CN109453181A - 一种对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药学技术领域，公开了一种对D‑GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物,对D‑GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物为胡萝卜苷。本发明表明，胡萝卜苷具有抗炎及免疫调节的活性；在治疗患有播散性念珠菌病的小鼠时，胡萝卜苷会促使CD4+T细胞产生帮助小鼠抵抗播散性念珠菌病；氨基半乳糖联合脂多糖诱导诱导的肝损伤小鼠模型常用来分析脓毒血症性肝损伤；本发明拟用胡萝卜苷干预D‑GaIN/LPS诱导的肝损伤小鼠模型，探究胡萝卜苷对D‑GaIN/LPS诱导的肝损伤的保护作用及可能机制，对治疗脓毒血症的药物分析具有重要意义。

Description

一种对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物

技术领域

本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

脓毒血症由感染(细菌、病毒、真菌等)所导致的破坏性的全身炎症反应，导致机体免疫系统、凝血/纤溶系统、代谢及微循环障碍，最终可诱发多器官功能障碍损伤和脓毒血性休克的临床症候群。脓毒症发病率高、病死率高，是ICU 中常见的危重症之一，已成为患者的第三大致死原因。全球每年平均约有超过 1800万严重脓毒症病例，在美国每年大约有70万脓毒症患者，并导致超过20 万患者死亡；中国每年大约有将近300万脓毒血症新发病例。脓毒血症的治疗成本较高，医疗资源消耗很大，严重影响患者的生命健康和生活质量，因此，脓毒血症已经成为社会公共卫生事业面临的重大难题。

多器官功能衰竭是脓毒症的主要临床表现之一，也是其致死原因。肝脏是脓毒症过程中最易受损的器官之一，因其特殊生理功能，肝功能损伤又能够诱发或者加重其他脏器损伤或者功能衰竭。脓毒血症急性肝损伤可发生在脓毒血症的任何阶段，是病情进入多脏器功能障碍的重要标志。彭慧云等的分析表明严重脓毒血症中肝功能异常的发生率为52.7％，肝损伤严重程度加重，患者的病死率增加，肝损伤达重度时患者的病死率可高达81.3％。崔金玲等通过分析则表明肝功能障碍是脓毒血症独立的死亡危险因素。还有分析表明严重肝损伤所致的低蛋白血症和凝血功能障碍是脓毒血症患者死亡的重要危险因素。资料显示，血浆白蛋白水平越低，病死率越高，严重脓毒血症时，肝损伤后肝脏合成能力下降，会使机体出现低蛋白血症。同时，肝脏损伤后机体凝血因子合成不足，也会导致机体凝血功能障碍。脓毒血症所引起的肝损害不但可以加重全身病情的发展，而且直接影响其预后。有分析表明，早期肝功能障碍是脓毒血症死亡的一项独立的预警因素，超过循环、肾脏、中枢神经系统等对死亡预警的作用，因此尽早改善肝功能有助于改善患者预后，及早的护肝治疗对脓毒血症预后具有重要意义。总之，肝脏对严重脓毒血症的发生、发展和预后有至关重要的作用，因此对于脓毒血症的治疗，抗感染的同时减轻肝损伤至关重要。

肝脏的具有重要免疫功能，肝细胞会能够对入侵的细菌及其产物进行捕捉和清除，促使多种促炎因子产生，包括TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6等，引发严重的炎症反应。这些炎症因子可参与机体局部及全身炎症反应，介导免疫细胞的增殖分化，发挥免疫调节作用，加重器官损害。分析表明TNF-α参与了肝坏死的发生，在急性免疫性肝坏死动物模型中，TNF-α的mRNA表达水平明显升高：IL-6常被作为脓毒症的早期诊断标志物，其可预测脓毒血症发生后28d 患儿的生存情况；炎症因子的释放可引发半胱天冬酶级联反应导致肝细胞凋亡。确切的说，TNF-α与其受体结合，会通过Fas相关蛋白招募和裂解caspase-8，然后裂解的caspase-8会激活caspase-9，最后两者共同激活caspase-3导致肝细胞凋亡。在促炎因子的作用下，激活的巨噬细胞和中性粒细胞会产生大量的 ROS，从而加速肝细胞坏死。在这个过程中，脂多糖的诱导炎症的效果和 JAK/STAT通路紧密相连，该通路能够对内毒素血症和炎症进行调节。SOCS是对JAK/STAT通路进行负反馈调节的关键因子，能够有效地调节促炎因子和炎症反应。

