CN109475604A - 长效型clr/ramp激动剂的配量和用途 - Google Patents

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Abstract

提供了针对CLR/RAMP受体的长效型激动剂类似物，其于活体内具有延长的半衰期。所述激动剂是以足以降低高血压和缺血性损伤及降低与化疗剂相关的心脏毒性的剂量递送至个体。

Description

长效型CLR/RAMP激动剂的配量和用途
交叉引用
本申请要求2016年2月9日提交的美国临时专利申请第62/292,975号的权益，该申请通过引用整体并入本文。
简介
内皮功能障碍是与各种威胁生命的疾病中的微血管和大血管并发症相关联的发病率及死亡率的主要原因，所述疾病包括动脉粥样硬化症、心脏衰竭、顽固性高血压(resistant hypertension)、高血压危象、中风、心肌梗塞、先兆子痫、肺动脉高压和糖尿病性溃疡(Sanchez-Aranguren等(2014)Front Physiol 5:372；Park和Park(2015)J KoreanMed Sci 30:1213-1225；Mordi和Tzemos(2014)World J Cardiol 6:824-835)。内皮功能障碍是随着这些疾病的自然过程的早期事件并且代表重要的风险因素。血管内皮的功能包括合成调节血管张力的物质、抑制血小板凝集及控制血管细胞增生。内皮损伤可导致一氧化氮生成减少、内皮源性的收缩因子增加和内皮屏障破裂，从而导致血管收缩、血栓、血管阻力增加、血管渗漏和水肿。这在临床上表现为高血压、动脉粥样硬化症、左心室心肌症、缺血性溃疡和肾脏损伤。
虽然过去二十年的医疗保健改进已显著性地改进患有一些这些疾病的患者的结局，但是由于缺乏可特异性地靶向内皮功能障碍的治疗而不能有效地预防大部分这些疾病的进展。例如，目前针对先兆子痫(在妊娠期间的高血压病症)的标准护理为预防性措施，包括卧床休息、加强产前保健、抗生素和抗癫痫药。然而，没有这些措施中的任一种有效地使先兆子痫妇女多延迟几天分娩的证据。针对该疾病的唯一“治愈(cure)”是婴儿分娩(Pennington等(2012)Dis Model Mech 5:9-18；Fisk和Atun(2008)PLoS Med 5:e22)。因此，患有先兆子痫的患者面对严重的长期发病率及母亲与胎儿的高死亡率，且在美国由于先兆子痫每年出生将近100,000名早产儿。另一方面，与血压受控的患者相比时，患有顽固性高血压的患者(出现在接受标准高血压治疗的～10％患者中)，尽管使用4至5种不同类别及抗高血压的治疗剂，仍遭受两倍发展心肌梗塞、中风和各种心血管疾病的可能性及较高的死亡率(Muntner等(2014)Hypertension 64:1012-1021；Smith等(2014)J Hypertens32:635-643；Calhoun等(2014)Hypertension 63:451-458)。同样地，完全缺少可靶向淋巴系统中内皮功能障碍的治疗剂。因此，患有淋巴性病症(诸如肥胖及乳癌治疗诱发的淋巴水肿)的患者遭受与继发性淋巴水肿的终身奋战。
迫切需要可改善患有先兆子痫、顽固性高血压、高血压危象、乳癌治疗诱发的淋巴水肿或其它内皮功能障碍相关的疾病的患者的内皮功能障碍并恢复正常血管功能的新方法。
最近的研究显示(1)两种内分泌激素，肾上腺髓质素(ADM)及中叶素(intermedin)(IMD)或肾上腺髓质素2(ADM2)为血管舒张及内皮屏障完整性的主要调节剂，并且(2)对作为血管、血管生成及血管重塑的原材料的血液及淋巴内皮细胞的增生具有潜在刺激效应(Shindo等(2001)Circulation 104:1964-1971；Ichikawa-Shindo等(2008)J Clin Invest118:29-39；Koyama等(2013)Circulation 127:842-853)。ADM和IMD属于还包括降钙素基因相关肽(α-和β-CGRP)的肽家族。这些肽在结构上类似并且通过由两种跨膜组分：降钙素受体样受体(CLR)及三种受体活性调节蛋白(RAMP1、2和3)之一所组成的受体复合物传导信号(Christopoulos等(1999)Mol.Pharmacol.56:235-242；Poyner等.(2002)Pharmacol.Rev.54:233-246；McLatchie等(1998)Nature 393:333-339)。鉴于CGRP主要通过CLR/RAMP1受体作用，故ADM对CLR/RAMP2和3受体具有高亲和性。另一方面，IMD为弱配体并且对三种CLR/RAMP受体未表现出显著偏好。
虽然最初将ADM及IMD表征为潜在血管舒张调节剂，但是随后的研究揭露ADM、IMD及CGRP在调节外周血管阻力、血管渗透性、心输出量、神经元细胞存活及肾小球过滤作用中发挥重要作用。
使用CGRP或ADM不足的突变小鼠的研究表明在不同系统中，CLR在调节心血管型态生成、感觉性神经传导、炎性反应、致痛性行为及葡萄糖稳态中发挥重要作用。因此，这个家族中的肽的生理功能由个别配体的受体结合特异性及组织表达谱决定。
肽激素对疗法的临床用途及开发非常有意义，包括治疗动脉粥样硬化症、心脏衰竭、顽固性高血压、难治性高血压、中风、心肌梗塞、先兆子痫、肺动脉高压、继发性淋巴水肿和糖尿病性溃疡，及维持心血管稳态。虽然早期研究表明ADM家族肽是用于治疗与各种内皮功能障碍相关的疾病的潜在治疗候选物；然而，经静脉内施用的野生型肽快速清除并且在药理剂量下可以导致补偿性心动过速。
相关出版物
Hay和Smith(2001)Trends Pharmacol.Sci.22:57-59；Li等(2013)J Clin Invest123:2408-2420；Fritz-Six等(2008)J Clin Invest 118:40-50；Dackor等(2006)Mol Cell Biol 26:2511-2518；Caron和Smithies(2001)PNAS 98:615-619；Yoshizawa等(2013)Hypertension 61:341-351；Koyama等(2015)J Atheroscler Thromb 22:647-653；Shindo等(2013)Curr Protein Pept Sci 14:347-357；Niu等(2004)Circulation 109:1789-1794)及Shindo等(2001)Circulation 104:1964-197讨论了肾上腺髓质素在脉管系统中的重要性。Zhang等(2001)Pain 89:265-273；Salmon等(1999)Neuroreport 10:849-854；及Salmon等.(2001)Nat.Neurosci.4:357-358讨论了CGRP的作用。Mulder等(2000)Am .J.Physiol.Endocrinol.Metab.278:E684-691讨论了糊精的作用。
基因库登录号AF529213。
发明内容
本发明提供长效型CLR/RAMP受体激动剂的使用方法。在一些实施方案中，长效型CLR/RAMP受体激动剂是按足以降低高血压和缺血性损伤，特别是与妊娠相关的高血压(例如子癫前症)和高血压危象的剂量向个体递送。类似物可以通过注射或输注递送，包括连续输注。剂量可足以降低平均动脉压、心跳过速、缺血性损伤、器官毒性、末端器官衰竭和心脏肥大中的一种或多种。
在其它的实施方案中，证实共同施用长效型CLR/RAMP受体激动剂会降低与化疗剂(包括而不限于蒽环霉素(anthracycline))相关的心脏毒性。
可用于本发明方法中的长效型CLR/RAMP受体激动剂提供肾上腺髓质素、中叶素或CGRP的生物活性，包括充当降钙素受体样受体/RAMP受体的配体，但是与天然多肽相比时具有大体上更长的体内半衰期。此等类似物提供比天然肽持续时间长至少2倍，并且可能长5倍、长10倍、长20倍或更长的体内有效性。特别有兴趣的是降血压效应，其中有效地使收缩压或平均动脉压降低至少约10％的类似物肽的单一剂量有效维持降低的血压至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时或更长。
