CN109478492B

CN109478492B - 一种从多电荷粒子的低分辨率质荷比光谱中提取质量信息的方法

Info

Publication number: CN109478492B
Application number: CN201780032160.6A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·伊恩·麦金托什
Original assignee: Microsaic Systems PLC
Current assignee: Microsaic; Microsaic Systems PLC
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: GB201609069D0; WO2017202561A1; JP2019521329A; JP7065039B2; US10297434B2; GB2550591B; US20190103259A1; EP3408862B1; CN109478492A; GB2550591A; EP3408862A1

Abstract

描述了一种从多电荷粒子的低分辨率质荷比光谱内提取质量信息的装置和方法。使用质荷比数据的对数来执行曲线拟合，这减弱了噪声引起的干扰。

Description

一种从多电荷粒子的低分辨率质荷比光谱中提取质量信息的方法

技术领域

本发明涉及质谱分析，尤其涉及一种从多电荷粒子的低分辨率质荷比光谱中提取质量信息的装置和方法。

背景技术

在质谱分析中使用电喷雾电离已经变得司空见惯，特别是其在生物大分子研究中的应用已经非常普遍。因为电喷雾电离允许以完整的形式研究不稳定的粒子，所以虽然有利，但反复充电可导致复杂的质荷比光谱。由于这些光谱是对不同质荷比下的离子数的观察，所以反复充电可导致母体分子呈现多峰，这使得母体质量难以确定。因此，已经开发了多种从这些复谱中获取母体分子质量信息的方法。为了提取母体分子质量信息，需要获取有关于观察到的母体分子的离子的电荷态的知识。使用高分辨率光谱(那些具有同位素分辨率的光谱)，这些电荷态的分配可以很容易的从相邻同位素峰之间的分离中推断出来。在低分辨率质荷比光谱(那些没有同位素分辨率的光谱)中，母体分子质量的提取并不那么简单。

在大分子诸如生物分子的研究中使用低分辨率质谱分析确实具有一定的优势。这些优势来源于能够以降低的成本生产更低分辨率的质谱仪，且更容易实现这种仪器的小型化。这些优势使得低分辨率仪器在在线分析和近线分析上的使用非常有吸引力。因为取样通常来自于一系列很少或没有预备样品的环境，所以为质谱分析的这种使用带来了额外的挑战。其结果是质荷比光谱可能出现噪声，并且可能包含由源自溶剂团簇和样品介质的离子加合物引起的无关峰。因此，在这些情况下，母体分子质量的提取可能非常具有挑战性。特别是，当质荷比光谱具有强烈的无关峰和微弱的信噪比时，依赖峰值拾取(peakpicking)的技术很容易失败。此外，峰值拾取本质上导致质荷比光谱从峰值下降到单个质荷比。因此，峰值拾取技术可能导致肩峰或任何不对称形式的峰的错误表示。其他反卷积方法可能受到背景噪声的强烈影响，导致产生不代表母体分子真实质量的假峰。

便宜和小型化低分辨率仪器在例如在线监测(on-line)和近线监测(at-line)等应用中的使用也存在额外的要求；在这些环境中的使用不可避免的导致了过渡期，从熟练从业者的使用到具有较低技术和质谱分析经验的用户的使用的过渡。因此，任何用于从多种电荷的质荷比光谱中提取母体分子质量的方法，都应该易于使用且需要最少的用户输入。

许多从没有同位素分辨率的质荷比光谱中提取质量信息的方法都已经实施了。这些讨论如下：

Zhang和Marshall在《美国质谱学会学报》(Journal of the American Societyfor Mass Spectrometry)(1998)第9卷第225-233页中描述了一种方法“ZScore”。该方法利用了峰值拾取和基于信号阈值比的对数的计分系统(scoring system)。所述信号阈值比由背景噪声和用户定义的信噪比计算得出。由于这种方法依赖于峰值拾取，因此它存在前述的峰值拾取的缺点。该方法的另一个缺点是，需要用户定义信噪比和质荷比范围来计算背景噪声。尤其是，如果将噪声等级设置在不适当的等级，则可能丢失有用的信息。

Morgner和Robinson在《分析化学》(2012)第84卷第2939-2948页中描述了方法“Massign”。与上述的ZScore方法一样，该方法取决于以两个阈值等级的形式精确地进行峰值拾取和用户输入。此外，分离的差的峰值必须手动识别以包括在计算中。因此，该方法不适合从低质量质荷比光谱中提取母体质量。

在《国际质谱学杂志》(International Journal of Mass Spectrometry)(2010)第290卷第1-8页和《分析化学》(2005)第77卷第111-119页中Maleknia等人描述了一种方法“eCRAM”，该方法利用电荷态中独特的整数比率来计算低分辨率质荷比光谱中的峰值的电荷态。该方法还依赖于清楚的识别待分析的光谱中的峰值。

Winkler在《质谱快速通信》(Rapid Communications in Mass Spectrometry)(2010)第24卷第285-294页中描述了一种方法“ESIprot”，该方法使用在质荷比光谱中观察到的峰值来计算不同电荷态下的物质的质量。通过计算电荷态集来识别正确的电荷态，其中，该电荷态集屈服贝塞尔校正的最低标准偏差。该方法的运用还依赖于清楚地识别质谱中有利的峰值的能力。在该方法中识别和使用的任何峰值都来自一连串多种带电离子的假设，也是该方法的严重限制。

