CN109504616B - 一株原油降解菌及其在石油污染修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一株原油降解菌及其在石油污染修复中的应用，该菌株命名为雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri，经鉴定为雷氏普罗威登斯菌属。该菌株代谢产物包括能够降低油水界面张力的表面活性剂，且在7天内对原油的降解率达到45.6％～55.9％。该菌株可应用于原油污染环境的生物修复，尤其是海洋溢油污染清除。

Description

一株原油降解菌及其在石油污染修复中的应用
技术领域
本发明属于功能微生物筛选、应用技术领域，具体涉及一株原油降解菌及其在石油污染修复中的应用。
背景技术
目前，石油在人类的社会生活中扮演了极其重要的角色。然而，如今石油对海洋的污染却成了海洋遭受的最严重的污染之一，这些污染主要是由石油工业和拆船业废水排放、石油运输船只的清洗、意外事故以及在海上采油引起的。它不仅破坏了滨海风景，还严重危害海洋生物。
现有的溢油处理技术主要包括物理处理法、化学处理法和生物处理法。在诸多方法中，以微生物为主的生物修复法具有高效、经济、无二次污染的特点。其相对化学、物理等修复方法具有更高的生物降解能力和环境兼容性，因而得到了广泛应用，备受各国科学界的关注，具有广阔的研究及发展前景。
在生物修复法所选用的微生物中，能够通过代谢产生表面活性剂的原油降解微生物能够起到更加显著的清除原油效果。因此，筛选具有产表面活性剂特性，能够高效降解原油的微生物是采用生物修复法清除海洋溢油污染研究的基础和重点。
发明内容
本发明提供了一株原油降解菌及其在石油污染修复中的应用，该菌株能够代谢产生可降低油水界面张力的表面活性剂，且具有较高的降解原油能力，可应用于原油污染环境的生物修复，尤其适用于海洋溢油污染清除。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一株原油降解菌，命名为雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri sp.Hong 1Xiao Zong，经鉴定为雷氏普罗威登斯菌属，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号CGMCC No.16545，保藏日期为2018年9月28日，该菌株的存活性经保藏中心于保藏日检测为存活状态。
作为优选，所述原油降解菌代谢产物包括能够降低油水界面张力的表面活性剂。
作为优选，所述原油降解菌在7天内对原油的降解率达到45.6％～55.9％。
本发明还公开了所述原油降解菌在石油污染修复、尤其是在海洋溢油清除中的应用。
作为优选，清除海洋溢油的处理工艺包括以下步骤：
油膜预处理：按溢油量将经亲油改性的粘土颗粒喷洒于溢油油膜表面，利用粘土颗粒与石油形成凝聚体的性质降低油水界面张力，使油膜初步分散；
溢油降解：按溢油量将所述原油降解菌接种于油膜初步分散的溢油区域，待原油降解菌降解原油即可。
作为优选，油膜预处理步骤所述的经亲油改性的粘土颗粒为：CTAB-膨润土颗粒、CTAB-天然土颗粒、Bent-膨润土颗粒、DMSO-高岭土颗粒中的一种或多种；所述CTAB-膨润土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性膨润土，所述CTAB-天然土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性天然土，Bent-膨润土颗粒为壳聚糖改性膨润土，DMSO-高岭土颗粒为二甲基亚砜改性高岭土。
作为优选，所述的经亲油改性的粘土颗粒为Bent-膨润土颗粒，改性方法包括以下步骤：
钠化：将一定量的膨润土与钠化剂混合进行钠化后将钠化膨润土烘干备用；
活化：将钠化膨润土在马弗炉中高温焙烧，将焙烧后的钠化膨润土与一定量的草酸溶液混合，加热搅拌酸化膨润土后，用去离子水将多余的草酸洗净，抽滤后将滤饼烘干，得到活化钠化膨润土；
复合：壳聚糖和草酸溶液按一定比例混合加热搅拌得壳聚糖溶胶；按照一定比例将活化钠化膨润土加入壳聚糖溶胶中，恒温高速搅拌混合负载壳聚糖后，用去离子水洗涤，抽滤后烘干，以相同反应条件重复壳聚糖负载反应数次后，将所得反应液静置冷却，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液，将反应液调节pH至中性，抽滤后烘干制得Bent-膨润土。
作为优选，活化步骤的焙烧温度为110℃～600℃，焙烧时间为4h，优选焙烧温度为250℃。
作为优选，所述的油膜预处理步骤为：将经亲油改性的粘土颗粒与海水混合，配制成1.0～3.0g/L的颗粒物溶液，按溢油量喷洒颗粒物溶液到溢油表层后，在波浪条件下作用4h以上，以初步分散油膜。