对于脓毒血症的治疗以减缓病情进展，降低死亡率为目的，目前尚未有明显有效的治疗的方法，围绕脓毒血症治疗的每个环节几乎都存在争议。常用的治疗手法有以下几类：①早期抗感染治疗。及早清创引流和使用广谱抗菌药物，越早越好。一项回顾性分析发现，随着抗菌药物给药的延迟增加，患者的病死率也随之增加。SSC最新指南建议在识别严重脓毒血症或脓毒性休克后一小时内施用有效的静脉内抗菌药物最佳，但因个体差异性广谱抗菌药物的药效不尽人意，同时光谱抗菌药物也杀死了机体许多正常菌群，使机体抵抗力下降，容易并发其他病症。②复苏术。早期液体复苏可使脓毒性休克病死率下降，但液体种类和复苏体积仍存在争议。③糖皮质激素。作为最早用来治疗脓毒血症的药物，小剂量可以有效地防止脓毒血症引起的休克反应，提高生存率，而大剂量使用会使免疫抑制，可能引起继发感染。④免疫球蛋白。大剂量免疫球蛋白的应用可能会提高脓毒血症患者生存率，但其价格较为昂贵。⑤胰岛素治疗。高血糖与胰岛素抵抗在危重病患者中很常见,包括脓毒症,即使该患者没有糖尿病的基础，因此脓毒血症要加强胰岛素治疗，但同时会有低血糖反应、屈光不正、水肿、过敏反应、注射部位皮下脂肪萎缩、胰岛素抗药性等不良反应。⑥调节凝血功能。凝血系统活化是脓毒性休克发展进程中的一个重要的环节，现有药物为内源性C蛋白(APC)，具有抗血栓形成、抗感染和促纤维蛋白溶解的作用，但其同时因为阻断凝血瀑布反应从而增加内出血的概率。⑦血液净化术。血液净化可通过清除细胞因子协助体内毒物的排除，维护内皮细胞的稳定，提高机体含氧量，起到保护主要脏器的作用。但是血液灌流/血液吸附会有凝血、低血压或高血压的危险；高通量血液滤过它需要大量的超纯级别的替代溶液，需要较高的治疗费用，增加严重电解质紊乱的风险，以及增加护理工作量；高截留血液透析/血液滤过主要截留40kDa～100kDa分子量的蛋白，并不能达到很好的炎症因子清除效果，并且会丢失球蛋白(66kDa)、抗凝血酶III(60kDa)、蛋白C(62kDa)以及其他重要血浆蛋白；血浆置换/匹配血浆过滤吸附丢失大量的球蛋白、纤维蛋白原、抗凝素酶和免疫球蛋白等重要蛋白，治疗后需要花长时间的纠正。此外血液净化术的费用皆较一般药物治疗高，还需要专业的技术人员操作，在经济落后的地区无法开展。

综上所述，加强对脓毒血症病因及治疗的探索，综合利用中医和西医的各自优势，对治疗脓毒血症的药物或治疗措施加以分析具有重要意义。近年来中医学界运用中医药治疗脓毒症，深入探讨其致病机理，开拓出了新的治疗理念和思路，但多以方剂和单位药为主，限于中药提取技术的掣肘，对单体化合物的分析报道很少，包括槲皮素、姜黄素、苦参素、人参多糖、白芍总苷，且仅初步证明了上述药物的抗炎或者调节免作用，并未对其中的机制进行进一步探讨，目前尚未有胡萝卜苷脓毒血症性肝损伤治疗作用的报道。当今世界新药已从化合物合成转向天然药物开发，而我国幅员辽阔，中草药资源丰富，价格低廉，加快中草药及其单体化合物的分析，使其标准化、质量化的应用于临床迫在眉睫。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)临床常用治疗药物如广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫球蛋白、胰岛素、调节凝血功能类药物用药个体差异性大，药物副作用明显，因此病人的耐受性和依从性不好。且免疫球蛋白、胰岛素、调节凝血功能类药物价格偏高，带给患者的经济负担较大。