长效型CLR/RAMP受体激动剂包含在N端经修饰的生物活性肾上腺髓质素、中叶素或嵌合肾上腺髓质素/中叶素多肽。关注的N端修饰包括与脂肪酸(通常可为不饱和或饱和的C4至C30脂肪酸)或聚乙二醇分子缀合。关注的脂肪酸包括而不限于棕榈酸；硬脂酸；花生酸；月桂酸；肉豆蔻酸；肉豆蔻油酸；棕榈油酸；十六碳烯酸(sapienic acid)；油酸；亚油酸；α-亚麻油酸；花生四烯酸；二十碳五烯酸；芥酸；二十二碳六烯酸等等。可通过添加用于脂肪酸缀合的赖氨酸残基来修饰氨基端。
在其许多实施方案中，本发明涉及治疗患有缺血性损伤的患者的新型方法。提供使用长效型CLR/RAMP受体激动剂治疗、预防、抑制或改善一或多种与CLR/RAMP受体相关且与缺血性损伤有关的疾病的方法。
附图简述
在连同附图一起阅读下列详细说明时对本发明有更好的理解。根据惯例，应强调附图的各种特性不按比例绘制。相反，为了清楚起见而任意扩大或缩小各种部件的尺寸。附图中包括下列图片。
图1A-1B.快速腹腔注射长效型CLR/RAMP受体激动剂(即长效型ADM类似物SEQ IDNO:2；在图中标记为“稳定类似物”)导致正常妊娠Sprague Dawley大鼠中血压持续降低达4小时，而野生型ADM的降血压效应在2小时内消失(图1A)。施用低剂量的长效型稳定类似物(30纳摩尔/kg)在妊娠Sprague Dawley大鼠中一致性地降低血压2小时。相反，长效型稳定类似物的降血压效应在妊娠SHR大鼠中持续8小时以上(图1B)。
图2A-2B.图2A，在低剂量处理研究中，妊娠大鼠接受3.3μg/kg/h的长效型稳定类似物或盐水，持续四天。当与假对照相比时，RUPP对照大鼠显著地增加平均动脉压。图2B，假对照的平均胎盘重量为510±26mg。胎盘重量在RUPP对照及RUPP稳定类似物两者中显著地降低。
图3A-3H.低剂量的长效型稳定类似物对子宫灌注压受限(RUPP)诱发的高血压或胎儿/胎盘发育具有最小效应。在妊娠大鼠中，RUPP手术导致平均动脉压显著增加(图3A)，及胎儿及胎盘重量降低(图3B)。然而，低剂量稳定类似物处理对这些经RUPP诱发的副作用具有最小效应。图3.高剂量的长效型稳定类似物对各种RUPP诱发的副作用具有显著保护效应。RUPP手术导致平均动脉压(图3A)及心跳速率(图3B)显著增加，且胎儿重量(图3C)、胎盘重量(图3D)及体重(图3E)降低。RUPP处理也导致心脏肥大(图3F)。重要地，高剂量类似物处理显著地降低RUPP诱发的对平均动脉压、心跳速率、胎儿重量、胎盘重量、体重和心脏重量的副作用(图3A-3F)。多普勒(Doppler)测量显示收缩点以上的血流速度在处理组间都相同(图3G)。另一方面，收缩点以下的血流速度在RUPP对照及RUPP-ADE动物中降低50％以上(图3H)。假对照组与RUPP对照组间的显著差异用星号表示(P<0.05)。RUPP对照组与RUPP-ADE组间的显著差异用#符号表示(P<0.05)。
图4A-4B.以长效型稳定类似物处理显著地减轻经多柔比星(doxorubicin)诱发的心肌症及肝毒性。与对照小鼠(对照)相比时，多柔比星(Dox)处理显著地降低成年小鼠的平均心脏重量(图4A)，而多柔比星处理显著地升高血液天冬氨酸氨基转移酶含量(图4B)。经多柔比星诱发的心肌症及肝毒性通过共同施用长效型稳定类似物(Dox+稳定类似物组)而显著降低。另一方面，野生型ADM对多柔比星诱发的心肌症具有最小的效应(Dox+ADM组)。假对照组与Dox组间的显著差异用星号表示(P<0.05)。Dox组与Dox+稳定类似物组间的显著差异用#符号表示(P<0.05)。
具体实施方式
本发明提供肾上腺髓质素的新型多肽类似物，其为降钙素肽激素家族的成员。肾上腺髓质素为降钙素受体样受体的配体。ADM基因编码前激素原(preprohormone)，其经翻译后修饰以产生2种生物活性肽：肾上腺髓质素及肾上腺髓质素原(proadrenomedullin)N端20肽(PAMP)。肾上腺髓质素由52个氨基酸组成，具有1个分子内二硫键且与降钙素基因相关肽显示出略微同源性。称为前肾上腺髓质素原的前体长度为185个氨基酸。参见基因库参考NM_001124，通过引用明确并入本文。前体多肽(SEQ ID NO:1)具有氨基酸序列：
就本发明的目的而言，除非另有说明，否则术语“肾上腺髓质素肽”可指源自肾上腺髓质素前体肽的任何活性肽。特别关注的是降血压肽。活性肽包括而不限于长效型CLR/RAMP受体激动剂，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:2或长效型肾上腺髓质素肽)
K(mod)GCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY，其中残基1处的赖氨酸经修饰，例如通过附连脂质或其它基团，或具有SEQ ID NO:3-34的氨基酸序列(表1)。
长效型肽的结构示于结构I中。
其中R1为直链或支链C3-C100烷基；优选C4-C30烷基，其任选地经卤基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸基团或磷酸基团取代且可为饱和或单不饱和或双不饱和，例如18:0、24:0和24:1。关注的脂肪酸包括而不限于棕榈酸；硬脂酸；花生酸；月桂酸；肉豆蔻酸；肉豆蔻油酸；棕榈油酸；十六碳烯酸(sapienic acid)；油酸；亚油酸；α-亚麻油酸；花生四烯酸；二十碳五烯酸；芥酸；二十二碳六烯酸等等。
表1
表1.长效型CLR/RAMP受体激动剂列表
肾上腺髓质素(ADM)和中叶素为CLR/RAMP受体的配体且在结合时活化受体。经肾上腺髓质素或中叶素活化导致血管系统效应，包括降低血压、血管舒张、增加血管稳定性及降低缺血性损伤。因此，肾上腺髓质素和中叶素是通过CLR/RAMP受体传导信号以调节外周血管舒张相关过程，并对各种动物模式的先兆子痫、心脏衰竭、心肌梗塞、中风、顽固性高血压、继发性淋巴水肿及肺动脉高压具有有利效应(Li等(2013)J Clin Invest 123:2408-2420；Fritz-Six等(2008)J Clin Invest 118:40-50；Dackor等(2006)Mol Cell Biol 26:2511-2518；Caron和Smithies(2001)PNAS 98:615-619；Yoshizawa等(2013)Hypertension61:341-351；Koyama等(2015)J Atheroscler Thromb 22:647-653；Shindo等(2013)CurrProtein Pept Sci 14:347-357；Niu等(2004)Circulation 109:1789-1794)。
对于在本发明方法中的用途，可以使用长效型肾上腺髓质素、中叶素或其变体(表1)。关注的肽包括至少约12个连续氨基酸，更常为至少约20个连续氨基酸的片段，并且可包含30、35、40个或更多个氨基酸，至完整肽，并且可进一步延伸以包含前体蛋白质中存在的其它序列。缺失可从肽的残基1延伸至残基10并且可进一步另外缺失残基10-15或更多的氨基酸。可在N端或序列中间缺失1至5个氨基酸的较小缺失。关注的用于治疗目的的肽可包括提供的所有或基本上所有肽，或可包含其保持肾上腺髓素或中叶素生物活性的片段。
多肽序列可以本领域中已知的各种方式改变以产生靶向序列变化。多肽通常基本上类似于本文所提供的序列，即与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3-34具有大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％的序列同一性。序列变化可能是取代、插入或缺失。扫描系统性引入丙氨酸或其它残基的突变可用于确定关键氨基酸。保守性氨基酸取代通常包括以下类别的取代：(甘氨酸、丙氨酸)；(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)；(天冬氨酸、谷氨酸)；(天冬酰胺、谷氨酰胺)；(丝氨酸、苏氨酸)；(赖氨酸、精氨酸)；或(苯丙氨酸、酪氨酸)。