Mann等人在《分析化学》(1989)第61卷第1702-1708页中描述了两种方法，该方法在美国专利US5130538中也进行了描述。第一种方法是平均算法，该方法使用相对峰值位置来推断电荷态并计算母体分子的质量。该方法依赖于峰值拾取，并且可能受到噪声和无关峰的强烈影响。在《分析化学》和美国专利US5130538这两者中描述的第二种方法是反卷积算法。该方法使用转换函数来求取母体分子质量的试验值。该转换函数根据质荷比光谱中的离子数的分布函数来计算。这种反卷积方法得益于不依赖峰值拾取，但正如这两种方法在两个参考文献中所证明的那样，受到了背景噪声的强烈影响。这可能导致母体分子质量以倍数或分数的形式在反卷积光谱中出现错误结果。在反卷积光谱中，背景噪声随着质量而增加是该方法的另一个不希望的产物。

一种利用反卷积算法的方法也在《分析化学》(1994)第66卷第1877-1842页和美国专利US5352891中描述。与上述Mann算法不同的是，离子数相乘，而不是相加，来形成乘法相关算法。该方法的这种变化降低了背景噪声的影响和假峰的引入。然而，由于等于零的单个离子数或异常高的离子数的存在，这种乘法的方法可能会非常不利。在计算中包含这种零离子数，将导致反卷积光谱中的信号的完全抑制。类似地，包含单个大离子数(例如由加合离子或噪声引起的)可能过度影响反卷积光谱中的信号。

由于增加了对假峰的辨别，前向工作最大熵方法是有利的，该方法首先由Reinhold等人在《美国质谱学会学报》(1992)第3卷第207-215页中描述。然而，该方法可能计算昂贵，且对于母体分子质量的有效提取需要大量的关于质荷比光谱的相对强度和峰形的先验知识。

需要一种稳健的方法，该方法可以从质量差的低分辨率质荷比光谱中提取多电荷的母体分子的质量，也就是那些没有同位素分辨率、低信噪比和含有无关加合峰的光谱。此外，该方法受到背景噪声和易于产生假峰的强烈影响，不应该依赖于使用峰值拾取技术。该方法还应该要求最少的用户输入和先验知识；从而允许不是质谱专家的用户成功实施该方法。

发明内容

根据本教导，从多电荷粒子的低分辨率质荷比光谱中提取质量信息的方法和装置，可以解决这些和其他问题。

本教导的一方面提供了一种方法，该方法涉及多原子母体分子的初始电离以产生母体分子的多电荷离子群。对于每个离子，其电荷数定义了该离子的电荷态，并且每个电荷态包括离子群内的子群。分析这些子群来产生质荷比光谱；每个质荷比的强度是每个电荷态群的直接表示。

在产生质荷比光谱之后，本教导可以采用预处理步骤来减少任意噪声，并将获得的质荷比光谱的基线减小到零。预处理之后，使用以下函数将质荷比光谱转换为新表示的光谱：

其中X是质荷比光谱的新表示，I相当于预处理后的输入质荷比光谱中的强度，S是I的平均中心化表示(mean centred representation)。所述质荷比光谱的新表示可以被转换以生成带有所有零电荷的粒子的质谱。同样可以理解的是，生成带有所有单电荷粒子的质荷比光谱可以达到相同的效果。

虽然不打算将本教导限制为零电荷示例，但是为了帮助理解本教导，零电荷态的表示将用于详细描述并且使用以下函数计算：

对于在预定范围内的M的不同试验值，将信号增强的质荷比光谱(X)的值相加到最大的电荷态n′_max’。通过迭代最大的电荷态n′_max的不同的值，F(M，n′_max)的值被优化以防止过渡拟合，并防止零电荷质谱中假峰的出现。

用于求值单电荷的质谱的函数可以从上述零电荷函数中导出，并用于识别单电荷的质量值的范围。单电荷态的表示可以使用以下函数计算：

上述等式可以进一步使用以下函数概括：

可以理解的是，上述零电荷函数可以通过在一般函数中将z等于0来获得，而用于单电荷态表示的上述函数可以通过在一般函数中将z等于1来获得。

零电荷态表示是最常使用的，并且为了清楚起见将贯穿详细描述使用。在单电荷表示中，还考虑了加合物离子的质量。当需要与ESI-MS实验的单电荷粒子的未处理的质荷比光谱直接进行比较时，该表示是有用的。

这种方法有利地分析了完整的质荷比光谱，并且以这种方式对所有部分进行相同处理，因此该方法不依赖于峰值拾取方法和噪声级的先验知识。转换后的质荷比光谱的使用可以防止背景噪声过度影响输出，这是现有技术中其他方法所见到的现象。因此，该方法允许从低质量和嘈杂的质荷比光谱中以最少的用户输入和先验知识有效提取母体分子质量。因此，本教导的第一方面提供了一种用于从多电荷粒子的低分辨率质荷比光谱中提取质量信息的方法，以识别多电荷粒子中的多原子的母体分子的质量，该方法包括步骤：

从质谱仪接收显示多电荷离子群的数据集，每个离子上的电荷数定义了该离子的电荷态，每个电荷态包括离子群内的离子子群；

使用表明多电荷离子群的数据集来生成一个输入质荷比光谱，每个电荷态的子群由质荷比光谱中的强度表示；

处理输入质荷比光谱以提供信号增强的质荷比光谱，所述信号增强的质荷比光谱从所述质荷比光谱的商的对数和该质荷比光谱的平滑表示(smoothed representation)中生成；