(2)其他辅助治疗手法如复苏术液体种类和复苏体积仍存在争议，尚未量化；血液净化术或效果达不到预期或副作用明显，医疗成本较大；且上述技术的费用较高，还需要专业的技术人员操作，在基层和经济落后的地区无法开展。

(3)中医药治疗脓毒症多以方剂和单位药为主，限于中药提取技术的掣肘，对单体化合物的分析报道很少，且仅初步证明了药物的抗炎或者调节免作用，并未对其中的机制进行进一步探讨。

解决上述技术问题的难度和意义：

解决上述问题有诸多困难，优化药物疗效、减少药物不良反应面临的技术难度较大，分析开发的局限性引起药物大规模使用后产生安全问题；临床使用不规范引起制剂有效性和安全性问题；血液净化术等外科操作研发成本较高，待解决的技术问题很多，且在操作上需要专业技术人员支持。解决上述问题又需庞大资金支持，继而增加治疗成本，加剧患者和社会的经济负担。

本发明拟用胡萝卜苷干预D-GaIN/LPS诱导的肝损伤小鼠模型，探究胡萝卜苷对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤的保护作用及可能机制，对治疗脓毒血症的药物分析具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物。

本发明是这样实现的，一种对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物，所述对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物以胡萝卜苷为活性成分。

胡萝卜苷为活性成分的药物，直接用胡萝卜苷治疗D-GaIN/LPS诱导的肝损伤动物模型。

胡萝卜苷购买于上海源叶生物，英文名称：Daucosterol，分子式：C₃₅H₆₀O₆，分子量：576.85，产品编号B20517，分析标准品，HPLC≥98％，CAS号：474-58-8。

本发明的另一目的在于提供一种验证所述对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物药效的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：

建模和给药：

48只19-21g健康的雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，包括正常对照组、

模型组、正常给药组和治疗组；正常组和正常给药组小鼠注生理盐水，模型组和治疗组小鼠建立急性肝损伤模型；

正常给药组和治疗组灌胃胡萝卜苷一次，对照组、模型组、小鼠灌胃生理盐水；随后，每过半个小时对每组小鼠的数量进行记录；

6个小时后，活着的小鼠用戊巴比妥钠麻醉；在血液收集的1个小时内，血清被离心分离出来贮存在-20℃，备用；

一部分小鼠肝脏用10％的福尔马林浸泡，另一部分贮存在-80℃用来提取蛋白；在处理前，每只小鼠称重，取出的肝脏称重。

进一步，所述动物模型构建方法进一步包括：

染色：

小鼠肝组织的切片用光学显微镜进行分析；用10％的福尔马林固定组织标本、制作蜡块、切片和染色；并采集图像；

进行生化指标：

血清ALT和AST的含量按照试剂盒的操作说明测定；血清从普通抗凝管中的血液样品离心分离后，收集；然后，在全自动生化分析仪下，用试剂盒分析血清中ALT和AST的含量；

进行ELISA测定血清中的蛋白水平：

ELISA试剂盒的板上的每个孔加入100μL血清样本,然后在37℃下孵化2 小时，随后每个孔中装入工作液，在室温下再孵育1小时；添加底物液后需添加停止液来终止反应；最后，在492nm波长下用分光光度计读取吸光度。

进一步，所述动物模型构建方法进一步包括：

Western blot分析：

把0.1g的肝组织磨碎后，加入RIPA buffer和PMSF裂解细胞；离心后,把收集到的上层清液加入上样缓冲液在95℃下煮10分钟；随后,20μg样本分步进行凝胶电泳和转移到PVDF膜；随后，用5％脱脂牛奶在室温下封闭膜3小时； PVDF膜上的目的蛋白和一次抗体在4℃过夜孵育；

