CN109439574B - 纤维素酶产生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纤维素酶产生菌，包括：所述纤维素酶产生菌为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的枯草芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus subtilis，其保藏号为CGMCC NO.16117。本发明提供的保藏号为CGMCC NO.16117的纤维酶产生菌，可以用于降解花生壳，解决了现有的花生壳无法用于制备纤维素酶的缺陷。

Description

纤维素酶产生菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物和发酵技术领域，具体地说，涉及一种纤维素酶产生菌及其发酵产物在降解废弃花生壳中的应用。
背景技术
我国是花生种植、贸易大国，每年产生的花生壳废弃物高达数百万吨，除少部分用于饲料或燃料外，大部分被焚烧处理，对环境造成严重的污染。
纤维素酶是一组复合酶系，能够将植物纤维构成的细胞壁分解。纤维素酶广泛存在于自然界中，动物、植物和微生物都能产生纤维素酶，它是能水解纤维素β-1,4糖苷键，生成纤维二糖和葡萄糖的起协同作用的一组酶系，包括葡聚糖内切酶(EC3.2.1.4，CX酶)、葡聚糖外切酶(EC3.2.1.91，C1酶)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，纤维二糖酶)三个主要成分组成的诱导性复合酶系。纤维素酶的结构因种类和来源不同，差异较大。细菌、真菌、放线菌等均能产生纤维素酶。
花生壳的主要成分为粗纤维，纤维素是地球上最丰富的生物质资源，同时也是天然的可再生资源。目前，花生壳作为农用饲料、栽培基质，及以花生壳为原料，制备胶粘剂、吸附剂等研究较多，目前并未存在将花生壳发酵降解生产制备纤维素酶。
发明内容
本发明提供一种纤维素酶产生菌，用于发酵降解花生壳以制备纤维素酶，解决了现有的花生壳无法用于制备纤维素酶的缺陷。
为解决上述问题，本发明公开了一种纤维素酶产生菌，包括：所述纤维素酶产生菌为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的枯草芽孢杆菌，其保藏号为CGMCC NO.16117。本发明提供的保藏号为CGMCC NO.16117的纤维酶产生菌，可以用于降解花生壳，解决了现有的花生壳无法用于制备纤维素酶的缺陷。
本发明还公开了一种纤维素酶产生菌的应用，所述纤维素酶产生菌应用于降解花生壳以制备纤维素酶。本发明通过保藏号为CGMCC NO.16117的纤维素酶产生菌来处理花生壳，开发了花生壳新的利用途径，减少资源浪费并改善环境，其用于花生壳制备出高附加值的纤维素酶，其经济价值高。
优选的，纤维素酶产生菌的应用包括如下步骤：
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理0.5-3.0g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在27-42℃下在150-170r/min的摇瓶中培养10-96h，培养的发酵液pH6.0-7.5；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液。
优选的，在步骤1)之前还设有花生壳粉末的制备工序，所述花生壳粉末的制备工序为：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，过40目筛，取过筛后的粉末煮沸20-40min，烘干备用。
优选的，步骤1)中每20ml产酶培养基处理1.8-2.2g花生壳粉末。
优选的，步骤3)中的发酵温度为32±0.5℃、培养时间10±1h、发酵液pH7.5±0.2。本发明采用该优化后的工艺，其具有最高的酶活为41.81U。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1、本发明通过保藏号为CGMCC NO.16117的纤维素酶产生菌来处理花生壳，开发了花生壳新的利用途径，减少资源浪费并改善环境，其用于花生壳制备出高附加值的纤维素酶，其经济价值高。
当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本发明纤维素酶产生菌的选育方法中将CMC-Na固体筛选培养基平板敞口至于存放食用菌菌糠的房间内，一周后的平板上菌落情况。
图2是本发明纤维素酶产生菌的选育方法中用1％刚果红染色液将上述平板染色10min，生理盐水脱色后培养基的外观。
图3是菌株BsTs9#在GEN III鉴定板上的鉴定表现。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。
本申请中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本申请中所用方法，若无特别说明，均为本领域技术人员所知晓的常规方法。
本发明的纤维素酶产生菌BsTs9#，分类命名：枯草芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus subtilis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年07月17日，保藏号为CGMCC NO.16117。
发明中用到的主要材料：
LB(Luria-Bertani)，液体培养基配方为：每1000mL去离子水中含酵母膏5g，蛋白脉10g，NaCl 10g，pH自然，121℃高压灭菌20min。
LB(Luria-Bertani)固体培养基：将LB液体培养基中加入15g/L琼脂粉。
CMC-Na(羧甲基纤维素钠)：是天然纤维素经化学改性后得到的纤维素衍生物。
刚果红染液：0.1g刚果红，100ml蒸馏水，溶解后过滤，用蒸馏水定容至100ml。
生理盐水：58.44g氯化钠，1000ml蒸馏水。
DNS试剂：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存。
所有培养基均经121℃高温灭菌处理。
