均有显著性差异。尤其在孵育15min后，接枝PEG-ACH11后，活化的凝血因子X含量减少至Au组的72.1％(实施例2)和83.8％(实施例3)。这说明了ACH11对凝血因子Ⅹ激活的抑制作用，证明这些材料具有良好的抗凝血效果。
实施例6
利用扫描电镜来评价聚乙二醇和抗凝血多肽表面修饰Au材料的血小板粘附和激活情况。
步骤如下：将材料放入24孔板中，浸润2h。然后抽取5mL新鲜全血，在3500rpm的转速下离心10min后，在每孔中加入200μL的上清液，37℃下培养2h。用pH＝7.4的PBS清洗材料3次、2.5％戊二醛的PBS磷酸缓冲液浸渍固定2h。再次用PBS清洗3次，然后梯度酒精逐级脱水(50％、60％、70％、80％、90％、100％)，每次浸渍30min。通风橱干燥，喷金后扫描电镜观察材料表面粘附的血小板形貌。
分析结果：图8为实施例1中材料表面粘附的血小板SEM图像，图9为实施例3中材料表面粘附的血小板SEM图像。
在Au表面，血小板粘附数量较多，且部分血小板呈现树枝状和煎蛋状，甚至有个别血小板伴随着血小板内容物铺展于材料底部，表现为高度聚集和激活状态。而表面分别接枝PEG和ACH11后血小板密度明显降低，且在高倍镜下看到，粘附的血小板大部分呈圆球状，只有少量的呈现煎蛋状，而且彼此之间保持独立。此外，表面接枝PEG-ACH11后，只有极少量的血小板粘附在其上，且几乎都保持完整的球形。说明PEG和ACH11对材料的共同修饰有效抑制了血小板的粘附和激活。即本发明的聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料在制备抗凝血物质中的应用，即抑制凝血因子Ⅹ激活、对血小板的粘附和激活的抑制作用。
实施例7—聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料(Au-PEG+Au-ACH11)
(1)选择将金浸到聚乙二醇和抗凝血多肽的PBS水溶液中进行反应，反应温度为30摄氏度，反应时间为6小时，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，提供反应氛围体系，聚乙二醇为端基分别为甲氧基和巯基的聚乙二醇，抗凝血多肽为CGG-ACH11多肽，两者通过金硫键直接连接在金表面，依靠巯基和金表面之间形成金硫键完成
(2)在氮气气氛下，将金基材干燥后浸于10mg/mL AET水溶液，30℃反应12h后，用去离子水、无水乙醇清洗3遍并真空干燥6h，得到Au-NH2产物，AET为2-氨基乙硫醇的简称，即金表面氨基化。以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，提供反应氛围体系，利用金表面的氨基与PEG封端官能团反应，依靠酰胺键将PEG连接到金表面，反应温度为25摄氏度，反应时间为6小时；清洗干燥后，将抗凝血多肽(一端的CGG基团中半胱氨酸提供巯基)和金表面进行连接，依靠金硫键进行连接，反应温度为25摄氏度，反应时间为6小时。
实施例8—聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料(Au-ACH11-PEG)
选择将金浸到抗凝血多肽的PBS水溶液中进行反应，反应温度为30摄氏度，反应时间为6小时，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，提供反应氛围体系，CGG-ACH11多肽序列中半胱氨酸的巯基和金形成金硫键，通过两个甘氨酸(GG)与ACH11相连；加入氨基封端PEG，与连接到金表面的抗凝血多肽另一端的羧基与反应，通过酰胺键将PEG连接到抗凝血多肽的另一端。
按照实施例测试方法对实施例7、8制备的表面改性金材料进行测试，均表现出与实施例1—3近似的性能。
根据本发明内容进行参数调整，均可实现聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备，且表现出对凝血因子Ⅹ激活的抑制作用和对血小板的粘附和激活的抑制作用。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料，其特征在于，以金为基材，将聚乙二醇和抗凝血多肽连接到金表面，抗凝血多肽为ACH11多肽，序列为LTFPRIVFVLG，聚乙二醇的数均分子量为800—4000，优选2000—4000，与ACH11连接。
2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料，其特征在于，以金为基材，将聚乙二醇和抗凝血多肽连接到金表面时，具体来说：
(1)在金表面依次连接PEG和抗凝血多肽，即在金表面先连接PEG，再连接抗凝血多肽，在金和PEG之间为酰胺键连接，抗凝血多肽为ACH11，PEG和抗凝血多肽之间通过二硫键、—CH2CH NH2CO—和两个甘氨酸，与ACH11连接；
(2)在金表面依次连接抗凝血多肽和PEG，即在金表面先连接抗凝血多肽，再连接PEG，抗凝血多肽为ACH11，金和抗凝血多肽之间通过金硫键连接，抗凝血多肽为ACH11，CGG-ACH11多肽序列中半胱氨酸的巯基和金形成金硫键，通过两个甘氨酸(GG)与ACH11相连；利用抗凝血多肽另一端的羧基与氨基封端PEG反应，通过酰胺键将PEG连接到抗凝血多肽的另一端；