用TBS-T缓冲液冲洗三次后，随后用兔Ig G抗体作为二次抗体孵育PVDF 膜，2小时后用TBS-T缓冲液冲洗三次；

最后，利用自动显影机对膜进行成像；以β-Actin作为内参，用Quantity one 4.6软件对数据进行分析。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物制备的用于治疗脓毒血症的胡萝卜苷注射药剂。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

胡萝卜苷是一种广泛分布在多种传统中药中的甾体化合物，已经能够人工合成。分析表明，甾体化合物具有抗肿瘤、抗纤维化、抑菌、抗炎及免疫调节等广泛的生理和药理活性。有资料表明胡萝卜苷可抑制人肝癌细胞株HepG2增殖；对CCl₄引起的肝损伤有保护作用；在治疗患有播散性念珠菌病的小鼠时，会促使CD4+T细胞产生Th1dominant cytokine帮助小鼠抵抗播散性念珠菌病。目前尚未有胡萝卜苷治疗脓毒血症的分析报道。分析表明，细菌外膜中的脂多糖是脓毒性休克最重要的启动因子。革兰阴性菌感染引起的LPS释放和肠源性 LPS易位是导致脓毒症的重要因素。LPS可激活单核吞噬细胞系统产生大量炎症因子从而攻击全身多个脏器，致其损害。作为核苷酸干扰剂的D-氨基半乳糖 (D-galactosamine，D-GalN)，可影响肝细胞合成尿苷三磷酸，引起肝细胞炎症和弥漫性坏死。肝细胞受损，肝脏对LPS的解毒能力显著降低，肝毒性增强。此外，LPS还可激活补体和凝血纤溶系统，直接导致肝损伤；D-GalN一方面可消耗磷酸尿苷，抑制核酸、糖蛋白、脂类等的合成，继而限制细胞器、酶，细胞膜等的合成，使肝细胞损伤。另一方面还可刺激肥大细胞脱颗粒释放组织胺，使肠管浮肿通透性增加，加巨LPS的吸收。因此，选择联合LPS与D -GalN建立稳定的与临床发病情况类似的脓毒血症性肝损伤的动物模型，为分析胡萝卜苷对脓毒血症性肝损伤的保护作用奠定基础。本发明拟用胡萝卜苷干预D-GaIN/LPS诱导的肝损伤小鼠模型，探究胡萝卜苷对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤的保护作用及可能机制，为揭示中药保护脓毒血症肝损伤的作用机制和靶点，中药组方及新制剂发展分析提供了分析证据，对治疗脓毒血症的药物分析具有重要意义。

本发明验证的效果有：胡萝卜苷能够延长生存时间和降低肝系数：在这项分析中，与对照组的小鼠相比，D-GalN/LPS组的小鼠鼠遭受了严重的肝损伤，在注射500mg/kg D-GalN和10μg/kg LPS后的6小时内大量死亡。与D-GalN/LPS 组小鼠相比，经过50mg/kg剂量的胡萝卜苷治疗，能延长生存时间，降低死亡率(P<0.05)(图2A)。根据肝脏指数的结果，Control组和D-GalN/LPS组之间存在显著差异，提示D-GalN/LPS可导致肝肿大，而使用50mg/kg胡萝卜苷治疗可以显著缓解小鼠的D-GalN/LPS诱导的肝肿大(P<0.01)(图2B)。这些初步确定 50mg/kg的胡萝卜苷处理能够有效保护小鼠免受D-GaIN/LPS诱导的损伤。

胡萝卜苷能够改善肝脏的病理学表现：在100倍和400倍的视野下，Control 组肝小叶结构和肝细胞形态结构均正常。相比之下，由于D-GalN/LPS的注射，镜下D-GalN/LPS组肝脏组织的严重弥漫性水肿、充血，嗜中性粒细胞和巨噬细胞大量浸润。然而，与D-GaIN/LPS组相比，50mg/kg剂量的胡萝卜苷可以避免肝脏损伤，能够显著改善肝脏组织的弥漫性水肿、充血，减少嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润(图3)。