关注的不改变主要序列的修饰包括多肽的化学衍化，例如乙酰化、酰化、聚乙二醇化或羧化。还包括糖基化修饰，例如那些通过在多肽合成及加工期间或在其它加工步骤中修饰多肽的糖基化模式所产生的修饰；例如通过将多肽暴露于影响糖基化的酶，诸如哺乳动物糖基化或去糖基化酶。
在特定实施方案中，长效型CLR/RAMP受体激动剂选自肾上腺髓质素、中叶素、嵌合肾上腺髓质素/中叶素及其修饰物，如表1所示。CLR/RAMP受体激动剂或其修饰物优选为哺乳动物肽，尤其为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫、马、牛、猪或灵长类动物肽或其衍生物。肽优选为人肽或其衍生物。
如本发明所用的长效型CLR/RAMP受体激动剂的修饰包含对化合物的氨基酸序列，在氨基酸序列中至少一个位置上的变化，包括氨基酸插入、缺失和取代。优选地，经修饰的长效型CLR/RAMP受体激动剂以与未经修饰的肽类似的方式结合CLR/RAMP受体且因此显示出类似或优良的生理活性。
在其它实施方案中，长效型CLR/RAMP受体激动剂包含肾上腺髓质素、中叶素、嵌合肾上腺髓质素/中叶素或其修饰物的光学异构体、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、顺-反异构体、外消旋物、前药或药学上可接受的盐。在本发明的特定实施方案中，所述化合物包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NOS:3-34所示的氨基酸序列的CLR/RAMP受体激动剂，其含有在其羧基端上的CONH2及氨基酸序列的N端酰化。此外，本发明化合物是指与CLR/RAMP受体结合或复合的化学或肽部分，诸如肾上腺髓质素或模拟肾上腺髓质素多肽。优选的化合物是于活体内稳定性增加的肽。
表1中提供了在C端酰胺化的长效型CLR/RAMP受体激动剂的实施方案。经修饰的肽任选地含有酰化修饰物。任选地，酰化数量可为一个以上，以一种反应性基团优选。
本发明的药物化合物还包括立体异构体或每种纯的或基本上纯的异构体的混合物。例如，本发明化合物可任选地在含有任一取代基的碳原子上具有一个或多个不对称中心。因此，所述化合物可以对映异构体或非对映异构体或其混合物的形式存在。当本发明化合物含有双键时，本发明化合物可以几何异构性形式存在(顺式化合物、反式化合物)，并且当本发明化合物含有不饱和键，诸如羰基时，则本发明化合物可以互变异构体形式存在，且本发明化合物还包括这些异构体或其混合物。呈外消旋混合物、对映异构体或非对映异构体形式的起始化合物可用于制备本发明化合物的方法中。当本发明化合物是以非对映异构体或对映异构体形式获得时，可将其以常规方法分离，诸如色谱法或分级结晶。另外，本发明化合物包括其分子内盐、水合物、溶剂合物或多晶型物。
本发明还包括已使用普通分子生物学技术及合成化学修饰的多肽，以便改进其对蛋白质降解的抗性，或优化溶解性，或使其更适合作为治疗剂。例如，可通过添加环二硫桥或内酰胺桥使肽骨架环化以增强稳定性(参见Friedler等(2000)J.Biol.Chem.275:23783-23789)。此类多肽的类似物包括含有除了天然存在的L-氨基酸以外的残基(例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的类似物。
本发明的肽可使用如本领域已知的常规方法通过体外合成制备。各种商用合成装置可用，例如Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,Beckman等的自动化合成仪。使用合成仪，可以用非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸。特定序列及制备方式是由便利性、经济性、所需纯度等决定的。
若需要，可将各种基团在合成期间或表现期间引入肽中，这些基团允许与其它分子或表面连接。因此，半胱氨酸可用于制备硫醚，组氨酸可用于连接金属离子复合物，羧基可用于形成酰胺或酯，氨基可用于形成酰胺，等等。
也可依照常规重组合成方法分离和纯化多肽。可制备表达宿主的溶解产物且使用HPLC、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法或其它纯化技术纯化溶解产物。在大多数的情况下，所使用的组合物是相对于产物制备及其纯化方法有关的污染物，包含至少20重量％的所需产物，更常为至少约75重量％，优选为至少约95重量％，且出于治疗目的通常为至少约99重量％。通常，百分比将按总蛋白质计。
使用方法
长效型CLR/RAMP受体激动剂可用于降低高血压及改进血管完整性，特别是与妊娠、高血压危象、顽固性高血压或肺动脉高压相关的高血压，以及内皮功能障碍相关的疾病，包括中风、心绞痛、心动脉疾病、心肌梗塞、肾衰竭、继发性淋巴水肿和糖尿病性溃疡。所述治疗使高血压，例如收缩压或平均动脉压降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％或更多，不增加心跳速率。所述治疗可使心跳速率，即心动过速降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％或更多。
在使用方法中，本发明的长效型CLR/RAMP受体激动剂的有效剂量是单独地或以肽混合液(cocktail)施用或与用于治疗高血压、内皮功能障碍、器官毒性和缺血性损伤(包括而不限于与高血压危象或妊娠相关的高血压，诸如子癫前症)的附加活性剂组合。在如本文所示的大鼠模型中的有效剂量经适当地转换成人类等效剂量。
用于人类患者的有效日剂量可为约10μg/kg体重、25μg/kg体重、50μg/kg体重、100μg/kg体重、250μg/kg体重、500μg/kg体重、750μg/kg体重、1mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、25mg/kg体重、50mg/kg体重、75mg/kg体重、100mg/kg体重、250mg/kg体重、500mg/kg体重、750mg/kg体重、1mg/kg体重等。可将日剂量根据需要分成多次施用的较小剂量，例如每30分钟、每小时、每2小时、每4小时、每6小时、每8小时、每12小时、每18小时、每天、每2天、每3天、每周等。剂量也可以连续输注施用，例如以约0.5μg/kg/h；约1μg/kg/h；约2μg/kg/h；约4μg/kg/h；约10μg/kg/h；约15μg/kg/h；约20μg/kg/h；约25μg/kg/h；约30μg/kg/h；约35μg/kg/h；约40μg/kg/h；约50μg/kg/h或更大的剂量。
有效剂量可维持一段足以治疗高血压及内皮功能障碍的时间，包括在高血压危象或妊娠中稳定血压及降低缺血性损伤。治疗可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，例如1周、2周、3周、4周或更久。治疗可为连续性或间歇性，例如每隔一天、每三天、每周等等。
本发明的肽用于降低与高血压危象、顽固性高血压、先兆子痫或子痫相关的高血压，且可在一段足以稳定受试者且容许安全妊娠分娩的时间内施用。
先兆子痫为妊娠20周后新发病的高血压和蛋白尿症。子痫为先兆子痫患者无法解释的全身发作。诊断是临床的并且是通过尿蛋白测量。常规治疗通常以IV硫酸镁(IV Mgsulfate)进行并且足月分娩。先兆子痫影响3至7％的孕妇。先兆子痫及子痫在妊娠20周后发展；至多25％的病例是在产后发展，最常在产后前4天，但有时长达产后6周。未经治疗的先兆子痫通常郁积一段不定的时间，接着突然进展成子痫，这发生在1/200的先兆子痫患者中。未治疗子痫通常会致命。