使用定义的电荷质谱来识别定义的电荷质量值的范围，在该范围内搜索多原子母体分子的质量；

使用以下函数对定义的电荷质量值范围内的每个质量生成总和，该总和等于在信号增强的质荷比光谱中值的相加，对应于在连续电荷态下直到最大电荷态的质量：

其中，M是所述定义的电荷质量值的范围内的任一定义的质量，m_a是带电荷加合物的质量；z是定义的带电荷质谱的级数，X是信号增强的质荷比光谱的分布函数；并

使用所述总和的值来确定多原子母体分子的质量。

在本教导的进一步发展中，使用所述总和的值来确定多原子母体分子的质量，包括在所述总和范围内标准化所述总和的值，以确定母体分子的质量。

在本教导的进一步发展中，带电荷加合物的质量m_a设定为等于1，表示质子质量。

在本教导的进一步发展中，信号增强的质荷比光谱由以下函数产生：

等式1

其中，X表示信号增强的质荷比光谱，I相当于输入质荷比光谱的强度，S是输入质荷比光谱的平滑表示。

在本教导的进一步发展中，对于定义的带电质量值的定义范围内的任一质量，该方法进一步包括：

计算直到最大电荷态的不同值的总和；

使用所述直到最大电荷态的不同值的总和的值以确定母体分子的分子质量。

在本教导的进一步发展中，该方法还包括在形成信号增强的质荷比光谱之前对输入质荷比光谱进行光谱预处理。

在本教导的进一步发展中，光谱预处理选自平滑和/或基线减法中的至少一个。

在本教导的进一步发展中，所述多电荷粒子通过电喷雾电离产生。

在本教导的进一步发展中，该方法还包括在质谱仪源内电离多原子母体分子，以产生输入质荷比光谱。

在本教导的进一步发展中，所述定义的电荷质谱是零电荷质谱，该质谱具有所有识别的零电荷值的粒子。

在本教导的进一步发展中，所述定义的电荷质谱是用于识别单电荷质量值的范围的单电荷质谱。

根据本发明的第二方面，提供了一种质谱仪，包括电喷雾电离源和检测器，所述检测器配置成生成输出，该输出表明了由电离源生成的多电荷离子群，每个离子上的电荷数定义了该离子的电荷态，每个电荷态包括所述离子群内的离子子群，该质谱仪还包括配置成执行上述方法的处理器。

本教导的这些和其他方面将参考以下附图来描述，这些附图被提供以帮助理解本教导，但不应被解释为以任何方式进行限制。

附图说明

图1是本教导的第一方面中使用的处理步骤的流程图；

图2是在牛血清白蛋白的质荷比光谱进行图1中的步骤102的实施例；

图3是图1中的步骤103产生信号增强的质荷比光谱的实施例；

图4是在图2呈现的质荷比光谱上使用通常参考图1描述的技术产生零电荷光谱的示例；

图5是根据本教导的第二方面在图1中的方法的修正中使用的步骤的流程图；

图6是对图2中呈现的数据使用图5的方法生成零电荷光谱的示例；

图7是在图1的方法的另一修正中使用的步骤的流程图；

图8是信噪比非常差的牛血清白蛋白的质荷比光谱；

图9是对图8中的数据进行步骤702的实施例；

图10示出了对图9中的平滑数据进行步骤703的实施例；

图11是对图10中的数据进行步骤704的实施例；

图12示出了对图11中的数据进行步骤705的实施例；

图13是对图8中呈现的数据使用图7的方法生成零电荷光谱的示例；

图14是计算机处理设备的一个示例，该计算机处理设备可以在本教导的上下文中使用以图1,5或7中的任何一种方法实施；

图15是识别三种电荷峰值的理想化质谱的示例；

图16A和图16B示出了求和技术在计算图15中的数据的一系列电荷质量值时的效果；

图17是使用图15的平均中心化数据集的对数来产生信号增强的质荷比光谱的应用效果的示例；

图18A和图18B示出了使用图17的信号增强的质荷比光谱的转换计算一系列电荷质量值的效果；

图19示出了与图15相似的、添加了单一杂质的光谱；

图20A示出了一种使用简单噪声减法对图19的数据进行处理的效果；

图20B示出了利用商和对数函数对图19的数据进行处理的效果。

具体实施方式

图1示出了一种根据本教导从低分辨率质荷比光谱中提取质量信息的方法的流程图。

在步骤101中，使用常规质谱技术测量质谱，并该质谱以质荷比光谱的形式存储。如本领域普通技术人员所理解的，这种技术允许母体分子的不同电荷态的子群表示为不同质荷比下的离子数。

步骤102中，对数据采用平滑算法(smoothing techniques)来表示输入的质荷比光谱的趋势。平滑算法的类型可以改变，例如，平滑算法可以使用居中的移动平均线(centred moving average)来有效平均中心数据。在替代的布置中，其他移动平均线包括但不限于，用于平滑或中心化数据的平均值。其他平滑方法例如指数平滑方法(exponential smoothing methods)也可以实施。图2显示了牛血清白蛋白在输入质荷比光谱上的实施步骤102。在该示例性数据集中，所述牛血清白蛋白的质荷比光谱由“噪声”信号201表示，信号202示出了平滑算法，即使用平均中心化数据，在信号201的数据上的效果。

步骤103中生成的质荷比光谱，增强了峰值，减小了噪声的影响，下文中称为“信号增强的质荷比光谱”。该光谱的生成，通过从输入光谱(步骤101)的数据中取其商的对数来获得，所述数据集由数据201表示，且所述平均中心化光谱在步骤102中生成。