胡萝卜苷能够降低血清中ALT和AST活性：血清ALT和AST水平是评价肝功能的公认指标。与Control组小鼠相比，D-GaIN/LPS组组小鼠血清ALT 和AST水平显著升高(P<0.01)。用50mg/kg剂量的胡萝卜苷处理的小鼠血清 ALT和AST水平显示明显降低(P<0.01)。结果表明，胡萝卜苷可降低血清ALT 和AST水平，改善肝功能(图4A和4B)。

胡萝卜苷能够抑制肝脏产生促炎因子：TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6是重要的促炎因子,会造成炎症和损伤。与对照组的小鼠相比,D-GaIN/LPS组小鼠的 TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平显著增加(P<0.01)。另一方面,经过50mg/kg 剂量的胡萝卜苷治疗后,TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平显著降低(P<0.01)。因此，胡萝卜苷可以缓解肝细胞的炎症反应，降低促炎因子水平(图5A,5B,5C,5 D)。

胡萝卜苷能够下调凋亡蛋白的表达：对各组肝细胞凋亡的差异进行检测。与对照组相比，D-GaIN/LPS诱导的损伤肝组织的Fas、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的表明显增加达(P<0.01)。此外，与D-GaIN/LPS组相比，50mg/kg剂量的胡萝卜苷治疗可下调Fas、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的表达(P<0.01)(图6A、6B、6C、6D、6E)。因此，胡萝卜苷对D-GaIN/LPS诱导的肝细胞凋亡具有抑制作用。

胡萝卜苷能够干涉JAK2/STAT3信号通路的激活：为进一步理解胡萝卜苷对D-GaIN/LPS诱导的急性肝损伤中的保护机制，试验中发现胡萝卜苷对 JAK/STAT信号通路具有调控作用。与对照组相比，D-GaIN/LPS诱导的肝组织中TLR4、p-JAK2、p-STAT3的表达明显增高(P<0.01)，并伴随显著下调SOCS-3 (P<0.01)。与D-GaIN/LPS组相比，在50mg/kg剂量胡萝卜苷治疗下，可下调TLR4、p-JAK2、p-STAT3的表达(P<0.01)，并伴随SOCS-3显著上调(P<0.01)(图 7A、7B、7C、7D、7E)。胡萝卜苷可通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活来降低促炎因子的水平，从而减弱D-GaIN/LPS引起的肝损伤。

综上所述，本分析首次证实胡萝卜苷能够减少肝细胞凋亡，抑制体内炎症反应，对D-GaIN/LPS诱导的急性肝损伤具有保护作用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的动物模型构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的与D-GalN/LPS组小鼠相比，经过50mg/kg剂量的胡萝卜苷治疗，能延长生存时间，降低死亡率(P<0.05)图。

图3是本发明实施例提供的与D-GaIN/LPS组相比，50mg/kg剂量的胡萝卜苷可以避免肝脏损伤，能够显著改善肝脏组织的弥漫性水肿、充血，减少嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润图。

图4是本发明实施例提供的胡萝卜苷可降低血清ALT和AST水平，改善肝功能图。

图5是本发明实施例提供的胡萝卜苷可以缓解肝细胞的炎症反应，降低促炎因子水平图。

图6是本发明实施例提供的与D-GaIN/LPS组相比，50mg/kg剂量的胡萝卜苷治疗可下调Fas、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 的表达(P<0.01)图。

图7是本发明实施例提供的与D-GaIN/LPS组相比，在50mg/kg剂量胡萝卜苷治疗下，可下调TLR4、p-JAK2、p-STAT3的表达(P<0.01)，并伴随SOCS-3 显著上调(P<0.01)图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

氨基半乳糖联合脂多糖诱导(D-GaIN/LPS)诱导的肝损伤小鼠模型常用来分析脓毒血症性肝损伤。目前尚未有胡萝卜苷治疗脓毒血症的分析报道。

本发明实施例提供的对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物，所述对 D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物以胡萝卜苷为活性成分。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