先兆子痫可能无症状或者可能引起水肿或过度增重。非坠积性水肿(Nondependent edema)，诸如脸部或手肿胀(患者的戒指可能不再适合她的手指)比坠积性水肿更特殊。可能增加反射性反应，表明神经肌肉应激性，这可进展成癫痫(子痫)。可发展出可为凝血障碍的其它征兆的瘀斑。
20周后诊断新发病的高血压(BP>140/90mm Hg)加上新的无法解释的蛋白尿>300mg/24小时。建议以定义为收缩压>140mm Hg、舒张压>90mm Hg或两者的高血压的症状或存在来诊断。除了紧急情况以外，高血压应以间隔至少4小时取得的>2次测量记录。尿蛋白排泄是以24小时收集物进行测量。蛋白尿定义为>300mg/24小时。或者，基于蛋白质:肌酸酐比≥0.3或试纸条(dipstick)读数为1+(仅在其它定量方法不适用时使用)诊断蛋白尿。基于不太准确的试验(例如尿试纸条测试、常规尿分析)，不存在蛋白尿不可排除先兆子痫。
在蛋白尿不存在时，若孕妇有新发病的高血压加上新发病的下列中的任一种，则诊断为先兆子痫：血小板减少症(血小板<100,000个/μL)、肾功能不全(血清肌酸酐>1.1mg/dL或在没有肾病的妇女中血清肌酸酐双倍)、肝功能受损(氨基转移酶>2倍正常值)、肺水肿、脑或视觉症状。
高血压是一种疾病，若未经治疗，极易患上动脉粥样硬化性心血管疾病。据估计4位美国成年人中有1人患有高血压。在患有糖尿病的人中常见高血压大约为没有糖尿病的人的两倍。高血压的患病率随年龄增加。
顽固性高血压定义为血压高于目标值持续升高，尽管同时使用3种抗高血压药，在治疗方案中包括每一独特类别与利尿剂，且所有药物皆为目标剂量。顽固性高血压的患病率与冠状动脉疾病(CAD)风险因素数量相关联，包括心血管相关的合并症(例如心脏衰竭和左心室肥大)、糖尿病、中风、经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention)、外周血管疾病、肾功能不全、年龄和BMI。该情形可能与下列事实相关：大多数现有抗高血压药物主要靶向(1)肾素-血管紧缩素-醛固酮轴，(2)交感神经活性，及(3)内皮素信号传导路径，且以阻断这些信号传导路径起作用。缺少可积极减轻内皮功能障碍且改善顽固性高血压患者的血液动力的治疗。
不应在单次测量的基础上诊断高血压。初次升高的读数应以一周或更长时间内至少两次后续就诊来确认，高血压诊断需要平均舒张压为90mmHg或更高或收缩压为140mmHg或更高。在诊断患有糖尿病的人的高血压时要特别注意，因为血压可变性更高且单纯性收缩期高血压(isolated systolic hypertension)的可能性高得多。对于这些患者建议低于130/85mmHg的目标血压。
除了饮食的改变以外，可能需要药理治疗来控制妊娠期间或当个体发展出顽固性高血压或高血压危象时的高血压。可施用本发明的肽以降低动脉血压。另外，降低高血压的继发效应为减轻水肿和减少炎性渗出物体积。
含有本发明的肽的药物组合物用作心脏保护剂并且可共同施用以减轻心脏毒剂的毒性。此类药剂包括基于蒽环霉素的化疗，其包含施用包含蒽环霉素类抗生素化合物的治疗剂。蒽环霉素用于治疗各种癌症，包括白血病、淋巴瘤及乳癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。蒽环霉素的实例包括柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)。基于蒽环霉素的疗法的实例将为包含环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和强的松(prednisone)(CHOP)的疗法。
本发明的长效型ADM类似物可与蒽环霉素剂组合施用。在某些实施方案中，“与......组合”、“组合疗法”及“组合产物”是指向患者同时施用本发明的肽与蒽环霉素。当组合施用时，各组分可同时或在不同时间点以任何顺序相继施用。因此，各组分可单独，但是以足够接近的时间施用，以便提供所需疗效。或者，共同调配物可包括有效剂量的单一调配物中的每种活性剂。
“伴随施用”本发明所示的两种活性剂意指以两种药剂施用，使其具有疗。此类伴随施用可涉及在施用一种药剂的同时(亦即在相同的时间)、之前或之后施用其它药剂。本领域者的普通技术人员确定施用特定药物与本发明的组合物的适当时间、顺序及剂量没有任何困难。
用于人类患者的有效剂量可为约1nM/kg体重、5nM/kg体重、10nM/kg体重、15nM/kg体重、20nM/kg体重、25nM/kg体重、50nM/kg体重、100nM/kg体重、250nM/kg体重、500nM/kg体重等。所述剂量可根据需要分成多次施用的较小剂量，例如每30分钟、每小时、每2小时、每4小时、每6小时、每8小时、每12小时、每18小时、每天、每2天、每3天、每周等。所述剂量也可以连续输注施用，例如与蒽环霉素组合。
有效剂量可维持一段足以减轻心脏毒性的时间。治疗可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，例如1周、2周、3周、4周或更久。治疗可为连续性或间歇性，例如每隔一天、每三天、每周等等。
功效可通过测量心脏毒性的指标来监测，其中治疗可提供至少约10％的改善，至少约20％的改善，至少约30％的改善，至少约40％的改善，至少约50％的改善或更多。本文示例的一种生物标记为天冬氨酸氨基转移酶的循环含量。
蒽环霉素相关性心脏毒性来自累积剂量的药剂并且通常以心脏泵送中无症状的衰竭开始，可进展为心脏衰竭。可表现为心电图异常、不规则心跳、心包炎-心肌炎综合征(心肌或心包发炎)或脑利钠肽(BNP)增加，其为心脏充盈压增加的标记。心脏毒性的核成像检查治疗前及治疗期间的心脏功能，以确定是否需要进行剂量调整或探索其它替代治疗选择。常见的核医学心脏检查为放射性核素血管造影(RNA)。这种扫描测量以每次心跳自心室射出的血液量(射出分率)。例如，若每次心跳左心室射出其血容量的60％，则LVEF为0.6(正常值为0.5或更高)。
用于评估心脏毒性的其它生物标记包括但不限于测量血清肌酸酐激酶-MB(CKMB)；心肌肌钙蛋白(cTn)，包括高敏感性心肌肌钙蛋白(cTn)；C-反应性蛋白(CRP)；分泌的miRNA，例如miR-126-3p、miR-30c和miR-26a(除了miR-1、let-7和miR-133以外)；糖原磷酸化酶BB；可溶性CD40配体(sCD40L)；胆碱水平增加；ST2；内皮素-1(ET1)和内皮素原(pro-endothelin)-1的C端(CTproET1)；心肌型FABP(HFABP)为肌细胞损伤的敏感性标记；等等。
药物组合物
一些实施方案包括药物组合物，其包含本文所公开的作为活性成分的长效型CLR/RAMP受体激动剂或长效型ADM类似物(表1；包括但不限于D-氨基酸或拟肽物)联合药物载体或稀释剂。这些药物组合物可通过如本领域技术人员已知的任何方式施用，且该施用方式包括但不限于经口、肺、肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下注射)、吸入(经由细粉调配物或气雾剂)、透皮、鼻内或舌下施用途径，且该组合物可配制成适于每种施用途径的剂型。所述化合物也可呈缓释或控释剂型施用，包括但不限于积存注射液(depot injection)、渗透泵、透皮(包括电传导)贴片等，以按预定速率延长和/或定时、脉冲施用。
本发明实施方案的药物组合物可以其本身已知的方式生产，例如借助于常规的混合、溶解、造粒、制糖衣、研碎、乳化、胶囊化、截留或压片方法。依照本发明实施方案使用的药物组合物因此可以常规方式使用一种或多种生理上可接受的载体配制，所述载体包含有助于活性化合物加工成可于医药上使用的制剂的赋形剂和助剂。可如其所应使用且如本领域所理解的熟知技术、载体和赋形剂中的任一种。
适合用于组合物中的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水和乙醇。特定赋形剂是否适合并入药物组合物取决于本领域中熟知的各种因素，包括但不限于施用途径和组合物中的特定活性成分。在本发明的特定实施方案中，组合物为无水组合物。无水组合物可使用无水或含低水分的成分及低水分或低湿度条件制备。若预计在生产、包装及/或储存期间与水分及/或湿气有实质性接触，则包含具有伯胺或仲胺的经修饰肽的组合物优选为无水的。优选地，所述组合物也配制成提供化合物在储存和运输期间增加的化学稳定性。调配物可为冻干或液体调配物。
