CN109423457B - 一种纳士维尔链霉菌及其鉴定方法和应用 - Google Patents

一种纳士维尔链霉菌及其鉴定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域的一种纳士维尔链霉菌及其鉴定方法和应用。该纳士维尔链霉菌16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示，菌株为SINOPEC43在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M2016114。该菌株在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。同时，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，无需扩增培养，通过改进的引物即可对土壤中的纳士维尔链霉菌SINOPEC43的16S rDNA保守序列进行扩增，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度，解决了传统生理生化检测周期长，对样品培养物纯度要求高的不足。

Description

一种纳士维尔链霉菌及其鉴定方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种纳士维尔链霉菌及其鉴定方法和应用。
背景技术
微生物勘探技术的核心是油气指示微生物的鉴定。通常情况下勘探过程中所研究的目标微生物在环境中的相对丰度很低，因此需在传统的特异培养条件下刺激油气藏环境与非油气藏环境中烃类氧化细菌的快速繁殖。上述方法虽然可以获得微生物的数量信息，但是该数量信息事实上成几何倍数地高于原位环境中的微生物数量，不可避免地掩盖了油气藏与非油气藏环境中微生物数量上的差异，同时也无法获得不可培养微生物的信息。另外，油气微生物的生长除受烃类影响，还会受到周围环境的影响，如土壤的湿度、pH值、盐度或其中的关键离子、营养物质和扰动等。若微生物发育的相对强弱是由环境因素所引起，则会造成油气富集或贫乏的假象。
纳士维尔链霉菌为链霉菌属，是最高等的放线菌。有发育良好的分枝菌丝，孢子丝和孢子的形态、颜色，是分种的主要识别性状之一。在普光气田油气藏上方土壤中发现该菌占较大的丰度，该菌具有较为健全的烃类降解代谢途径，为了进一步确定该菌与油气微生物勘探之间的关系，对其典型菌株的获取及检测技术进行开发研究。
目前，纳士维尔链霉菌的常见检测鉴定方法有两种：1.生理生化鉴定，通过分离出的纯菌，对微生物生理生化进行定性研究，该方法周期长且对培养物纯度提出较高的要求；2.基因提取后进行16S rDNA的测序，该方法仍需获取纯培养物进行全基因提取，再通过通用16S rDNA引物获取保守序列进行测序。
因此，为了能够快速、准确获取油气田上方纳士维尔链霉菌的特征信息，急需对其典型菌株的获取及混合体系中的检测技术进行开发研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种纳士维尔链霉菌及其鉴定方法，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，且所述纳士维尔链霉菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，因此该菌株可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。
本发明还提供了一种利用所述纳士维尔链霉菌指示油气藏上浮气态烃浓度的方法，该方法采用改进的引物对所述纳士维尔链霉菌的16S rDNA保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标条带的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度。
为此，本发明一方面提供了一种纳士维尔链霉菌，其16S rDNA的基因序列如SEQID NO.1所示。
根据本发明，所述纳士维尔链霉菌的菌株为SINOPEC43，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M2016114。
根据本发明，所述纳士维尔链霉菌的生物学特征为：在固体培养基上的菌落形态为白色粉末状菌落，菌株在显微镜下的细胞形态呈细丝状、出芽生殖。
在本发明的一些实施方式中，所述的固体培养基为甲醇固体培养基或丁醇固体培养基；具体地，所述的甲醇固体培养基的组成如下(1L去离子水中)：
Figure RE-GDA0001509123610000021
和/或，所述的丁醇固体培养基的组成如下(1L去离子水中)：
Figure RE-GDA0001509123610000022
Figure RE-GDA0001509123610000031
在本发明的一些优选实施方式中，所述甲醇固体培养基和乙醇固体培养基的 pH值均为7-8；优选地，所述甲醇固体培养基和乙醇固体培养基的pH值均为7。
根据本发明，所述纳士维尔链霉菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述纳士维尔链霉菌的鉴定方法，其包括对待测菌株进行16S rDNA序列或16S rDNA的部分序列测序，并且所述待测菌株的16S rDNA序列或16S rDNA的部分序列与如SEQ ID NO.1的序列的一致性在95％以上，优选所述待测菌株的16S rDNA序列或16S rDNA的部分序列与如SEQ ID NO.1的序列的一致性在97％以上，更优选所述待测菌株的 16S rDNA序列或16S rDNA的部分序列与如SEQ ID NO.1的序列的一致性在99％以上，最优选所述待测菌株的16S rDNA序列或16S rDNA的部分序列与如SEQ ID NO.1的序列的一致性在99.5％以上，则鉴定所述待测菌株为所述纳士维尔链霉菌。
本发明中，使用引物对1(SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3)、引物对2(SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5)、引物对3(SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7)和引物对 4(SEQ ID NO:8及SEQ IDNO:9)中的一种作为引物对，进行PCR扩增以获得的所述16S rDNA的部分序列，并将所述16SrDNA的部分序列进行测序来与如 SEQ ID NO:1的相应序列比较以鉴定所述待测菌株。
在本发明的另一些实施方式中，所述方法还包括结合将待测菌株的生物学特性与本发明第一方面所述纳士维尔链霉菌的生物学特性的比较以对所述待测菌株进行鉴定。具体地，所述的生物学特性为：在固体培养基上的菌落形态为白色粉末状菌落，菌株在显微镜下的细胞形态呈细丝状、出芽生殖。所述的固体培养基为甲醇固体培养基或丁醇固体培养基；所述固体培养基的pH值为7-8。