如图1，本发明实施例提供的动物模型构建方法包括：

S101：建模和给药：48只19-21g健康的雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，包括正常对照组、模型组、正常给药组和治疗组；正常组和正常给药组小鼠注生理盐水，模型组和治疗组小鼠建立急性肝损伤模型；正常给药组和治疗组灌胃胡萝卜苷一次，对照组、模型组、小鼠灌胃生理盐水；随后，每过半个小时对每组小鼠的数量进行记录；6个小时后，活着的小鼠用戊巴比妥钠麻醉；在血液收集的1个小时内，血清被离心分离出来贮存在-20℃，备用；一部分小鼠肝脏用10％的福尔马林浸泡，另一部分贮存在-80℃用来提取蛋白；在处理前，每只小鼠称重，取出的肝脏称重。

S102：染色：小鼠肝组织的切片用光学显微镜进行分析；用10％的福尔马林固定组织标本、制作蜡块、切片和染色；并采集图像；

S103：进行生化指标：血清ALT和AST的含量按照试剂盒的操作说明测定；血清从普通抗凝管中的血液样品离心分离后，收集；然后，在全自动生化分析仪下，用试剂盒分析血清中ALT和AST的含量；

S104：进行ELISA测定血清中的蛋白水平：ELISA试剂盒的板上的每个孔加入100μL血清样本，然后在37℃下孵化2小时，随后每个孔中装入工作液，在室温下再孵育1小时；添加底物液后需添加停止液来终止反应；最后，在492 nm波长下用分光光度计读取吸光度。

S105：Western blot分析：把0.1g的肝组织磨碎后，加入RIPA buffer和PMSF 裂解细胞；离心后,把收集到的上层清液加入上样缓冲液在95℃下煮10分钟；随后，20μg样本分步进行凝胶电泳和转移到PVDF膜；随后，用5％脱脂牛奶在室温下封闭膜3小时；PVDF膜上的目的蛋白和一次抗体在4℃过夜孵育；用TBS-T缓冲液冲洗三次后，随后用兔Ig G抗体作为二次抗体孵育PVDF膜， 2小时后用TBS-T缓冲液冲洗三次；最后，利用自动显影机对膜进行成像；以β-Actin作为内参，用Quantity one 4.6软件对数据进行分析。

下面结合具体实验对本发明作进一步描述。

材料和方法

1)动物

体重在19-21g健康的雄性C57BL/6小鼠购买自北京维通利华有限公司。在实验开始前，小鼠将会在通风良好的环境中适应性喂养一周。小鼠的喂养和使用得到湖北民族学院伦理学会的许可。

2)建模和给药

48只小鼠随机分为4组(每组12只)，包括正常对照组、模型组、正常给药组和治疗组。正常组和正常给药组小鼠将会腹腔注射生理盐水，而模型组和治疗组小鼠将会腹腔注射D-GaIN(500mg/kg)和LPS(10μg/kg)建立急性肝损伤模型。完成的腹腔注射后，正常给药组和治疗组将会灌胃胡萝卜苷(50mg/kg)一次，对照组、模型组、小鼠灌胃生理盐水。随后，将会每过半个小时对每组小鼠的死亡数量进行记录。

6个小时后，活着的小鼠用戊巴比妥钠麻醉，在处死时，血液会直接被收集。在血液收集的1个小时内，血清会被离心分离出来贮存在-20℃，直到分析时才会取出。所有的小鼠都会被解剖取出肝脏用来分析。一部分肝脏会被10％的福尔马林浸泡，另一部分会被贮存在-80℃用来提取蛋白。在处理前，每只小鼠的都会称重，解剖后取出的肝脏也会称重。

3)H&E染色

小鼠肝组织的切片会用光学显微镜进行观察。这个过程包括10％的福尔马林固定组织标本、制作蜡块、切片和染色。切片是在光学显微镜进行病理学评价，并在100倍和400倍的视野下采集图像。

4)生化指标

血清ALT和AST的含量是按照试剂盒的操作说明来测定。血清从普通抗凝管中的血液样品离心分离出来后，将会被收集。然后，在全自动生化分析仪帮助下，用试剂盒分析血清中ALT和AST的含量。

5)ELISA

ELISA试剂盒来自武汉博士德生物有限公司。根据说明书使用ELISA试剂盒测定血清中的蛋白水平。简言之,板上的每个孔加入100μL血清样本,然后在 37℃下孵化2小时，随后每个孔中装入工作液，在室温下再孵育1小时。添加底物液后需添加停止液来终止反应。最后，在492nm波长下用分光光度计读取吸光度。