注射剂可以制备成常规形式，液体溶液或悬浮液，适于在注射前溶于液体中呈溶液或悬浮液的固体形式或制备成乳液。合适的赋形剂例如水、盐水、右旋糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸盐等。另外，如果需要，可注射药物组合物可含少量无毒辅助物质，例如润湿剂、pH缓冲剂等。生理上相容的缓冲液包括但不限于汉克氏溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液。如果需要，可以利用吸收增强制剂(例如脂质体)。
对于透粘膜施用，可于调配物中使用适于要渗透的屏障的渗透剂。
用于肠胃外施用(例如通过快速浓注或连续输注)的药物调配物包括活性化合物呈水溶性形式的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(诸如芝麻油)或其它有机油(诸如大豆油、葡萄柚油或杏仁油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以容许制备高浓缩溶液的试剂。用于注射的调配物可以呈单位剂型呈现，例如，在添加了防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。该组合物可以采取诸如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以呈粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如灭菌无热原水)复原。
对于通过吸入施用，根据本发明实施方案使用的本发明化合物是呈气雾喷雾剂表现形式，用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，自加压包或喷雾器方便地递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可由提供递送计量的阀决定。可配制在吸入器或吹入器中使用的例如明胶胶囊和盒，其含有化合物与合适粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。例如，用于吸入施用的制剂可根据Quay等美国专利第7,812,120B2号的教导制备。
本文进一步公开在药学领域中熟知的供包括眼内、鼻内和耳内递送在内的用途的各种药物组合物。适于这些用途的渗透剂通常为本领域中已知。用于眼内递送的药物组合物包括活性化合物的眼用水溶液，其呈水溶性形式，诸如眼滴剂，或呈洁冷胶(gellan gum)形式；眼用软膏；眼用悬浮液，诸如小微粒、悬浮在液体载剂介质中的含药物的小聚合物粒子、脂溶性调配物；及眼嵌入物。将以上提及的所有参考物通过引用整体并入本文。此类合适的药物调配物出于稳定性及舒适性而最常且优选地配制成无菌、等渗透性并且是含有缓冲剂的。用于鼻内递送的药物组合物还可包括滴剂及喷雾剂，常常将其制备成于多方面刺激鼻分泌以确保维持正常的纤毛作用，此类组合物包括例如但不限于由Azria等于美国专利第5,733,569号中所公开的鼻用溶液。用于耳内递送的药物调配物包括耳内局部施加的悬浮液及软膏。此类耳内调配物的常见溶剂包括甘油和水。
除了先前所述的调配物以外，本发明化合物还可配制成积存制剂。此类长效型调配物可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，所述化合物可以用合适的聚合或疏水性材料(例如配制成可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物，例如配制成微溶盐。
施用方法的非限制性实例尤其包括(a)通过非经口途径施用，诸如眼内、鼻内或耳内，该施用包括作为水性悬浮液、油性制剂等或作为滴剂、喷雾剂、油膏、软膏等施用；(b)经由皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮内、眼内等注射施用，包括输注泵递送；(c)局部施用(administration locally)，诸如通过颅内直接注射，例如通过积存植入；以及(e)区域性施用(administration topically)；本领域技术人员认为适于使本发明实施方案的肽与活体组织接触的方式。
本发明实施方案的药物组合物的实际调配物、施用途径和剂量可鉴于患者的状况由个别医师选择。通常，向患者施用的组合物的剂量范围可为约0.000001至100mg/kg患者体重。剂量可依患者需求在一天或多天期间给予单次或连续二次或多次。在化合物的人类剂量已就至少一些状况确立的情况下，本发明实施方案将使用那些相同的剂量或介于已确定的人类剂量的约0.1％与500％之间，更优选地介于约25％与250％之间的剂量。在未确立人类剂量的情况下，就像新发现的药物化合物那样，合适的人类剂量可由ED50或ID50值或自体外或体内研究所推导出的其它适当值(正如动物中通过毒性研究及功效研究所定量的)来推断。
在某些实施方案中，化合物或衍生物与一种或多种作为治疗方案的一部分的其它生物活性剂组合施用。在某些实施方案中，化合物或衍生物在施用一种或多种其它生物活性剂之前、同时或之后施用。在一个实施方案中，所述一种或多种其它生物活性剂与本文所述的化合物或衍生物于相同的药物组合物中施用。
在另一个实施方案中，化合物或衍生物可与一种或多种降低风险或治疗心血管疾病的其它化合物或组合物一起施用。降低风险或治疗心血管疾病的化合物或组合物包括但不限于抗炎剂、抗血栓形成剂、抗血小板剂、纤维蛋白溶解剂、血栓溶解剂、脂质还原剂、直接凝血酶抑制剂、抗Xa抑制剂、抗IIa抑制剂、糖蛋白IIb/IIIs受体抑制剂和直接凝血酶抑制剂。可与本文所述的化合物或衍生物组合施用的试剂的实例包括比伐卢定(bivalirudin)、水蛭素(hirudin)、水蛭素原(hirugen)、安吉马克斯(Aangiomax)、阿加曲班(agatroban)、PPACK、凝血酶适配体(thrombin aptamer)、阿司匹灵、GPIIb/IIIa抑制剂(例如因替瑞林(Integrelin))、P2Y12抑制剂、噻吩并吡啶、噻氯匹定(ticlopidine)和氯吡格雷(clopidogrel)。
虽然确切剂量是基于不同的药物(on a drug-by-drug basis)测定的，但是在大部分实例中可建立关于剂量的一些概括。成人患者的日剂量方案可为例如各活性成分在介于0.001mg与100mg之间的示例性范围或在介于0.005mg与5mg之间的示例性范围的静脉内、皮下或肌肉内剂量。在施用药学上可接受的盐的情况下，剂量可按游离碱计算。在一些实施方案中，组合物每天施用0.1至4次或作为单一急性剂量施用，例如以改善高血压。或者，如本文所述的组合物可以通过连续静脉内输注施用，优选剂量为各活性成分每天至多1000mg。如本领域技术人员所理解的，在某些情况下可能必须按超过或甚至远超过上述示例性剂量范围的量施用本文公开的肽，以便有效地且积极地治疗特具侵袭性的疾病或感染。在一些实施方案中，肽将在连续疗法期间施用，例如持续一周或更长，或持续数月或数年。
在局部施用或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。所施用的本发明组合物的量可取决于治疗的受试者、受试者重量、痛苦的严重性及施用方式。
本文所公开的化合物的功效及毒性可使用已知方法进行评价。此类研究的结果常预示在动物中，诸如在哺乳动物或更具体地说在人类中的功效。或者，特定化合物在动物模型，诸如在小鼠、大鼠、兔或猴子中的功效可使用已知方法测定。
可施用含所述化合物的组合物用于预防性及/或治疗性治疗。在治疗性应用中，按足以治愈或至少部分遏阻疾病及其并发症的症状的量向患有如上所述的疾病的患者施用组合物。适于实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”。