一般来讲，利用微生物的16S rDNA序列或16S rDNA的部分序列对微生物进行鉴定具有例如如下优点：对未知样品进行快速种属分析；为生化鉴定提供指导信息；对于难以获得纯培养的细菌，如寄生菌等，使用16SrDNA鉴定是唯一可用的鉴定手段。
但是有的微生物由于种间差异小，单独依靠16S rDNA鉴定不能鉴定到种。需要其它鉴定方法补充，例如微生物的生物学特性。
本发明第三方面提供了一种如第一方面所述的纳士维尔链霉菌在指示油气藏上浮气态烃浓度中的应用。
根据本发明，所述的应用具体包括以下步骤：
A，提取油气藏上方土壤中微生物的全基因组，获得用于PCR扩增的模板；
B，设计引物对模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
C，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带的亮度，判断油气藏上浮气态烃的浓度。
在本发明的一些实施方式中，所述引物选自下述引物对中的一对：
上游引物1：5’-GCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCT-3’，
下游引物1：5’-GCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCC-3’；
上游引物2：5’-GCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAA-3’，
下游引物2：5’-GTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAAT-3’；
上游引物3：5’-CGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAA-3’，
下游引物3：5’-TGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCAT-3’；
和，
上游引物4：5’-CAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCC-3’，
下游引物4：5’-GCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCC-3’。
本发明中，用语“油气藏上方土壤”的含义为：油气藏中油气高丰度范围的垂直上方近地表1米内的土壤。
本发明的有益效果为：本发明从典型油气藏上方土壤中筛选到一株纳士维尔链霉菌SINOPEC43，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。同时，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，无需扩增培养，通过改进的引物即可对土壤中的纳士维尔链霉菌SINOPEC43的16SrDNA保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标条带的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度，解决了传统生理生化检测周期长，对样品培养物纯度要求高的不足。另外，该菌株可在污染的环境中存活，作为生物去污的接种介体。
附图说明
下面将结合附图来说明本发明。
图1显示了本发明的纳士维尔链霉菌SINOPEC43基于16S rDNA的系统发育树。
图2为本发明纳士维尔链霉菌SINOPEC43的电镜图。
菌种保藏
分类命名：纳士维尔链霉菌(Streptomyces nashvillensis)；菌株编号：SINOPEC43
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：武汉大学生命科学学院
保藏日期：2016年3月14日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M2016114。
具体实施方式
为使本发明容易了解，下面将结合附图详细说明本发明。
为寻求一种准确、高效地判断油气藏上浮气态烃浓度的指示微生物，本发明经过不懈的研究探索，从油气藏上方土壤中筛选到一株菌株丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关的微生物菌种，经分离鉴定为纳士维尔链霉菌SINOPEC43 (Streptomycesnashvillensis SINOPEC43)；该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，无需扩增培养，通过改进的引物即可对土壤中的纳士维尔链霉菌SINOPEC43 的16S rDNA保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标片段的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度，解决了传统生理生化检测周期长，对样品培养物纯度要求高的不足。本发明正是基于上述发现作出的。
因此，本发明所涉及的纳士维尔链霉菌能准确、高效地判断油气藏上浮气态烃浓度，其采用以下筛选培养基(甲醇培养基或丁醇培养基)进行筛选和培养获得；其中，所述的甲醇培养基的组成如下(1L去离子水中)：
Figure RE-GDA0001509123610000061
和/或，所述的丁醇培养基的组成如下(1L去离子水中)：
Figure RE-GDA0001509123610000062
具体地，所述甲醇培养基的组成如下：KH2PO4 1.0g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9g/L，MgSO4·7H2O 0.32g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，CaCl2 0.2g/L，KNO3 1.0g/L，甲醇2.0g/L；
所述丁醇培养基的组成如下：KH2PO4 1.0g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9g/L， MgSO4·7H2O 0.32g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，CaCl2 0.2g/L，KNO3 1.0g/L，丁醇2.0g/L。
所述甲醇培养基和丁醇培养的pH值均为：7.0。
本发明所述纳士维尔链霉菌的筛选方法包括以下步骤：
(1)按照上述培养基组成配制培养基，经高温(121℃)高压(0.15MPa) 下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。在液体培养基中加入2％(重量/体积)的琼脂，经过高温高压灭菌溶解后倒入到培养皿中冷却，制备出对应的固体培养基平板。