6)Western blot

把约0.1g的肝组织磨碎后，加入RIPA buffer和PMSF裂解细胞。离心后, 把收集到的上层清液加入上样缓冲液在95℃下煮10分钟。随后,20μg样本分步进行凝胶电泳和转移到PVDF膜。随后，用5％脱脂牛奶在室温下封闭膜3小时。 PVDF膜上的目的蛋白和一次抗体在4℃过夜孵育。用TBS-T缓冲液冲洗三次后，随后用兔Ig G抗体作为二次抗体孵育PVDF膜，2小时后用TBS-T缓冲液冲洗三次。最后，利用自动显影机对膜进行成像。以β-Actin作为内参，用Quantity one 4.6软件对数据进行分析。

下面结合实验效果对本发明作进一步描述。

本发明验证的效果有：胡萝卜苷能够延长生存时间和降低肝系数：在这项分析中，与Control组的小鼠相比，没有造模只灌服胡萝卜苷组的小鼠肝脏无明显差异，而D-GalN/LPS组的小鼠鼠遭受了严重的肝损伤，在注射500mg/kg D-GalN和10μg/kg LPS后的6小时内大量死亡。与D-GalN/LPS组小鼠相比，经过50mg/kg剂量的胡萝卜苷治疗，能延长生存时间，降低死亡率(P<0.05)(图 2A)。根据肝脏指数的结果，Control组和D-GalN/LPS组之间存在显著差异，提示D-GalN/LPS可导致肝肿大，而使用50mg/kg胡萝卜苷治疗可以显著缓解小鼠的D-GalN/LPS诱导的肝肿大(P<0.01)(图2B)。这些初步确定50mg/kg的胡萝卜苷处理能够有效保护小鼠免受D-GaIN/LPS诱导的损伤。

胡萝卜苷能够改善肝脏的病理学表现：在100倍和400倍的视野下，Control 组和没有造模只灌服胡萝卜苷组的小鼠肝小叶结构和肝细胞形态结构正常，相比之下，由于D-GalN/LPS的注射，镜下D-GalN/LPS组肝脏组织的严重弥漫性水肿、充血，嗜中性粒细胞和巨噬细胞大量浸润。然而，与D-GaIN/LPS组相比， 50mg/kg剂量的胡萝卜苷可以避免肝脏损伤，能够显著改善肝脏组织的弥漫性水肿、充血，减少嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润(图3)。

胡萝卜苷能够降低血清中ALT和AST：活性血清ALT和AST水平是评价肝功能的公认指标。与Control组小鼠相比，没有造模只灌服胡萝卜苷组的小鼠血清ALT和AST水平无明显差异，而D-GaIN/LPS组组小鼠血清ALT和AST 水平显著升高(P<0.01)。用50mg/kg剂量的胡萝卜苷处理的小鼠血清ALT和 AST水平显示明显降低(P<0.01)。结果表明，胡萝卜苷可降低血清ALT和AST 水平，改善肝功能(图4A和4B)。

胡萝卜苷能够抑制肝脏产生促炎因子：TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6是重要的促炎因子，会造成炎症和损伤。与对照组的小鼠相比，没有造模只灌服胡萝卜苷组的小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平无明显差异，而D-GaIN /LPS组小鼠的TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平显著增加(P<0.01)。另一方面, 经过50mg/kg剂量的胡萝卜苷治疗后，TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平显著降低(P<0.01)。因此，胡萝卜苷可以缓解肝细胞的炎症反应，降低促炎因子水平 (图5A,5B,5C,5D,5E)。

胡萝卜苷能够下调凋亡蛋白的表达：对各组肝细胞凋亡的差异进行检测。与对照组相比，没有造模只灌服胡萝卜苷组的小鼠肝组织的Fas、cleaved caspase-3、cleavedcaspase-8、cleaved caspase-9的表达无明显差异，而D-GaIN/LPS 诱导的损伤肝组织的Fas、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 的表达明显增加达(P<0.01)。此外，与D-GaIN/LPS组相比，50mg/kg剂量的胡萝卜苷治疗可下调Fas、cleavedcaspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 的表达(P<0.01)(图6A、6B、6C、6D、6E)。因此，胡萝卜苷对D-GaIN/LPS诱导的肝细胞凋亡具有抑制作用。