作为优选，所述的溢油降解步骤为：将所述原油降解菌接种于富集培养基中，放置在25～30℃恒温振荡器中，以160r/min转速培养1天进行富集得原油降解菌菌液，按溢油量在溢油区域内喷洒原油降解菌菌液即可；所述富集培养基的配方为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，所述富集培养基的溶剂为蒸馏水，培养基的pH值7.0。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：提供了一株原油降解菌及其在石油污染修复中的应用，该菌株能够代谢产生可降低油水界面张力的表面活性剂，且具有较高的降解原油能力，可应用于石油污染环境的生物修复，尤其适用于海洋溢油污染清除。
具体而言：
(1)本发明从青岛红岛海域的海水中筛选得到一株细菌，通过鉴定确定筛选菌株为雷氏普罗威登斯菌属(Providencia rettgeri)。此菌株具有代谢产生表面活性剂的能力和原油降解能力，且在原油降解过程中与改性粘土颗粒配合能够有效促进原油降解，提高原油去除率。该原油降解菌在7天内对原油的降解率达到45.6％～55.9％，具有较高的原油降解率，可应用于石油污染修复，同时由于该原油降解菌的代谢产物中包括能够降低油水界面张力的表面活性剂，可降低漂浮在海水表面油膜与海水的界面张力，使油膜分散，增大原油与降解菌的接触面积，使微生物能够更好的与原油接触，提高原油降解率，因此本发明的原油降解菌尤其适用于清除海洋溢油污染。
(2)本发明的清除海洋溢油的处理工艺，通过油膜预处理步骤利用经亲油改性的粘土颗粒与原油形成凝聚体作用，在较短时间内破坏海洋溢油的大面积油膜，将其分散成具有较大比表面积的凝聚体，进而在原油降解菌与原油接触初期就能够更加充分的接触，微生物可以与预处理所得的原油凝聚体形成新的凝聚体，更容易吸附降解原油，提高原油降解率，同时，这种充分接触的状态为微生物代谢反应提供了充分的碳源，使得微生物代谢活动从初期就较为旺盛，能够产生更多的表面活性剂，进一步降低油水界面张力，与颗粒吸附作用共同促进油膜进一步分散形成具有更大比表面积的凝聚体，从而进一步提高原油降解效率。
附图说明
图1为本发明的菌株的生长曲线；
图2为不同焙烧温度的活化膨润土的XRD图谱；
图3为不同焙烧温度的Bent-膨润土的XRD图谱；
图4为未经处理的膨润土的扫描电镜照片；
图5焙烧温度250℃的Bent-膨润土的扫描电镜照片；
图6为本发明的菌株与不同种类的颗粒物共同作用的原油去除率对比；
图7为对比菌株与不同种类的颗粒物共同作用的原油去除率对比。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明从青岛红岛海域的海水中筛选得到一株细菌，通过鉴定确定筛选菌株为雷氏普罗威登斯菌属(Providencia rettgeri)。该菌株具有代谢产生表面活性剂的能力和原油降解能力，且在原油降解过程中与改性粘土颗粒配合能够有效促进原油降解，提高原油去除率。该菌株命名为雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号CGMCC No.16545，保藏日期为2018年9月28日，该菌株的存活性经保藏中心于保藏日检测为存活状态。
实施例1菌株筛选与鉴定
本发明的原油降解菌株的分离筛选自青岛红岛海域，可采用如下筛选方法取得：
1)富集：取自青岛红岛海域海水经滤膜过滤去除杂质后，加入氯化钠、浸牛肉膏、胰蛋白胨配置成为细菌培养液，所述细菌培养液中各成分的含量为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，溶剂为除杂海水；将细菌培养液置于25～30℃恒温振荡器中，以160r/min转速培养1天进行富集，得富集液；
2)驯化：取2mL步骤1)所得的富集液加入到50mL的原油浓度为10000mg/L驯化培养基中，在步骤1)相同条件下培养7天，完成第一次驯化，取2mL第一次驯化培养的培养液加入到50mL的原油浓度为15000mg/L驯化培养基中，继续培养7天，完成第二次驯化，再取2mL第二次驯化培养基的培养液加入到50mL的原油浓度为20000mg/L驯化培养基中，相同条件下培养7天即驯化完成得驯化培养液；所述驯化培养基以经过灭菌的过滤除杂海水为溶剂，其配方中除原油外其他组分为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L；
3)分离：配制培养基，所述培养基的配方为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，溶剂为蒸馏水；取2mL步骤2)所得驯化培养液加入到50mL培养基中培养1天，取1mL该培养液加入装有9mL蒸馏水的试管中进行梯度稀释，取各梯度稀释液100μL加入盛有牛肉膏蛋白胨固体培养基(向培养基中加入琼脂，添加量为15g/L制得)的培养皿中，进行划线,在30℃恒温培养箱中培养直至有单菌落长出,用已高压蒸汽灭菌的接种环挑出单菌接种于培养基中置于30℃恒温振荡器中，以160r/min转速培养1天进行增殖培养，得单菌株培养液；