(2)称取10g普光气田油气藏上方土壤样品，加入到100ml经灭菌的生理盐水中，充分震荡后静置。在超净工作台内取上清液100μL接种到筛选培养基中，在温度30℃、摇床转速200r/min下摇床培养3d。采用灭菌后的生理食盐水将培养物分别稀释到10-5、10-6和10-7后，分别取100μL稀释液在对应的固体筛选培养基上均匀涂板，然后置于30℃下培养。3d后可以在固体培养基表面观察到长出的单克隆菌落，用接种针挑取典型单克隆菌落采用划线培养法重新接种于固体筛选培养基中进行纯化培养，纯化三次后获得该菌株的纯培养物。
(3)对该菌株的纯培养物进行形态学和分子生物学鉴定
经观测发现该菌株在固体培养基上的菌落为白色粉末状菌落，菌株在显微镜下的细胞形态呈细丝状、出芽生殖，其显微电镜图如图2所示。
对上述菌株的纯培养物进行DNA提取，PCR扩增并测序鉴定，然后通过16S rDNA克隆基因分析法进行测序，利用BLAST将所测得的序列与 GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已登录的序列进行同源性比较分析，利用生物信息学等方法分析勘探区典型油气藏上方土壤中物种丰度和相对组成特征，获得一株微生物丰度较高的新型菌株，该菌株经鉴定并命名为纳士维尔链霉菌 SINOPEC43，其16S rDNA序列长度为1406kp，全长序列如SEQ ID NO.1所示。图1显示了本发明的纳士维尔链霉菌SINOPEC43基于16S rDNA的系统发育树。该菌株已于2016年3月14日，在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)进行保藏，保藏编号：CCTCCNO：M2016114。
经鉴定，所述纳士维尔链霉菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关。因此，本发明提供了一种上述的纳士维尔链霉菌在指示油气藏上浮气态烃浓度中的应用。
根据本发明，所述的应用具体包括以下步骤：
A，提取油气藏上方土壤中微生物的全基因组，获得用于PCR扩增的模板；
B，根据纳士维尔链霉菌SINOPEC43的16S rDNA序列设计特异性引物，对模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
所述引物选自下述引物对中的一对：
上游引物1：5’-GCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCT-3’，
下游引物1：5’-GCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCC-3’；
上游引物2：5’-GCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAA-3’，
下游引物2：5’-GTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAAT-3’；
上游引物3：5’-CGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAA-3’，
下游引物3：5’-TGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCAT-3’；
和，
上游引物4：5’-CAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCC-3’，
下游引物4：5’-GCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCC-3’。
上述引物对均可对环境土壤样品DNA进行PCR扩增，快速、准确鉴定土壤样品中是否存在该纳士维尔链霉菌；
C，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带的亮度，判断油气藏上浮气态烃的浓度；具体地，目标条带的亮度越强，油气藏上浮气态烃的浓度越高。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：利用纳士维尔链霉菌SINOPEC43对油气藏上方土壤样品进行鉴定。
(1)根据纳士维尔链霉菌SINOPEC43的16S rDNA保守序列设计四对特异性引物，分别为：
上游引物1：5’-GCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCT-3’，
下游引物1：5’-GCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCC-3’；
上游引物2：5’-GCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAA-3’，
下游引物2：5’-GTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAAT-3’；
上游引物3：5’-CGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAA-3’，
下游引物3：5’-TGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCAT-3’；
和，
上游引物4：5’-CAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCC-3’，
下游引物4：5’-GCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCC-3’。
其中，引物1扩增的目标条带的大小为420bp，引物2扩增的目标条带的大小为716bp，引物3扩增的目标条带的大小为927bp，引物4扩增的目标条带的大小为1229bp。
(2)提取土壤中微生物的全基因组。
称取油气藏上方土壤与背景土壤各0.5g，分别加至Lysing Matrix E Tube中，用细胞破碎仪进行细胞破碎(速度4.5m/s，30s，4次)，破碎后的细胞按照
Figure RE-GDA0001509123610000092
SPIN Kitfor Soil(美国MP Biomedicals生物医学公司产品)的说明书进行后续的操作，获得土壤样品中微生物的全基因组，作为PCR扩增的模板。
(3)采用4对引物分别进行PCR扩增。
PCR扩增体系均为：
0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：
Figure RE-GDA0001509123610000091
加双蒸水至终体积为50μl。
PCR扩增程序均为：
94℃预变性5min；
94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸1.5min，30个循环；
72℃延伸10min。
(4)琼脂糖凝胶电泳。
将上述PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果显示油气藏上方土壤中提取的全基因组中扩增得到与设计相同长度的基因片段(引物对1：420bp、引物对2：716bp、引物对3：927bp、引物对4：1229bp)，而背景土壤中提取的全基因组中没有扩增出相应的片段。对目标条带进行胶回收并测序，测序结果表明，所扩增的条带为引物设计时的目标保守序列。说明该菌株可用作油气微生物，能够特异性指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国石油化工股份有限公司；中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院