等式1

该等式中，X表示信号增强的质荷比光谱，I相当于输入质荷比光谱(201)的强度，S表示I(202)的平均中心化。通常，该步骤将涉及自然对数的使用。在替代设置中，任何基数的对数都可到达类似的效果。图3示出了对图2展示的数据的处理步骤的应用示范。从图3中可以明显看出，I和S的商的使用确保了每个峰的贡献更均匀，并且确保此贡献不受少量非常强烈的峰的不适当影响，例如，这些非常强烈的峰可归因于单个加合物峰或噪声假峰(noise artefact)。通过该对数转换实现的技术效果为，未分解的峰之间的噪声和局部最小值的总和的净贡献(net contribution)被无效。该处理步骤使得输入的光谱的所有数据能够不依赖现有峰值拾取而被使用。X的输出同样可以由数据阵列中的一组数据点表示。

步骤104中，定义在步骤108中产生的零电荷光谱的最大值和最小值。这些值可以从步骤101中输入光谱的最大值和最小值中推导出来。在该步骤中，将要在步骤108中进行求值的最大电荷态的值也被定义为n_max。根据本教导的这一方面，n_max是从步骤104中定义的零电荷光谱的最大值和最小值，以及步骤101中使用的质荷比光谱的范围中计算得出。在替代设置中，如果需要输出的特定用户优化，则n_max可以被用户定义。从下面参考等式3的讨论中可以明显看出，这种优化可以自动实现。在其他设置中，n_max可能被预定义为一个在处理过程范围内的常数值。步骤104在图1的设置中按以下步骤101至103示出。本教导的上下文中采用的替代处理过程将允许步骤104在步骤105之前的任何点开始进行。

在步骤105，对步骤104中定义的零电荷质量值的范围，求值函数F(M)，通过：

等式2

等式2中，M是步骤104中的定义范围内的任何零电荷质量。变量m_a是带电荷加合物的质量，X是步骤103中求值的信号增强的质荷比光谱的分布函数。

将级数近似到适当的n_max值来降低计算时间。通常，加合物离子的质量(m_a)设为等于1，代表质子，但是代替设置中，m_a可以设为适合于最常见的加合物离子的任何值，并且应当理解的是，m_a实际选择的值将取决于方法的特性和所需的准确性。这样，不同的方法可能需要将m_a设置为不同的值，这将需要对所研究的样品的一些先验知识。

通过使用包含对数函数的信号增强的质荷比光谱，F(M)中的总和将在M对应于母体分子的质量时增强，在M不对应时减少。如果M对应于母体分子的质量，则

的值将与原始质荷比光谱中的峰值一致，且X将产生正值。当M与母体分子质量不对应时，

的值将与原始质荷比光谱的噪声或最小值一致，且该值的总和的净贡献将是负的。使用信号增强的质荷比光谱(X)来求值F(M)，也意味着母体分子质量的多个值的假峰的减少，因为来自M的多个值的X的多余值实际上对F(M)的值产生负面影响。这与强度(I)的简单总和形成对比，其中，背景的额外取样可导致母体分子质量的倍数加重，基线也随着M的增加而增加。

一旦求值了F(M)，步骤106中就可以产生零电荷光谱。然后F(M)的值就可以在步骤107中标准化，以根据终端用户的专业水平产生更易于管理或理解的输出。图4中示出了使用图1的方法处理图2中的零电荷光谱的数据。可以理解的是，数据分析的这种呈现仅是各种可以被采用的不同技术之一，例如，在替代设置中，输出可以为质量值的表格的形式，也可以仅仅为单个质量的值。

由于在该方法中使用的对数的总和，所以通过该方法产生的峰值高度不能作为现存粒子的定量测量来使用。然而，可以针对F(M)的最高值对数据进行标准化处理，以给出更容易阐释的输出。一旦该方法产生了研究中的母体分子的质量，其他定量数据就可以容易的从原始质荷比光谱中提取。例如，使用母体分子的质量可以计算适当的质荷比，且原始质荷比光谱中这些值处的振幅也可以总结出来。因此，可以理解的是，根据图1的方法有利的向用户提供关于所研究的分子的性质的预先信息，然后可以在更详细的处理步骤中使用该信息。

可以理解的是，根据本教导中，从低分辨率质荷比光谱中提取质量信息的上述方法是可以执行的，以便在步骤108中输出单电荷光谱。

例如，在步骤104中，定义了单电荷光谱的最大值和最小值。针对步骤104中定义的单电荷质量值的范围，函数F(M)在步骤105中可以进行求值，通过使用：

等式2a

在等式2a中，M是步骤104中定义的范围内的任一单电荷质量。变量m_a是带电荷加合物的质量，X是步骤103中求值的信号增强的质荷比光谱的分布函数。

在根据等式2a求值F(M)之后，单电荷光谱可以在图1的步骤106中产生。F(M)的值可以在步骤107中标准化，以便在步骤108的输出中生成单电荷质谱。

进一步的，零电荷和单电荷表示可以被概括。在该通用示例中，步骤104中定义了零电荷光谱或单电荷光谱的最大值和最小值。针对在步骤104中定义零带电质量值和单电荷质量值，函数F(M)在步骤105中被求值，通过使用：

等式2b

零电荷表示(等式2)可以通过将z等于0来获得，单电荷表示(等式2a)可以通过将z等于1来获得。

在等式2b中，M是步骤104中定义的范围内的任一零电荷质量或单电荷质量。变量m_a是带电荷加合物的质量，z是光谱的顺序(对于零电荷表示，z＝0，对于单电荷表示，z＝1)，X是步骤103中计算的信号增强的质荷比光谱的分布函数。