4)表面活性剂检查：取一定量的步骤3)所得的单菌株培养液倒入离心管中，置于高速旋转离心机中以10000rpm/min的转速离心5分钟，取上清液即为含细菌代谢产物的发酵液，将8mL未染色和经苏丹红Ⅲ染色后的液体石蜡分别加入装有60mL蒸馏水的直径为9cm的培养皿中，待整个平板形成一层分散均匀的薄膜后，用微量移液器在油膜中心慢慢加入3mL离心所得发酵液，测量排油圈直径，筛选出了一株排油圈为5.59cm的原油降解菌，经测试计算，该菌株的代谢物能将油水界面张力由68.53mN/m降低至13.28mN/m；界面张力的计算方法，参照曹娟等在文献(CRESSWELL H P，PAINTERD J，CAMERON KC.Tillage and watercontent effects on surface soil hydraulic properties and short wave albedo[J].Soil Sci Soc Am J，1993，57：816－824.)中记载的方法；
5)鉴定：使用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)对所得到的单菌株进行基因组DNA提取。使用琼脂糖凝胶电泳对提取得到的细菌基因组DNA进行检测，检测结果在GenBank上与已知的16SrDNA进行BLAST，确定其为雷氏普罗威登斯菌属(Providencia rettgeri)。
由上述方法筛选出的菌株的生长曲线如图1所示，该菌株的代谢产物能将油水界面张力由68.53mN/m降低至13.28mN/m，即其代谢产物中包括能够降低油水界面张力的表面活性剂，可降低水面油膜的界面张力，使油膜分散，增大原油与降解菌的接触面积，增加降解率。
由实施例方法筛选鉴定所得菌株命名为雷氏普罗维登斯菌Providenciarettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.16545，保藏日期为2018年9月28日，该菌株的存活性经保藏中心于保藏日检测为存活状态。
在菌株筛选过程中，除获得雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri sp.Hong 1Xiao Zong外，发明人还从海水中筛选出一株代谢产物的表面活性剂对油水界面张力作用较小的菌株，其排油圈为1.2cm，该菌株经步骤5)的鉴定方法鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为Bacillus-LHF，将该菌株作为雷氏普罗维登斯菌Providenciarettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong的对比菌株。
实施例2降解率测试
实施例2分别测试了实施例1所得的原油降解菌对3种不同油品的原油降解率，3种原油的组分如表1所示：
表1油品组分对比表
Figure GDA0002465333590000081
测试方法如下：将100mL过滤除杂后的海水加入250mL锥形瓶中，在121℃下高温灭菌，将0.1g原油和2mL原油降解菌菌液(实施例1步骤3)所得的单菌株培养液作为原油降解菌菌液)依次加入到灭菌后的装有过滤海水的锥形瓶中，用透气封口膜对锥形瓶封口，放入模拟海洋环境的恒温振荡箱中(设置为温度25～30℃，120r·min-1连续往复振荡)，振荡反应7天后，对所得样品多次萃取，并测定得到处理后的石油含量，结合初始加入油量计算原油清除率，微生物对原油的降解率，计算公式如下：
Figure GDA0002465333590000082
公式中，C0和Ce表示最初加入原油和剩余原油的质量，经测试计算，本发明的原油降解菌雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong对委内瑞拉原油、济北原油和柴油的降解率依次为53.8％、45.6％和55.9％，即该原油降解菌在7天内对原油的降解率达到45.6％～55.9％；用相同方法测试对比菌株Bacillus-LHF的原油降解率，其对委内瑞拉原油、济北原油和柴油的降解率依次为39.2％、30.6％、45.9％，即在7天内对原油的降解率达到30.6％～45.9％，明显低于雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgerisp.Hong 1 Xiao Zong的原油降解率。本发明的原油降解菌具有较高的原油降解率，可应用于石油污染修复，同时由于雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri sp.Hong 1 XiaoZong的代谢产物中包括能够降低油水界面张力的表面活性剂，可降低漂浮在海水表面油膜与海水的界面张力，使油膜分散，增大原油与降解菌的接触面积，使微生物能够更好的与原油接触，提高原油降解率，因此本发明的原油降解菌雷氏普罗维登斯菌Providenciarettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong尤其适用于清除海洋溢油污染。