<120> 一种纳士维尔链霉菌及其鉴定方法和应用
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1406
<212> DNA
<213> 纳士维尔链霉菌（SINOPEC43的16S rDNA）
<400> 1
gcagtcgacg atgaagccct tcggggtgga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 60
caatctgccc ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatatgactg 120
cgggaggcat ctcctgcggt ggaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca 180
gcttgttggt ggggtaatgg cctaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga 240
ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 300
ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt 360
tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg 420
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg 480
ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcac gtcgggtgtg aaagcccggg gcttaacccc 540
gggtctgcat ccgatacggg caggctagag tgtggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt 600
agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat ctctgggcca 660
ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 720
acgccgtaaa cgttgggaac taggtgttgg cgacattcca cgtcgtcggt gccgcagcta 780
acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac 840
gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac 900
caaggcttga catataccgg aaagcattag agatagtgcc ccccttgtgg tcggtataca 960
ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1020
cgcaaccctt gtcctgtgtt gccagcatgc ccttcggggt gatggggact cacaggagac 1080
cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct 1140
tgggctgcac acgtgctaca atggccggta caaagagctg cgatgccgtg aggcggagcg 1200
aatctcaaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg 1260
agttgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320
accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa cccctgtggg 1380
agggagcgtc gaaggtggac cggcag 1406
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 上游引物1（人工序列）
<400> 2
gcttaattcg acgcaacgcg aagaacct 28
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 下游引物1（人工序列）
<400> 3
gcaatgctga tctgcgatta ctagcaactc c 31
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 上游引物2（人工序列）
<400> 4
gcccttcact ctgggacaag ccctggaa 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 下游引物2（人工序列）
<400> 5
gttagctgcg gcaccgacga cgtggaat 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 上游引物3（人工序列）
<400> 6
cgggttgtaa acctctttca gcagggaa 28
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 下游引物3（人工序列）
<400> 7
tgatctgcga ttactagcaa ctccgacttc at 32
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 上游引物4（人工序列）
<400> 8
caatctgccc ttcactctgg gacaagcc 28
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 下游引物4（人工序列）
<400> 9
gcaatgctga tctgcgatta ctagcaactc c 31

Claims (1)

1.一种纳士维尔链霉菌(Streptomyces nashvillensis)，其16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述纳士维尔链霉菌的菌株为SINOPEC43，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M2016114。
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