然后，在根据等式2b求值F(M)后，图1的步骤106中可以产生零电荷光谱或单电荷光谱。F(M)的值可以在步骤107中标准化，以便在步骤108中产生z-电荷质谱(z-chargedmass spectrum)的输出。

在图1设置的修改中，保留了图1的步骤101和步骤104，但是采用了对该数据集的附加处理。参考图5中的流程图描述该修改的示例，其中，步骤501到步骤504与先前讨论的步骤101到步骤104相同。步骤505到509表示可以引入的额外的优化技术，以提高确定的母体分子质量的准确度并消除分配n_max的任何困难。

在步骤505中，定义了临时参数n′_max且最初将其设置为等于1。

如参考图1所述，因为背景采样或最小值的净结果对求和具有负贡献，所以使用信号增强的质荷比光谱是有益的。这意味着随着n_max的增加和对背景过采样时，F(M)的值将减小。将这种技术与输入质荷比光谱的强度(I)的简单求和相比较，可以理解的是，这种技术在n_max处于高值处采用背景的过采样，导致了F(M)值的增加。使用这种见解，在参考图5例示的修改中，这可以通过求值步骤506中的函数F(M，n′_max)来有利的使用：

等式3

等式3中，M是步骤504中定义的范围内的任一零电荷质量。变量m_a是加合物离子的质量，X是步骤503中使用等式1求值的信号增强的质荷比光谱的分布函数。函数F(M，n′_max)用于优化最大电荷态的值。可以通过在步骤506到508中循环n′_max，和对不同最大电荷态下的函数F(M，n′_max)中进行求值直到n_max，来确定函数F(M，n′_max)的最大值。这种优化的优点是双重的。首先，它确保该方法最有可能找到正确的母体分子质量，特别是在输入质荷比光谱中的信噪比比较差时。此外，它可以允许该方法使用一个固定且高的n_max值，从而在该方法中将n_max减小为常数而不是实验或用户定义的变量。

可以理解的是，该迭代接近法为母体分子质量有利的识别了最适当的质量，并减少电荷质谱中假峰的存在。在高分辨率质谱分析中，普通技术人员理解该电荷态可以很容易从同位素分离中推测出。然而，当使用低分辨率质谱分析数据时，需要假设最大电荷态(n_max)，以有效的提取母体质量。如果该假设太高可能引起问题，参考图15到18可以容易理解，图15到图18示出了母体分子质量M＝900的多电荷质谱的一个非常简单的实例。

在该示例中，最大电荷(n_max)设置到3，如果每个现有技术都基于简单的强度加法来求值F(M)，则F(M)的值就相当于15(即3个峰值，每个峰值强度为5)。

如果n_max被设置到很高，例如n_max＝6(根据图16A)，那么可能在零电荷质量中出现引入假峰(具有与实际峰值M＝900时相似的幅度)的效果。通过对强度的简单求和，可以在M的两个值900和1800(根据图16B)处得到输出F(M)≈15.4。另外，太高的n_max值会导致基线噪声的多余取样。

因此，可以理解的是，在没有本教导和使用强度的简单加法来计算F(M)的情况下，所得到的计算仅仅导致基线噪声的采样随着n_max的增加而增加。这将导致零电荷质谱中的假峰/伪影峰的值的增加。考虑到本发明的技术在低分辨率质谱数据的应用，其中，原始质荷比光谱很可能特别嘈杂，这只会让分析这些光谱的问题变得更加复杂。因此，可以理解的是，n_max估算的太高会导致假峰，n_max估算的太低可能导致母体分子(M)的正确质量值的缺失。

认识到由n_max错误的属性值所引起的这些潜在问题，本发明人已经意识到，根据上述等式1，使用平均中心光谱的对数，部分噪声或峰间的区域将是负数，且这些的过采样将导致F(M)的最大值的降低。如图17所示，如果考虑到图15所示的相同的简化光谱的示例，而是使用n_max＝3时每个等式1的转换，则同等的F(M)近似于9而不是15.4。涉及到图15的可比较结果，这些峰的高度降低，但仍然容易识别。

本发明技术的意义对于n_max设置太高的示例更加明显，例如当M＝900设定n_max为6，而出现M＝1800的假结果。如图18A和18B所示，按照本教导的F(M)的结果接近于6，与相应的现有技术相反，现有技术的结果接近于15.4。可以看出，如果使用信号增强的质荷比光谱的转换(等式1)，且n_max的值太高，则导致F(M)最大值的减小，而不是简单求和。因此，可以通过在步骤506，507和508中循环n_max和输出电荷光谱来寻找F(M)的最大值，其中，n_max与F(M)的最高值相对应。这与现有技术相比是有利的，因为不需要用户进行n_max的初始估计和进一步优化。n_max的值可以初始时被固定为常数并且处于任意高的值。然后n_max的值可以被优化以获得母体分子的正确质量。如参考图15和16的示例所示，使用原始质荷比光谱的简单添加不可能进行这种优化。由于步骤506，507和508的这种优化涉及将多电荷态的所有数据点相加以创建2D阵列，通常具有数千个元素，这意味着需要计算资源的的复杂计算，例如那些如以下参考图14所述的计算资源。