实施例3
由于海洋溢油污染现场，轻质的原油在海面上形成大面积连续的油膜，直接向油膜表面接种原油降解菌，微生物与原油的接触面较小，使生物降解原油的降解效率较低，尽管本发明的菌株能够代谢产生表面活性剂以降低油水界面张力，在作用一段时间后起到分散油膜的作用，但由于表面活性剂为菌株代谢产物，在该原油降解菌作用于油膜表面初期其含量很低，且微生物与原油的接触面积小，导致微生物代谢所需的碳源有限，其代谢产生表面活性剂也较为缓慢，不能及时分散油膜，因此单独使用本申请的原油降解菌的原油降解效率仍然不够理想，发明人研究发现将对原油具有分散作用的改性的粘土颗粒与本发明的原油降解菌联合使用可以有效提高原油降解菌的原油降解效率，由此提出了一种清除海洋溢油的处理工艺包括以下步骤：
(1)油膜预处理：将经亲油改性的粘土颗粒与海水混合，配制成1.0～3.0g/L的颗粒物溶液，按溢油量喷洒颗粒物溶液到溢油表层后，常温下在波浪作用下等待4h以初步分散油膜，在此过程中颗粒物将原油分散并与之形成凝聚体；
(2)溢油降解：将原油降解菌接种于富集培养基中，放置在25～30℃恒温振荡器中以160r/min转速培养1天进行富集得原油降解菌菌液，按溢油量在溢油区域内喷洒原油降解菌菌液即可；所述富集培养基的配方为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，所述富集培养基的溶剂为蒸馏水，培养基的pH值7.0。
在本发明的处理工艺，通过步骤(1)油膜预处理利用经亲油改性的粘土颗粒对原油的分散作用，能在较短时间内破坏海洋溢油的大面积油膜，将其分散成小块的具有较大比表面积的凝聚体，进而在原油降解菌与原油接触初期就能够更加充分的接触，微生物可以与预处理所得的凝聚体形成新的凝聚体，更容易吸附降解原油，提高原油降解率，同时，这种充分接触的状态为微生物代谢反应提供了充分的碳源，使得微生物代谢活动从初期就较为旺盛，能够产生更多的表面活性剂，进一步降低水油界面张力，与颗粒物作用共同促进油膜进一步分散形成具有更大比表面积的凝聚体，从而进一步提高原油降解效率。
具体的，步骤(1)所述的经亲油改性的粘土颗粒为：CTAB-膨润土颗粒、CTAB-天然土颗粒、Bent-膨润土颗粒、DMSO-高岭土颗粒中的一种或多种。经改性的粘土颗粒相较于原始粘土颗粒具有更好的亲油性，能够更好的分散原油，有利于促进原油油膜的分散和形成凝聚体，在后续微生物降解过程中增大原油降解菌与原油的接触面积，提高微生物降解石油的降解率。
其中，所述DMSO-高岭土颗粒为二甲基亚砜改性高岭土，可由以下方法制得：取一定量的高岭土、DMSO和去离子水，按照高岭土：DMSO：去离子水1:10:1的比例混合均匀，磁力加热搅拌器作为反应装置，70℃水浴加热连续高速搅拌72h，抽滤后产物于70℃下用烘箱烘干24h，密封保存，即制得DMSO改性的有机高岭土，即为DMSO-高岭土。
所述CTAB-天然土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性天然土，可由以下方法制得：将取自黄河口天然土样品与浓度为1mol/L的氯化钠溶液混合，用磁力加热搅拌器常温搅拌12h，搅拌结束后静置分层并弃去上清液，重复操作三次保证天然土充分钠化，用去离子水洗涤，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干得钠化天然土,在烧杯中加入钠化天然土和去离子水，质量比为1:10，然后向混合液中加入1/4钠化天然土质量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，用磁力加热搅拌器在60℃水浴条件下中速搅拌加热2h，静置冷却至室温后，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，证明Br-已除净，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干24h，即制得CTAB改性的有机3#天然土，记为CTAB-天然土。
所述CTAB-膨润土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性膨润土，将一定量的膨润土与浓度为1mol/L的氯化钠溶液混合，用磁力加热搅拌器常温搅拌12h，搅拌结束后静置分层并弃去上清液，重复操作三次保证钙基膨润土充分钠化，用去离子水洗涤，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干得钠化膨润土,在烧杯中加入钠化膨润土和去离子水，质量比为1:10,然后向混合液中加入1/4钠化膨润土质量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，用磁力加热搅拌器在60℃水浴条件下中速搅拌加热2h，静置冷却至室温后，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，证明Br-已除净。抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干24h，即制得CTAB改性的有机膨润土，记为CTAB-膨润土。