菌种活化：用接种环挑取保存于LB固体斜面培养基上的菌种,置于LB液体培养基中，37℃，200r/min，摇瓶培养12h进行菌种活化。
纤维素酶产生菌的选育方法：
(1)将CMC-Na固体筛选培养基平板敞口至于存放食用菌菌糠的房间内，一周后，平板上长出菌落(如图1所示)，将长出的菌落编号，并用接种环挑取菌落转接至LB液体培养基中。
(2)初筛：用1％刚果红染色液将上述平板染色10min，生理盐水脱色，观察菌落周围透明圈情况，有透明圈说明该菌落能够产生纤维素酶，透明圈与菌落直径比值越大，说明产酶能力越强(如图2所示)。
(3)复筛：将初筛中产酶能力强的菌种，接种至产酶培养基中，测定发酵液中的纤维素酶活力，确定纤维素酶产生菌。
菌株BsTs9#的Biolog GEN III微孔板鉴定：
采用Biolog全自动微生物鉴定系统的Biolog GEN III微孔板对菌株BsTs9#进行了鉴定。其鉴定结构如表1和图3所示。
表1 Biolog GEN III微孔板测试布局
Figure BDA0001858585540000051
以A-1孔为阴性对照对GenIII微孔板1-9列中的碳源利用情况进行测试。所有视觉上看起来与A-1孔类似的反应定义为“阴性”反应(－)，看起来成紫色(深于A-1)的定为“阳性”反应(+)。孔中所显的颜色非常浅，或者有紫色的小色斑，或者有菌块或其他块状物，则将其判定为“边界值”(\)。以A-10孔为阳性对照对列10-12进行化学敏感性测试，所有颜色不到A-10孔一半，且容易被该化学物质抑制的反应被定为“阴性”反应(－)，显紫色或接近紫色(与A-10孔类似)的反应被定为“阳性”反应(+)。
采用Biolog GenIII微孔板对供试细菌进行鉴定，4-6h培养鉴定结果SIM值≥0.75是可以接受的结果；16-24h培养后读取结果时，SIM值≥0.5是可以接受的结果。经24h培养，自动扫描并查询细菌数据库，以SIM≥0.5为判断标准，鉴定结果如表2所示。
表2：
菌种 PROB SIM Organism Type Species
BsTs9# 0.734 0.734 3，743 Bacillus subtilis
菌株BsTs9#产酶情况测定：
葡萄糖标准曲线的绘制：取1mg/mL标准葡萄糖液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL加超纯水至1.0mL,加入2.0mL DNS试剂，沸水浴中加热5分钟,冷却后定容至10mL，分光光度计540mn波长下测OD值。以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
滤纸酶活力(FPA)测定：以滤纸为底物，在一定反应条件下，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成1umol葡萄糖为一个滤纸酶活单位，以U/mL表示。
具体测定方法：取0.5mL适当稀释的酶液，加入pH值为4.8，0.lmol/L的缓冲液1mL，再加入50±0.5mg滤纸(lx6cm)一条，于50℃酶解反应1小时；加入DNS显色液2mL，放入己沸腾的水中沸水浴l0min，流水冷却后在540nm下测吸光度；同时用煮沸浴10min后失活的酶液做对照，根据吸光度在葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，计算FPA值。
滤纸酶活按下面公式计算：X＝(W×N×1000)/(T×M)；X：为滤纸酶酶活力,单位U/mL。W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。N：为酶液稀释总倍数。T：为反应时间。M：为样品的体积。
实施例1
花生壳粉末的制备工序：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，然后进行粉碎并过40目筛，取过筛后的粉末煮沸20-40min，烘干备用。
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理0.5g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在27℃下在150r/min的摇瓶中培养10h，培养的发酵液pH6.0；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液；然后测定滤纸酶活(U)。测得的实际滤纸酶活(U)为25.6U。
实施例2
花生壳粉末的制备工序：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，然后进行粉碎并过40目筛，取过筛后的粉末煮沸40min，烘干备用。
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理3.0g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在42℃下在170r/min的摇瓶中培养96h，培养的发酵液pH7.5；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液；然后测定滤纸酶活(U)。测得的实际滤纸酶活(U)为28.3U。
实施例3
花生壳粉末的制备工序：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，煮沸30min，烘干备用。
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理1.75g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在34.9℃下在150-170r/min的摇瓶中培养53h，培养的发酵液pH6.7；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液；然后测定滤纸酶活(U)。测得的实际滤纸酶活(U)为30.1U。
实施例4
花生壳粉末的制备工序：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，然后进行粉碎并过40目筛，取过筛后的粉末煮沸30min，烘干备用。