可以理解的是，F(M，n′_max)处于最大值时n′_max的确定，使用平均光谱的对数分析(logarithmic analysis)来进行-上述等式1的计算。商和对数的使用确保一些非常强烈的峰值不会过度影响最终结果。可以理解的是，实验质谱经常包括由加合物或杂质产生的强峰。该商和对数函数的使用确保了带有多电荷分子的峰的集合比单个强峰具有更大的影响，本发明人已经意识到，使用简单的减法技术(subtraction techniques)无法降低该影响，例如那些从原始数据样本中减去平均的或标准化的光谱数据集的技术。从上图15的简化质荷比光谱的数据的扩展可以看出这一点。在该扩展中，添加图19示出的m/z＝1500的单个强杂质峰，以举例说明存在于典型质谱中的杂质数据的类型，该单个强杂质峰与M＝900处的关心的母体质量无关(m/z＝900，450和300)。该实例中，图19中的数据表示在m/z＝1500处加入杂质的原始质荷比光谱。由此可见，该单峰的强度(74.9)比3个峰的组合强度(15.51)强得多，其中，3个峰的母体分子质量M＝900(m/z＝900，450和300)。使用噪声技术的简单减法，导致例如图20A中的图形表示的数据集，其中在m/z＝1500处的峰的强度比在m/z＝900，450和300处峰的组合强度更强。相比之下，等式1的技术有利的使用基于商和对数函数的转换，使用根据等式1的技术导致母体分子(M＝900)在m/z＝1500处的杂质峰的强度小于在m/z＝900，450和300处峰的组合强度。

一旦确定了处于最大值的F(M，n′_max)时n′_max的值，就可以在步骤510和511中产生零电荷光谱。将这些步骤与参考图1描述的那些步骤进行比较，将确认它们与步骤107和108相同。使用这些技术，可以提供图6中明显的输出。图6的示例示出了图5的方法在图2的数据集上的应用，并且不出意外的识别出与图4相同的峰值。如上述参考图4所述，因为数据可以以各种不同的形式输出，例如以质量值表的形式或简单地输出单个质量值，所以该表示不受限制。

可以理解的是，对于单电荷的情况，函数F(M，n′_max)可以从零电荷等式3中导出。按照下面的等式3a，可以求值该函数，以便在步骤510和511中输出单电荷光谱：

等式3a

一般来说，应当理解的是，可以为零电荷光谱和单电荷光谱推导出函数F(M，n′_max)。根据下面的等式3b，可以求值函数F(M，n′_max)以便在步骤510和511中输出零电荷光谱和单电荷光谱：

等式3b

显然，当z等于0时，等式3b的函数F(M，n′_max)还原到等式3的零电荷函数；等式3a的单电荷函数可以从等式3b的一般函数中获得，其中z等于1.

虽然图1和图5的技术在应用于图2的数据集时提供了类似的输出，但是本发明人已经意识到，可以采用以附加预处理的形式对这些技术进行进一步的修改。之前描述的修改的示例，可以参照图7的流程图中的步骤序列来给出。在与参考图5的、上述拥有相同处理技术的方法中，采用了两个附加步骤-步骤702和703。通过包括这些参考图5的上述技术中的步骤，提供了从原始质荷比光谱中质量信息的提取的增强方法。该技术采用这些预处理步骤，特别有利于从较差信噪比的质荷比光谱中提取母体分子质量，例如图8中示出的牛血清白蛋白的质荷比光谱。将这些数据集与图2的数据进行比较，表明了该数据集比图2的数据集具有更低的离子计数水平，因此，该数据集更容易受到来自固有噪声级的误差的影响。

当提供诸如图8中所示的数据集时，本教导采用预处理的平滑步骤(smoothingstep)(步骤702)来消除光谱中的噪声，但该步骤也保持峰结构。优选的设置中，使用Savitzky-Golay滤波器，因为该滤波器很善于保持质荷比光谱中的原始特征的形状。

也可以使用其他移动平均平滑方法(moving average smoothing methods)或指数平滑方法(exponential smoothing methods)。图9说明了该预处理的平滑在图8的光谱上的使用，从中可以明显产生“更干净”的数据集。

使用来自图9的该滤波数据集，图7的所述方法提供了步骤703的附加的处理步骤-背景减法。虽然可使用各种基线减法技术(baseline subtraction techniques)，例如凸包，小波和中值滤波器，但是，优选的方面中，使用例如在Nucl.Instrum.Meth.B(1998年)第1卷396-402页中证明的统计敏感的非线性迭代峰值削弱(SNIP)基线减法。质谱分析的普通技术人员可以理解的是，SNIP广泛应用于质谱分析，因为它具有应对各种背景形状的实际能力。图10展示了基线减法在图9中呈现的平滑的数据上的使用。应当理解的是，基线减法的使用生成了平滑的质荷比光谱1002，该光谱1002相对于图9的原始牛血清白蛋白的光谱1001。

应当理解的是，基线减法步骤703不必遵循平滑步骤，步骤702和其他技术可以采用基线减法来作为平滑步骤(702)的预处理步骤。替代技术也可以单独使用基线减法或平滑中的一个。

在步骤701至703之后，预处理的光谱在步骤704的方法中平均居中化，该方法与图1和图5各自的步骤102和步骤502中所述的方法相同。图11说明了该步骤在图10的预处理数据中的影响。前述的关于图10的牛血清白蛋白的预处理的质荷比光谱1001，在图11中通过1101表示，1102表示了数据集使用步骤704的平均居中数据技术的处理。