本文所述的组合物也可以通过例如Tice和Bibi的方法微胶囊化(在：Treatise onControlled Drug Delivery，编辑A.Kydonieus,Marcel Dekker,N.Y.1992，第315-339页中)。
本文所述的激动剂肽及拟肽物在以例如每天约0.01μg至约50mg/kg体重的示例性剂量范围施用时有效治疗CLR/RAMP受体介导的病状。采用的特定剂量是由治疗的特定病状、施用途径以及主治临床医师根据下列因素的判断来调整：诸如病状的严重性、患者的年龄和总体状况等。此类剂量可由本领域技术人员容易地测定。
对于肠胃外施用，可将肽联合药学上可接受的肠胃外媒介物配制成溶液、悬浮液或冻干粉末。此类媒介物的实例为水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人类血清白蛋白。也可使用脂质体及非水性媒介物，诸如不挥发性油。媒介物或冻干粉末可含有维持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)及化学稳定性(例如缓冲液和防腐剂)的添加剂。
化合物可呈时间型释放调配物施用，例如呈包括缓释聚合物的组合物施用。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸(PLG)、胶原、聚原酸酯、聚乳酸(PLA)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。用于制备此类调配物的许多方法通常为本领域技术人员已知。
实验
提出下列实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制作和使用本发明的完整公开内容和描述，并非旨在限制发明者视为其发明的内容范围且非旨在表示以下实验为进行的全部或唯一实验。已努力确保有关所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应对一些实验误差和偏差进行说明。除非另有说明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度是以摄氏度计且压力为大气压或接近大气压。
实施例1
肾上腺髓质素、中叶素及嵌合肾上腺髓质素/中叶素的修饰(表1)。在自动化肽合成仪上使用标准的固相Fmoc肽化学法合成肽(Fields GB,Noble RL.Solid phase peptidesynthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids.Int J Pept ProteinRes 35:161–214,1990)。经修饰肽是通过在肽合成期间掺入已与Fmoc保护的[C16]棕榈酸脂肪酸(Lys(PAL))缀合的赖氨酸残基来合成的。通过反相HPLC测定纯度，随后使用电喷雾电离质谱法进行表征。
实施例2
长效型CLR/RAMP受体激动剂对正常Sprague-Dawley大鼠及自发性高血压(SHR)大鼠
的血压影响
为了证明长效型CLR/RAMP受体激动剂于体内具有长效作用，我们测定了长效型ADM类似物(SEQ ID NO:2；在所有图中标记为稳定类似物)对装有仪表(instrumented)的妊娠大鼠的血液动力的影响。快速腹腔注射长效型稳定类似物(100纳摩尔/kg)导致正常妊娠Sprague Dawley大鼠中血压持续降低达4小时，而野生型ADM的降血压效应在2小时内消失(图1a)。另外，我们比较了长效型稳定类似物在妊娠Sprague Dawley大鼠及妊娠自发性高血压大鼠(SHR)中的降血压效应。如图1b所示，施用低剂量的长效型稳定类似物(30纳摩尔/kg)在妊娠Sprague Dawley大鼠中一致性地降低血压2小时。相反地，长效型稳定类似物的降血压效应在妊娠SHR大鼠中持续8小时以上(图1b)，表明长效型CLR/RAMP受体激动剂的有益效应在高血压病状下可能特别显著。总的来说，这些数据表明长效型CLR/RAMP受体激动剂对CLR/RAMP受体信号传导、内皮功能、血管完整性及体内血液动力具有持续影响。这种特征不仅容许在临床条件下较不频繁的配量，并且还增加了长效型CLR/RAMP受体激动剂的治疗指数。
实施例3
长效型稳定类似物在妊娠大鼠中对子宫灌注压减少(RUPP)诱发的先兆子痫的效应材料和方法
为了评价长效型稳定类似物用于治疗先兆子痫、顽固性高血压、高血压危象、血管缺血性损伤及妊娠高血压的效应，我们在子宫灌注压减少(RUPP)先兆子痫大鼠模型中测试了类似物。该模型最初由Dr.Joey P.Granger等进行描述(2000,Hypertension 37:1191-1195)。简言之，将妊娠期14天的重达200-250g的妊娠大鼠用戊巴比妥(pentobarbital)(40mg/kg，i.p.)麻醉。剃除下腹部区域的毛并用外科擦洗液(碘和酒精)擦拭皮肤。在中线产生3-cm皮肤切口。在中线切开后，分离下腹部主动脉并将银夹(0.203mm)放在髂分支点上方的主动脉周围。因为在妊娠期间经由子宫血流量适应性增加而发生流向胎盘的补偿性血流，所以将右侧及左侧子宫弧(uterine arcade)夹住(银夹，0.100mm)。将RUPP大鼠分成两组，并将装载盐水或长效型类似物的渗透性迷你泵(ALZET)植入上腹部。迷你泵是以1ul/小时的速率递送溶液。假妊娠大鼠用作正常对照。
用可吸收的编结手术缝合线封闭切口。在清醒后，经皮下给予动物0.1mg/kg的丁丙诺啡(buprenorphine)，每天一次持续三天。这些程序使妊娠期大鼠的子宫血流量减少>40％，并且引起高血压及胎儿宫内生长受限。
在治疗4天后，将所有大鼠麻醉并且插入导管以测量血压及心率。用戊巴比妥麻醉动物并将Mikro-tip导管(1.0F压力导管，Miller,Texas)放入右侧颈动脉中。插入后，将导管推进至主动脉中且在出现动脉压力曲线时停止。将Mikro-tip导管连接至Powerlab系统，并记录血压及心跳速率并保存在计算机中。另外，通过多普勒方法测定动脉收缩点以上及以下的血流速度。
完成血液动力测量(花费约0.5-1小时)后，使大鼠安乐死。获取胎儿、胎盘组织及心脏并单独秤重。
结果
在低剂量处理研究中，每只妊娠大鼠接受3.3μg/kg/h的长效型稳定类似物或盐水，持续四天。当与假对照相比时，RUPP对照大鼠具有显著增加的平均动脉压(假对照，102±3mmHg(N＝11)相对于RUPP对照，114±3mmHg(N＝10)；P＝0.04，图2a)。当RUPP大鼠以低剂量长效型稳定类似物处理时(RUPP稳定类似物组)，平均动脉压降低至107±4mmHg(N＝9)。然而，RUPP对照组与RUPP稳定类似物组间的差异并非统计学显著的。
假对照的平均胎盘重量为510±26mg(N＝11，图2b)。在RUPP对照组(193±43mg，N＝9)及RUPP稳定类似物组(301±46mg，N＝9)中胎盘重量显著降低。虽然用长效型类似物处理似乎使平均胎盘重量增加，但是差异仅在有意义的边界(P＝0.10)。
同样地，RUPP处理显著地降低了平均胎儿重量(假对照，1177±84mg(N＝11)相对于RUPP对照，378±136mg(N＝9)；图2b)。在RUPP稳定类似物组(577±166mg，N＝9)中胎儿重量也显著降低。在RUPP对照组与RUPP稳定类似物组间未观察到胎儿重量的差异。
在高剂量处理研究中，每只妊娠大鼠接受10μg/kg/h的长效型稳定类似物或盐水，持续四天。假动物的平均动脉压为97±1mmHg(图3a)，并且RUPP处理导致平均动脉压显著增加(RUPP对照，118±2mmHg)。长效型类似物处理显著地降低了妊娠大鼠中RUPP诱发的高血压(RUPP-ADE，93±5mmHg，P＝0.0002)。
RUPP处理也导致妊娠大鼠的心率显著增加(假对照，399±8次/分钟相对于RUPP对照，438±13次/分钟；P＝0.01；图3b)。类似于对平均动脉压的效应，长效型稳定类似物处理显著地降低RUPP诱发的心跳过速(RUPP-ADE，379±8次/分钟，P＝0.001)。