所述Bent-膨润土颗粒为壳聚糖改性膨润土，在制备壳聚糖改性膨润土的过程中，可通过对膨润土进行焙烧、酸化的预处理活化膨润土，以增强壳聚糖与膨润土的复合效果，为了优选亲油改性最好的壳聚糖改性膨润土，发明人研究了活化过程中焙烧温度对壳聚糖与膨润土的复合效果的影响。
壳聚糖改性膨润土的改性方法包括以下步骤：
(a)钠化：将一定量的膨润土(形貌如图4所示)与浓度为1mol/L的氯化钠溶液混合，用磁力加热搅拌器常温搅拌12h，搅拌结束后静置分层并弃去上清液，重复操作三次保证钙基膨润土充分钠化，用去离子水洗涤，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干得钠化膨润土；
(b)活化：将一定量的钠化膨润土在马弗炉中焙烧，设置温度分别为110℃、250℃、400℃、600℃，焙烧时间均为4h，将焙烧后的钠化膨润土与一定量的质量分数为10％的草酸溶液混合，在60℃条件下用磁力加热搅拌器搅拌12h，用去离子水将多余的草酸洗净，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干，得到四种不同温度处理的活化钠化膨润土；
(c)复合：按照1g壳聚糖加入50ml质量分数为10％草酸溶液的比例混合原料，50℃混合搅拌2h得壳聚糖溶胶；按照10g活化钠化膨润土加入1g壳聚糖的比例，将钠化高温焙烧膨润土缓慢加到壳聚糖溶胶中，60℃下高速搅拌24h后，完成壳聚糖的第一次负载后用去离子水洗涤，抽滤后于70℃烘干，将烘干的样品按照原比例加到壳聚糖溶胶中，反应条件不变二次负载壳聚糖，反应结束后静置冷却，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液，调节pH至7，抽滤后于70℃烘箱中干燥24h，制得四种Bent-膨润土。
对上述方法中制得的不同温度的四种活化膨润土和最终制得的四种Bent-膨润土进行XRD分析实验，所得XRD图谱分别如图2和图3所示，由图2和图3可以看出步骤(b)的焙烧温度为250℃条件下，膨润土与壳聚糖复合的效果最好，即壳聚糖对膨润土的亲油改性效果最好，改性后的Bent-膨润土能够对石油起到较好的分散去除效果，故优选焙烧温度为250℃的Bent-膨润土(形貌如图5所示)为本发明清除海洋溢油的处理工艺所用的Bent-膨润土。
发明人分别对未经处理的原始膨润土和焙烧温度为250℃的Bent-膨润土进行了BET测试，测得原始膨润土样品的比表面积为26.44m2/g，经活化和负载壳聚糖处理的Bent-膨润土的比表面积为69.39m2/g，通过数据可以得出，250℃焙烧膨润土负载壳聚糖的比表面积明显大于原始膨润土，Bent-膨润土比表面积明显增大，增加了与原油的接触面积，有利于原油分散和形成凝聚体，在后续微生物降解过程中增大原油降解菌与原油的接触面积，提高微生物降解石油的降解率。
实施例4颗粒和微生物联合作用效果测试
为了验证实施例3的清除海洋溢油的处理工艺的作用效果，实施例4模拟了海洋溢油的水油体系，对颗粒和微生物联合作用去除原油的效果进行了测试，测试方法包括以下步骤：
(1)将100mL过滤除杂后的海水加入250mL锥形瓶中，在121℃下高温灭菌，将0.1g经亲油改性的粘土颗粒和0.1g原油加入到灭菌后的装有过滤海水的锥形瓶中，用包裹着铝箔纸的橡胶塞封口，放入模拟海洋环境的恒温振荡箱中(设置温度25～30℃，120r·min-1连续往复振荡)，振荡反应4h后，可观察到颗粒物与原油形成了油-悬浮颗粒物凝聚体；
(2)取2mL的原油降解菌菌液(实施例1步骤(3)所得的单菌株培养液作为原油降解菌菌液)加入步骤(1)的锥形瓶中，同时用透气封口膜代替橡胶塞为微生物提供有氧环境，继续在原有培养条件下振荡反应7天；
(3)完成步骤(2)后停止振荡，静置12小时，分离得到颗粒物样品和液相。对颗粒物样品和液相多次萃取，并测定得到处理后的石油含量，计算得到颗粒物结合原油量，结合初始加入油量计算原油清除率，原油清除率计算公式如下：
Figure GDA0002465333590000141
公式中，C0和Ce表示最初加入原油和剩余原油的质量，C'表示微生物菌体和颗粒物与石油形成凝聚体中未能被石油醚萃取出来的原油质量。经测定计算，本发明的菌株雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong与不同的经亲油改性的粘土颗粒联合作用于不同油品的原油去除率如图6所示，对比菌株Bacillus-LHF与不同的经亲油改性的粘土颗粒联合作用于委内瑞拉原油的原油去除率如图7所示，由图6和图7可以看出本发明的菌株雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong与改性的粘土颗粒配合可以有效提高原油的去除效率，其作用效果明显优于对比菌株，相较于单纯使用微生物清除海洋溢油，实施例3的处理工艺可以更加高效彻底的清除海洋溢油污染。