步骤704之后的步骤705中，信号增强的质荷比光谱使用等式1、与如上述步骤103和503相同的方法进行求值。图12示出了应用到图11所示的数据时的输出。

在步骤706到712中，信号增强的质荷比光谱使用等式3中的函数、以与上述的步骤504到510相同的方式进行求值。

在步骤713中产生了零电荷质谱。图13示出了当在例如图8所示的噪声数据集上应用图7的技术时的输出。与图4和图6的表示相似的是，表格形式的数据的表示不是限制性的，并且在替代的设置中，该输出可以以质量值表或单个质量值的形式进行表示。

可以理解的是，在步骤706中，所述信号增强的质荷比光谱既可以使用等式3a或等式3b中的函数，以与上述步骤504到510相同的方式进行求值。可以理解的是，特定等式的选择将在步骤713分别产生零电荷光谱或单电荷光谱。

如上所述，根据本教导的方法使用由质谱仪产生的数据集，并且本教导的功能可以与这种质谱仪的现有功能集成。在本教导中有效使用的已知质谱仪的功能性的示例，包括在我们先前的那些例如EP 1865533或EP 2372745的应用中描述的示例。根据本教导，使用这些类型的质谱仪，可以通过对附加操作的集成或耦合来扩展质谱仪的功能。图14示出了这种集成的示例，其中，质谱仪1400包括电离源1430，该电离源可以是电喷雾电离源。该电离源被配置成电离多原子母体分子，当检测器1420检测到该多原子母体分子时，该多原子母体分子生成上面讨论的输入质荷比光谱。然后将所述输入质荷比光谱中继到计算机系统或其他处理设备600中。一种实施方式中，所述处理设备600通常包括至少一个处理单元602和存储器604。取决于处理设备600的确切配置和类型，存储器604可以是易失性的(例如RAM)，非易失性的(例如ROM和闪存)，或者二者的某种组合。处理设备600的最基本配置仅需要包括处理单元602和存储器604，如虚线606所示。主操作系统或基本操作系统被配置为在非易失性存储器604中控制处理设备600的基本功能。

所述处理设备600还包括用于记忆存储或检索的附加设备。这些设备可以是可移动存储设备608或不可移动存储设备610，例如，存储卡，磁盘驱动器，磁带驱动器，和用于在磁性和光学介质上记忆存储和检索的光驱。存储介质可以包括易失性和非易失性介质，包括可移动和不可移动，并且可以以多种配置中的任何一种提供，例如，RAM，ROM，EEPROM，闪存，CD-ROM，DVD或其他光学存储介质，盒式磁带，磁带，磁盘或其他磁存储设备，或可用于存储数据且可由处理单元602访问的任何其他存储技术或介质。附加指令，例如以软件形式的附加指令，与基本操作系统相互作用，以创建专用处理设备600，在该实施方式中，用于处理以数据阵列的形式从质谱仪检测器1420中接收的质谱仪数据的指令，该指令可以存储在使用任何方法或技术存储数据的存储器604中或存储设备610上，例如，计算机可读指令，数据结构和程序模块数据。

所述处理设备600还可以具有一个或多个通信接口612，该通信接口允许所述处理设备600与其他设备例如质谱仪通信。所述通信接口612可以与网络连接。该网络可以是局域网(LAN)，广域网(WAN)，以电话络，有线电视网络，光纤网络，因特网，直接有线连接，无线网络，例如，射频，红外，微波或声学，或其他能够在设备之间传输数据的网络。数据通常通过网络经由调制数据信号发送到通信接口612和从通信接口612发送，例如，载波或其他传输介质。可以理解的是，调制数据信号是电磁信号，该信号具有可以以对信号内的数据进行编码的方式设置或改变的特性。以这种方式，虽然图14的布置示出了虚线轮廓1400中的完全集成，但是处理设备600的功能可以在实际检测器1420和电离源1430中远程完成。

所述处理设备600还可以具有各种输入设备614和输出设备616。典型的输入设备614可以包括摄影机，录音机或回放单元，键盘，鼠标，平板电脑和/或触摸屏设备。典型的输出设备616可以包括视频显示器，音频扬声器和/或打印机。这样的输入设备614和输出设备616可以与计算机系统600集成，或者它们可以通过有线或无线与计算机系统连接，例如，通过IEEE 802.11或蓝牙协议。这些输入和输出设备可以与质谱仪的用户界面1410通信或集成。这些集成的或外部的输入和输出设备通常是众所周知的，在此不再进一步讨论。其他功能，例如网络通信事务的处理，可以由处理设备600的非易失性存储器604中的操作系统执行。

当在本说明书中使用时，词语包括/包含用于指定规定的特征，整数，步骤或组件的

在此描述的方法可以作为一个或多个系统的逻辑运算和/或模块进行实施，该系统耦合到质谱仪或质谱仪组件，或者与质谱仪或质谱仪组件进行电子通信。所述逻辑运算可以作为在一个或多个计算机系统中执行的一连串处理器执行步骤来实施，以及作为一个或多个计算机系统内的互联机构或电路模块来实施。

同样地，各种组件模块的说明可以根据模块执行或实现的操作来提供。最终的执行是一个选择问题，取决于执行所述的技术的底层系统的性能要求。因此，所述逻辑运算组成本文所述的技术的实施例，该逻辑运算涉及到不同的操作，步骤，对象或模块。此外，应该理解的是，所述逻辑运算可以以任何顺序执行，除非另有明确声明或者权利要求语言固有地需要特定顺序。