假对照的平均胎盘重量为470±24mg(图3c)，并且在RUPP对照大鼠中显著降低(125±18mg)。与对RUPP诱发的高血压及心跳过速的防护效应一致，长效型稳定类似物处理显著地增加RUPP大鼠的平均胎盘重量(RUPP-ADE，253±36mg；P＝0.007)。
同样地，RUPP处理使平均胎儿重量从假对照大鼠的1028±36mg降低至RUPP对照大鼠的192±44mg(图3d)。当RUPP大鼠用长效型稳定类似物处理时，平均胎儿重量显著增加(RUPP-ADE，483±92mg，P＝0.01)。
我们还测定了妊娠大鼠在四天实验期间的体重且记录体重变化。如图3e中所示，假对照平均增重40±4克，而RUPP对照大鼠平均减重25±8克。相反地，RUPP-ADE大鼠仅平均减重3±3克，显著少于RUPP对照大鼠的平均减重(P＝0.03)。
另外，在实验结束时我们测定了心脏重量。假对照的平均心脏重量为每克体重2.95±0.07mg(图3f)。RUPP处理导致心脏肥大，并且RUPP对照动物的平均心脏重量显著增加(RUPP对照组，每克体重为3.59±0.15mg，P＝0.002；图3f)，并且长效型稳定类似物处理显著减轻了RUPP诱发的心脏肥大(RUPP-ADE，每克体重为3.16±0.06mg，P＝0.02；图3f)。
作为对照，我们还测量了在动脉收缩点以上及以下的血流速度，以监测动物间的子宫灌注减少程度。正如预期的，在三个处理组间未观察到在收缩点以上的血流速度差异(图3g)。相反地，收缩点以下的血流速度在RUPP对照及RUPP-ADE动物中均降低50％以上。重要地，收缩点以下的血流速度在RUPP对照及RUPP-ADE组中几乎相同，表明RUPP对照组与RUPP-ADE组间所观察的生理变化不是手术治疗差异的结果。
实施例4
长效型稳定类似物在成年小鼠中对多柔比星诱发的心脏衰竭的效应
材料和方法
为了评价长效型稳定类似物对心脏衰竭的效应，我们用多柔比星(10mg/kg体重)处理8周龄C57/B6小鼠以诱发心肌症。在注射多柔比星后，为动物注射野生型ADM或长效型稳定类似物，每天两次。处理五天后，处死动物并收集心脏以单独测定重量。另外，我们收集血液样品以测定天冬氨酸氨基转移酶活性。相同年龄的假成年小鼠用作正常对照。
结果
在实验第六天，假对照的平均心脏重量为11.4±0.6mg。当用多柔比星处理动物时，平均心脏重量减少至9.3±0.4mg(对照组相对于多柔比星组，P＝0.01，图4a)。另一方面，当动物用长效型稳定类似物(即稳定类似物)共同处理时，则显著地减少了经多柔比星诱发的心脏重量损失(多柔比星+稳定类似物组，11.0±0.6mg；P＝0.03)。接受多柔比星加上野生型ADM的动物的心脏重量损失也减少；然而，减少并非统计学显著的(多柔比星组相对于多柔比星+ADM组，P＝0.07)。
在一系列单独研究中，我们评价了稳定类似物对血液天冬氨酸氨基转移酶含量的影响(图4b)。当与对照小鼠相比时，多柔比星处理显著地升高天冬氨酸氨基转移酶水平(对照组，50±7.2U/升相对于多柔比星小鼠，300.7±33.6U/升；P＝0.00009)，而用高剂量的长效型稳定类似物共同处理显著地降低小鼠中经多柔比星诱发的肝毒性(多柔比星+稳定类似物，50nM/Kg体重(BW)；200.1±10.0U/升；P＝0.03)，而用低剂量的长效型稳定类似物(25nM/Kg BW)处理不具有统计学上显著的效应。这些数据表明长效型稳定类似物对多种器官具有保护效应。
本说明书中引用的所有公开案和专利申请案均通过引用并入本文，如同特别且单独地指出将每个单独的公开案或专利申请通过引用并入一样。
本发明已根据本发明人所发现或提出的特定实施方案描述以包含用于本发明实践的优选模式。本领域的技术人员将认识到依照本公开可在示例的特定实施方案中进行许多修改和变化，而不脱离本发明的预期范围。而且，由于生物功能的等同性考虑，可在蛋白质结构上进行改变而不在种类及量上对生物作用产生影响。旨在将使所有此类修改包括在所附权利要求的范围之内。
序列表
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Hsu, Sheau Yu Teddy
<120> 长效型CLR/RAMP激动剂的配量和用途
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<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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Ser Ser Pro His Ser Tyr
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Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
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Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Ser Ala Pro Val Asp Pro
20 25 30
Ser Ser Pro His Ser Tyr
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
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<221> MOD_RES
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<400> 22
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Ser Ala Pro Val Asp Pro Ser
20 25 30
Ser Pro His Ser Tyr
35
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> BLOCKED
<400> 23
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Ser Ala Pro Val Asp Pro Ser Ser
20 25 30
Pro His Ser Tyr
35
<210> 24
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 酰胺化
<400> 24
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Pro Ala Gly Arg Gln Asp Ser Ala Pro Val Asp
20 25 30
Pro Ser Ser Pro His Ser Tyr
35
<210> 25
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 酰胺化
<400> 25
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Val Asp
20 25 30
Pro Ser Ser Pro His Ser Tyr
35
<210> 26
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 酰胺化
<400> 26
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Gln Asp Ser Ala Pro Val Asp
20 25 30
Pro Ser Ser Pro His Ser Tyr
35
<210> 27
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 酰胺化