胡萝卜苷能够干涉JAK2/STAT3信号通路的激活：为进一步理解胡萝卜苷对D-GaIN/LPS诱导的急性肝损伤中的保护机制，试验中发现胡萝卜苷对 JAK/STAT信号通路具有调控作用。与对照组相比，没有造模只灌服胡萝卜苷组的小鼠肝组织中TLR4、p-JAK2、p-STAT3的表达无明显差异，而D-GaIN/LPS 诱导的肝组织中TLR4、p-JAK2、p-STAT3的表达明显增高(P<0.01)，并伴随显著下调SOCS-3(P<0.01)。与D-GaIN/LPS组相比，在50mg/kg剂量胡萝卜苷治疗下，可下调TLR4、p-JAK2、p-STAT3的表达(P<0.01)，并伴随SOCS-3显著上调(P<0.01)(图7A、7B、7C、7D、7E)。胡萝卜苷可通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活来降低促炎因子的水平，从而减弱D-GaIN/LPS引起的肝损伤。

综上所述，本分析首次证实胡萝卜苷能够减少肝细胞凋亡，通过抑制 JAK2/STAT3信号通路的激活抑制体内炎症反应，对D-GaIN/LPS诱导的急性肝损伤具有保护作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物，其特征在于，所述对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物以胡萝卜苷为活性成分。

2.一种验证权利要求1所述对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物药效的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法包括：

建模和给药：

48只19-21g健康的雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，包括正常对照组、模型组、正常给药组和治疗组；正常组和正常给药组小鼠注生理盐水，模型组和治疗组小鼠建立急性肝损伤模型；

正常给药组和治疗组灌胃胡萝卜苷一次，对照组、模型组、小鼠灌胃生理盐水；随后，每过半个小时对每组小鼠的数量进行记录；

6个小时后，活着的小鼠用戊巴比妥钠麻醉；在血液收集的1个小时内，血清被离心分离出来贮存在-20℃，备用；

一部分小鼠肝脏用10％的福尔马林浸泡，另一部分贮存在-80℃用来提取蛋白；在处理前，每只小鼠称重，取出的肝脏称重。

3.如权利要求2所述的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法进一步包括：

染色：

小鼠肝组织的切片用光学显微镜进行分析；用10％的福尔马林固定组织标本、制作蜡块、切片和染色；并采集图像；

进行生化指标：

血清ALT和AST的含量按照试剂盒的操作说明测定；血清从普通抗凝管中的血液样品离心分离后，收集；然后，在全自动生化分析仪下，用试剂盒分析血清中ALT和AST的含量；

进行ELISA测定血清中的蛋白水平：

ELISA试剂盒的板上的每个孔加入100μL血清样本,然后在37℃下孵化2小时，随后每个孔中装入工作液，在室温下再孵育1小时；添加底物液后需添加停止液来终止反应；最后，在492nm波长下用分光光度计读取吸光度。

4.如权利要求2所述的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法进一步包括：

Western blot分析：

把0.1g的肝组织磨碎后，加入RIPA buffer和PMSF裂解细胞；离心后,把收集到的上层清液加入上样缓冲液在95℃下煮10分钟；随后，20μg样本分步进行凝胶电泳和转移到PVDF膜；随后，用5％脱脂牛奶在室温下封闭膜3小时；PVDF膜上的目的蛋白和一次抗体在4℃过夜孵育；

用TBS-T缓冲液冲洗三次后，随后用兔Ig G抗体作为二次抗体孵育PVDF膜，2小时后用TBS-T缓冲液冲洗三次；

最后，利用自动显影机对膜进行成像；以β-Actin作为内参，用Quantity one4.6软件对数据进行分析。

5.一种利用权利要求1所述对D-GaIN/LPS诱导的肝损伤保护的药物制备的用于治疗脓毒血症的胡萝卜苷注射药剂。