以上所述，仅是本发明的实施例证而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明的技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 中国石油大学（华东）
<120> 一株原油降解菌及其在石油污染修复中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1042
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaggactga tgcggtaagc gtgtacaact gtcaggcaac cactactggg gaaccacttc 60
cctggggtga cgggcggtgt gacagggccg ggaacgtatt cccgtagcat tctgatccgc 120
attactaacg attccgactt catggagtcg agttgcagac tgcgatccgg actacaacgt 180
actttatgaa ttcctcttgc tctcgcgagg tggcttctct ttgtccctcc attggatgac 240
gtgtgtagcc ctactcataa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt 300
ttatcaccgg cagtctcctt tgagtgccct agcgaatcac tggcagacaa ggatagcggt 360
tgctctcgta gcgggaccta acccaacagt taccaactga cgatgaccac gcccctgctg 420
cgcttgtgtt ctattgccag aagggacaaa tctctctctg tttgcttatc tggatgtgat 480
aagtaagtaa ggttcttctg gttgcatcta attaacccca ttgctcgctt gtttgggcgg 540
ccccccgtca attcatttga gtttcaacct tgcggccgta ctcccgcggg cggttgattt 600
aacgcgttgc tctactaagg cactccggag ggaacaacct ttgatctcct tatttacagg 660
atggactacc aggtatcaag cctgcttgct cccacgcttg tctaaccgac cgtctatttt 720
gtccaggggg ccgccctctc cacctgcatt ccccatatct ctacgcattt caccgctaca 780
caaggaaatc tacctctctc aacagactct agctgaccag tcatacatgt cctacccccg 840
attacagcgc gggggatctt acaatctatc ctaatcaacc acatgcgtgt gatttacacc 900
caataatacc gagtaatgct tgctacctat gtattacgct gctgctggca cgtagtagcc 960
gtgcttcttc agatcaggta cgtcagtcgt cgatatatag catcatcttc ttcctcccga 1020
agaagtattt acaacctgac ag 1042
<210> 2
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccgtaactc tttaggtgct tggttccaaa tgttaaccta cctacttacg gtggtccaac 60
tcccggggtg tgacgggcgg tgtgtacaag ggccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccacgatt actaacgatt cccacttcat ggaggcgagt tgcagactcc aatccggact 180
gagaacgggt ttatgagatt agcttgctct cgcggggttg cttctctttg tatccgccat 240
tgtagcacgt gtgtagccct agtcataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtctcctttg agtgcccgac tgaatgatgg caactaaaaa 360
ccagggttgg cgctcgtggc ggacttaacc caacattttc gaacacaagt gaacaacacc 420
atggcccacc tggtctctgc tccccaagga aaagccctaa tctctggggt gttctaagaa 480