<400> 27
Lys Gly Cys Val Leu Gly Thr Cys Gln Val Gln Asn Leu Ser His Arg
1 5 10 15
Leu Trp Gln Leu Met Gly Pro Ala Gly Arg Gln Asp Ser Ala Pro Val
20 25 30
Asp Pro Ser Ser Pro His Ser Tyr
35 40
<210> 28
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 酰胺化
<400> 28
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Ser Ala Pro Val Asp Pro Ser Ser
20 25 30
Pro His Ser Tyr
35
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 酰胺化
<400> 29
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser
20 25 30
Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
35
<210> 30
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> 酰胺化
<400> 30
Lys Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr
1 5 10 15
Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys
20 25 30
Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
35 40 45
<210> 31
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 酰胺化
<400> 31
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Asp Pro Ser Ser
20 25 30
Pro His Ser Tyr
35
<210> 32
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 其它特征
<222> (1)..(1)
<223> 残基经11-氨基-3,6,9-三氧杂十一酸修饰
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 酰胺化
<400> 32
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
20 25 30
Pro Gln Gly Tyr
35
<210> 33
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 酰胺化
<400> 33
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
20 25 30
Pro Gln Gly Tyr
35
<210> 34
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 脂质
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酸盐
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> 酰胺化
<400> 34
Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Ala Pro Val Asp Pro Ser Ser Pro
20 25 30
His Ser Tyr
35

Claims (18)

1.一种降低高血压、高血压危象、缺血性损伤及内皮功能障碍的方法，所述方法包括：
对个体施用至少约0.5μg/kg体重的剂量的长效型CLR/RAMP受体激动剂达一段足以使平均动脉压降低至少5％的时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述施用为肠胃外或吸入。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述施用是经皮下注射或连续输注。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述剂量为从约0.5μg/kg体重至约1mg/kg体重的日剂量。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述高血压是妊娠-、内皮功能障碍-或缺血-相关的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述高血压为子癫前症、顽固性高血压、难治性高血压、高血压危象或特发性肺动脉高压。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述缺血为子癫前症、中风、心肌梗塞、外周动脉狭窄、肾衰竭、糖尿病性溃疡或颈动脉狭窄。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述长效型CLR/RAMP受体激动性肽为通过脂肪酸与所述序列缀合而修饰的生物活性人类肾上腺髓质素、中叶素或嵌合肾上腺髓质素/中叶素肽，其中所述经修饰的肽具有大于1.5小时的抗高血压效应。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述长效型CLR/RAMP受体激动剂由如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3-34所示的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述CLR/RAMP受体激动剂与SEQ ID NO:2或SEQID NO:3-34的氨基酸序列具有大于60％的序列同一性。
12.一种用于降低心脏毒性的方法，所述方法包括：
对个体施用至少约0.5μg/kg体重的剂量的长效型CLR/RAMP受体激动剂达一段足以降低心脏毒性的时间。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述心脏毒性与蒽环霉素或酪氨酸激酶受体拮抗剂的施用相关。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述蒽环霉素为多柔比星。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述CLR/RAMP受体激动剂与多柔比星共同施用。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述肽为通过脂肪酸与氨基酸序列缀合而修饰的生物活性CLR/RAMP受体激动剂，其中所述经修饰的肽具有大于1.5小时的心脏保护效应。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述CLR/RAMP受体激动剂如由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3-34所示的氨基酸序列组成。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述CLR/RAMP受体激动剂与SEQ ID NO:2或SEQID NO:3-34的氨基酸序列具有大于60％的序列同一性。
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