(3)在金表面连接PEG和抗凝血多肽，即PEG和抗凝血多肽分别连接到金表面。
3.一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
将表面氨基化的金浸在PEG-ACH11溶液中进行反应，金表面氨基和PEG-ACH11中OPSS反应，以使PEG和PEG另一端的ACH11接枝到金表面，以得到聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料，其中：在表面氨基化的金浸在PEG-ACH11溶液中进行反应时，反应温度为15—30℃，反应时间为1—6小时，优选反应温度为20—30℃，反应时间为4—6小时；PEG-ACH11溶液为PEG-ACH11作为溶质，溶剂为DMSO和0.01M PBS水溶液的混合溶液，其中DMSO和0.01M PBS水溶液的体积比为1：(1—5)，PEG-ACH11的浓度为0.5-5.0mg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备方法，其特征在于，PEG-ACH11按照下述步骤进行制备：将CGG-ACH11溶液滴入到OPSS-PEG-NHS溶液中并持续搅拌，密闭静置后进行透析，再将透析液冷冻干燥得到，CGG-ACH11的氨基酸序列为CGG-LTFPRIVFVLG，OPSS-PEG-NHS为(邻二硫吡啶)-聚乙二醇-(N-羟基丁二酰亚胺)，即CGG-ACH11中CGG与OPSS-PEG-NHS中NHS反应，以使ACH11与PEG相连。
5.根据权利要求4所述的一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备方法，其特征在于，在CGG-ACH11溶液中，以甲醇为溶剂，CGG-ACH11的浓度为0.5-5.5mg/mL，优选1—4mg/mL；在OPSS-PEG-NHS溶液中，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，OPSS-PEG-NHS的浓度为2.0-6.0mg/mL；在将CGG-ACH11溶液滴入到OPSS-PEG-NHS溶液中时，两种溶液为等体积比，滴入速度为10—15s一滴(1ml)，搅拌速度为每分钟100—200转，密封静置10—15h，移入截留分子量(数均)为3000的透析袋中，透析2天(每天24小时)后，将透析液冷冻干燥。
6.根据权利要求3所述的一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备方法，其特征在于，表面氨基化的金采用如下方法进行制备：在惰性保护气氛下，将金基材浸于2-氨基乙硫醇的水溶液进行反应，以得到表面氨基化的金，其中反应温度为20—30℃，反应时间为6—12h，2-氨基乙硫醇的浓度为10—50mg/mL，反应结束后使用去离子水、无水乙醇清洗并真空干燥。
7.一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：选择将金浸到抗凝血多肽的PBS水溶液中进行反应，反应温度为20—30摄氏度，反应时间为1—6小时，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，提供反应氛围体系，CGG-ACH11多肽序列中半胱氨酸的巯基和金形成金硫键，通过两个甘氨酸与ACH11相连；加入氨基封端PEG，与连接到金表面的抗凝血多肽另一端的羧基与反应，通过酰胺键将PEG连接到抗凝血多肽的另一端。
8.一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：选择将金浸到聚乙二醇和抗凝血多肽的PBS水溶液中进行反应，反应温度为20—30摄氏度，反应时间为1—6小时，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，提供反应氛围体系，聚乙二醇为端基分别为甲氧基和巯基的聚乙二醇，抗凝血多肽为CGG-ACH11多肽，两者通过金硫键直接连接在金表面，依靠巯基和金表面之间形成金硫键完成。
9.一种聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
对金表面功能化得到表面功能化的金，以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，提供反应氛围体系，利用金表面的官能团与PEG封端官能团反应，以使PEG连接到金表面，再将抗凝血多肽和金表面进行连接，依靠金硫键进行连接，两步反应的反应温度为20—30摄氏度，反应时间为1—6小时，如利用巯基丙酸或者2-氨基乙硫醇使金表面产生羧基或者氨基，利用巯基丙酸或者2-氨基乙硫醇使金表面产生羧基或者氨基，氨基化的金与甲氧基和NHS活性酯封端的聚乙二醇反应，或者与甲氧基和羧基封端的聚乙二醇反应，依靠酰胺键将PEG连接到金表面。羧基化的金与氨基封端的PEG反应，依靠酰胺键将PEG连接到金表面。
10.如权利要求1或者2所述的聚乙二醇和抗凝血多肽表面改性金材料在提高心血管支架血液相容性方面的应用，或者在制备抗凝血物质中的应用。
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