tgtcagaact gggtaaggtc cttcccgttg cttcaaatta aacaacaggc tcaaccgctg 540
gtgcggcccc ccgtcaattc ttttgagttc aacccttgcg gcggtatccc ccaggcggat 600
gatttaaggc gttacctccg aaataaacgg cggaaagcct ctaacttcta atccacatcg 660
tttacagcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca 720
gtgtcagtta ttgaccagaa agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca 780
tttcacgcta cacatggaat tctactctcc tcttctggac tctagttgac cagtttcgat 840
gacccttcca ggttgagccc gtgggatttc acatcagact tatcaacact gcgtgcgctt 900
tacgccaata atcggataac gctgccacta cgtatacgcg ctgctggcac gtagtagcgt 960
gcttctcgta gtacgtcatg gtgcagctat cactagcgct gttcttccga agaacgagtt 1020
acgacctga 1029

Claims (10)

1.一株原油降解菌，其特征在于：命名为雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgerisp.Hong 1 Xiao Zong，经鉴定为雷氏普罗威登斯菌属，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.16545；所述原油降解菌在7天内对原油的降解率达到45.6％～55.9％。
2.根据权利要求1所述的原油降解菌，其特征在于：所述原油降解菌代谢产物包括能够降低油水界面张力的表面活性剂。
3.权利要求1或2所述的原油降解菌在石油污染修复或在海洋溢油清除中的应用。
4.根据权利要求3所述的原油降解菌在石油污染修复中的应用，其特征在于，清除海洋溢油的处理工艺包括以下步骤：
油膜预处理：按溢油量将经亲油改性的粘土颗粒喷洒于溢油油膜表面，利用粘土颗粒与石油形成凝聚体的性质降低油水界面张力，使油膜初步分散；
溢油降解：按溢油量将原油降解菌接种于油膜初步分散的溢油区域，待原油降解菌降解原油即可。
5.根据权利要求4所述的原油降解菌在石油污染修复中的应用，其特征在于，油膜预处理步骤中所述的经亲油改性的粘土颗粒为：CTAB-膨润土颗粒、CTAB-天然土颗粒、Bent-膨润土颗粒、DMSO-高岭土颗粒中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的原油降解菌在石油污染修复中的应用，其特征在于，所述的经亲油改性的粘土颗粒为Bent-膨润土颗粒，改性方法包括以下步骤：
钠化：将膨润土与钠化剂混合进行钠化后，将钠化膨润土烘干备用；
活化：将钠化膨润土在马弗炉中高温焙烧，将焙烧后的钠化膨润土与草酸溶液混合，加热搅拌酸化膨润土后，用去离子水将多余的草酸洗净，抽滤后将滤饼烘干，得到活化钠化膨润土；
复合：壳聚糖和草酸溶液混合加热搅拌得壳聚糖溶胶；将活化钠化膨润土加入壳聚糖溶胶中，恒温高速搅拌混合负载壳聚糖后，用去离子水洗涤，抽滤后烘干，以相同反应条件重复壳聚糖负载反应数次后，将所得反应液静置冷却，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液，将反应液调节pH至中性，抽滤后烘干制得Bent-膨润土。
7.根据权利要求6所述的原油降解菌在石油污染修复中的应用，其特征在于，活化步骤的焙烧温度为110℃～600℃，焙烧时间为4h。
8.根据权利要求4所述的原油降解菌在石油污染修复中的应用，其特征在于，所述的油膜预处理步骤为：将经亲油改性的粘土颗粒与海水混合，配制成1.0～3.0g/L的颗粒物溶液，按溢油量喷洒颗粒物溶液到溢油表层后，在波浪条件下作用4h以上，以初步分散油膜。
9.根据权利要求4所述的原油降解菌在石油污染修复中的应用，其特征在于，所述的溢油降解步骤为：将原油降解菌接种于富集培养基中，放置在25～30℃恒温振荡器中以160r/min转速培养1天,得原油降解菌菌液，按溢油量在溢油区域内喷洒原油降解菌菌液即可；所述富集培养基的配方为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，所述培养基的溶剂为蒸馏水，富集培养基的pH值7.0。
10.根据权利要求7所述的原油降解菌在石油污染修复中的应用，其特征在于，所述焙烧温度为250℃。
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