在一些实施方式中，制品作为计算机程序的产品提供，其导致计算机系统上的操作的实例化以执行本发明。计算机程序产品的一种实施方式提供了计算机系统可读的非暂时性的计算机程序存储介质，该存储介质可编码计算机程序。还应该理解的是，所述技术可以用于不依赖个人计算机的专用设备。上述说明、示例和数据提供了权利要求书限定的本发明中的典型的结构的完整描述和典型实施例的使用。尽管上述要求保护的发明的各种实施例和方面具有一定程度的特殊性或参考了一个或多个单独的实施例，但是本领域的技术人员可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下对所公开的实施例进行多种改变。因此，其他实施例是可以预期的。旨在将以上描述包含的所有内容和附图中示出的所有内容解释为仅说明特定的实施例，而不是限制该实施例。细节或结构的改变可以在不脱离以下权利要求所限定的本发明的基本要素的前提下进行。

Claims

1.一种从多电荷粒子的低分辨率质荷比光谱中提取质量信息，以在多电荷粒子中识别多原子母体分子的质量的方法，该方法包括步骤：

从质谱仪中接收表明多电荷离子群的数据集，每个离子上的电荷数定义了该离子的电荷态，其中，所述离子群内的离子子群包括所述离子群中具有相同电荷态的离子；

使用表明多电荷离子群的数据集来生成输入质荷比光谱，每个电荷态的子群由质荷比光谱中的强度表示；

处理输入质荷比光谱以提供信号增强的质荷比光谱(103)，信号增强的质荷比光谱从所述质荷比光谱的商的对数和该质荷比光谱的平滑表示中生成；

识别(104)定义的电荷质谱的定义的电荷质量值的范围，并在该范围内搜索多原子母体分子的质量；

使用所述总和的值来确定多原子母体分子的质量。

2.根据权利要求1的方法，其中，使用所述总和的值来确定多原子母体分子的质量，包括在所述总和范围内标准化所述总和的值，以确定母体分子的质量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，带电荷加合物的质量m_a设定为等于1，表示质子质量。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述信号增强的质荷比光谱(103)由以下函数产生：

其中，X表示信号增强的质荷比光谱，I相当于输入质荷比光谱(201)的强度，S是输入质荷比光谱的平滑表示。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对于定义的电荷质量值的定义范围内的任一质量，该方法进一步包括：

计算直到最大电荷态的不同值的总和；

6.根据权利要求1或2所述的方法，还包括在形成信号增强的质荷比光谱之前对输入质荷比光谱进行光谱预处理。

7.根据前述权利要求6所述的方法，其中，光谱预处理选自平滑和/或基线减法中的至少一个。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述多电荷粒子通过电喷雾电离产生。

9.根据权利要求1或2所述的方法，包括在质谱仪源内电离多原子母体分子，以产生输入质荷比光谱。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是零电荷质谱，该零电荷质谱具有所有识别的零电荷值的粒子。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是用于识别单电荷质量值的范围的单电荷质谱。

12.根据权利要求3所述的方法，其中，所述信号增强的质荷比光谱(103)由以下函数产生：

13.根据权利要求4所述的方法，其中，对于定义的电荷质量值的定义范围内的任一质量，该方法进一步包括：

计算直到最大电荷态的不同值的总和；

14.根据权利要求4所述的方法，还包括在形成信号增强的质荷比光谱之前对输入质荷比光谱进行光谱预处理。

15.根据权利要求5所述的方法，还包括在形成信号增强的质荷比光谱之前对输入质荷比光谱进行光谱预处理。

16.根据权利要求4所述的方法，其中，所述多电荷粒子通过电喷雾电离产生。

17.根据权利要求5所述的方法，其中，所述多电荷粒子通过电喷雾电离产生。

18.根据权利要求6所述的方法，其中，所述多电荷粒子通过电喷雾电离产生。

19.根据权利要求4所述的方法，包括在质谱仪源内电离多原子母体分子，以产生输入质荷比光谱。

20.根据权利要求5所述的方法，包括在质谱仪源内电离多原子母体分子，以产生输入质荷比光谱。

21.根据权利要求6所述的方法，包括在质谱仪源内电离多原子母体分子，以产生输入质荷比光谱。

22.根据权利要求4所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是零电荷质谱，该零电荷质谱具有所有识别的零电荷值的粒子。

23.根据权利要求5所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是零电荷质谱，该零电荷质谱具有所有识别的零电荷值的粒子。

24.根据权利要求6所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是零电荷质谱，该零电荷质谱具有所有识别的零电荷值的粒子。

25.根据权利要求8所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是零电荷质谱，该零电荷质谱具有所有识别的零电荷值的粒子。

26.根据权利要求9所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是零电荷质谱，该零电荷质谱具有所有识别的零电荷值的粒子。

27.根据权利要求4所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是用于识别单电荷质量值的范围的单电荷质谱。

28.根据权利要求5所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是用于识别单电荷质量值的范围的单电荷质谱。

29.根据权利要求6所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是用于识别单电荷质量值的范围的单电荷质谱。

30.根据权利要求8所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是用于识别单电荷质量值的范围的单电荷质谱。

31.根据权利要求9所述的方法，其中，所述定义的电荷质谱是用于识别单电荷质量值的范围的单电荷质谱。

32.一种质谱仪，包括电喷雾电离源和检测器，配置所述检测器来生成表明由电离源生成的多电荷离子群的结果，每个离子上的电荷数定义该离子的电荷态，每个电荷态包括所述离子群内的离子子群，该质谱仪还包括配置成执行前述任一权利要求的方法的处理器。