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理1.8g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在31.5℃下在150r/min的摇瓶中培养9h，培养的发酵液pH7.3；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液，然后测量纤维素酶活力。测得的实际纤维素酶活力为41.61U。
实施例5
花生壳粉末的制备工序：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，然后进行粉碎并过40目筛，取过筛后的粉末煮沸30min，烘干备用。
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理2.2g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在32.5℃下在170r/min的摇瓶中培养11h，培养的发酵液pH7.7；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液，然后测量纤维素酶活力。测得的实际纤维素酶活力为41.84U。
实施例6
花生壳粉末的制备工序：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，然后进行粉碎并过40目筛，取过筛后的粉末煮沸30min，烘干备用。
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理2.0g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在32℃下在160r/min的摇瓶中培养10h，培养的发酵液pH7.5；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液，然后测量纤维素酶活力。测得的实际纤维素酶活力为42.43U。
对比例1
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理0.4g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 1g、MgSO4.7H2O0.7g，蛋白胨3g，酵母粉3g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在26℃下在148r/min的摇瓶中培养97h，培养的发酵液pH5.9；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液，然后测量纤维素酶活力。测得的实际纤维素酶活力为12.41U。
对比例2
1)将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理3.1g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 3g、MgSO4.7H2O 0.3g，蛋白胨7g，酵母粉7g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2)在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在43℃下在171r/min的摇瓶中培养9h，培养的发酵液pH7.6；
3)将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液，然后测量纤维素酶活力。测得的实际纤维素酶活力为13.19U。
经实验验证，在优化的发酵条件下，纤维素酶平均实际酶活为41.96U。与理论预测值相比相对误差2％，比单因素最大酶活30.1U高出40％。通过实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的实验数据对比可知，显然优化的工艺，具有最优的技术效果。而超出实施例1、2、3的工艺范围的对比例1和对比例2的纤维素酶活力的实验数据，远远低于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的纤维素酶活力的实验数据。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述实施例为本发明的优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的类似的工艺及所作的等效变化，而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一株纤维素酶产生菌，其特征在于，所述纤维素酶产生菌为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的枯草芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus subtilis，其保藏号为CGMCCNO.16117。
2.如权利要求1所述的纤维素酶产生菌的应用，其特征在于，所述纤维素酶产生菌应用于降解花生壳以制备纤维素酶。
3.如权利要求2所述的纤维素酶产生菌的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）将花生壳粉末加入产酶培养基中，每20ml产酶培养基处理1.8-2.2g花生壳粉末，其中产酶培养基的配方为：每1000ml水中包括KH2PO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，酵母粉5g，高压灭菌，得到待发酵产酶培养基；
2）在待发酵产酶培养基中接入活化后的菌种，在32±0.5℃下在150-170r/min的摇瓶中培养10±1h，培养的发酵液pH7.5±0 .2；
3）将培养后的发酵液，离心，取上清液为粗酶液。
4.如权利要求3所述的纤维素酶产生菌的应用，其特征在于，在步骤1）之前还设有花生壳粉末的制备工序，所述花生壳粉末的制备工序为：挑选无发霉的花生壳，用清水洗涤去除表面污垢，沥干水后自然晾干后，然后进行粉碎并过40目筛，取过筛后粉末煮沸20-40min，烘干备用。
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