CN109395088A

CN109395088A - 一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体以及口服蛋白质类药物制剂

Info

Publication number: CN109395088A
Application number: CN201710696815.1A
Authority: CN
Inventors: 薛南荣
Original assignee: Jiangsu Balance Biological Medicine Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Balance Biological Medicine Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明涉及一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体，所述配体由牛磺胆酸和甘氨胆酸组成。本发明还提供一种口服蛋白质类药物制剂，具体为以所述配体与蛋白质类药用活性成分形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒；所述纳米脂质体包裹层可以增加对核心结构的保护，且当活性成分为胰岛素时可为胰岛素质粒接触受体时产生自磷酸化提供磷离子。本发明提供的以胰岛素为活性成分的口服蛋白质类药物制剂不但能调节血糖、血脂，主要的是能防治II型糖尿病的并发症；其生物利用度高于注射胰岛素，不会引起低血糖，更不会至低血糖引起脑死亡；采用口服方式，给药方便，给药后血糖平稳，对机体的内环境的稳定更有益，具有良好且广泛的应用前景。

Description

一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体以及口服蛋白质类药物制剂

技术领域

本发明涉及蛋白质类药物领域，具体涉及一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体以及口服蛋白质类药物制剂。

背景技术

目前，蛋白质类药物被广泛应用疾病的诊断和治疗，但若采用口服方式给药，极易在消化道里被酶代谢而失去活性。因此，目前绝大部分蛋白质类药物难以被做成口服制剂，而多以针剂形式使用。

其中，口服胰岛素的研制工作已近半个世纪，但至今尚未有一种上市。其主要的原因有两个：1胰岛素作为一种蛋白质，不能通过消化道中强大的蛋白酶降解系统；2、胰岛素不能通过小肠壁进入到血液。因此认为胰岛素的口服剂的研制困难极大。目前世界上做胰岛素口服制剂的主要方法都是想方设法通过对胰岛素的包裹、屏蔽，来阻断消化道蛋白降解酶对其的破坏；其次通过对胰岛素改构来抵御蛋白降解酶的破坏。但以上的方法所导致的结果是，使制成的胰岛素生物利用度很低，常不及注射胰岛素生物利用度的10％。而且疗效尚不十分确切。而修饰后的胰岛素最大的缺陷是临床副作用大，限制了其使用。修饰后的胰岛素口服后，可引起较频繁的腹泻，而一型糖尿病的患者多为儿童。频繁的腹泻对儿童的营养吸收和成长都是不利的。故未上市。

自1921年胰岛素问世以来，使糖尿病患者寿命和生活质量发生了更本性的变化。但胰岛素制剂皮下注射的非生理性给药方式，仍不能拟合糖尿病患者的要求，血糖控制不理想和低血糖时有发生，成为糖尿病尤其是2型糖尿病早期胰岛素强化治疗的重大障碍。

现在的口服降糖药包括皮下注射胰岛素，只能降低血糖，却不能减少糖尿病的并发症和死亡率，不能改善机体的糖、脂肪、与能量代谢。这是二型糖尿病并发症形成的原因，而并发症是消耗庞大医疗费的主要部分。而且胰岛素的给药途径使患者很难接受。此外,此种方法给药的缺点是:血糖控制不稳定，病人容易发生低血糖，严重的可发生脑死亡。长期注射病人可能发生胰岛素浮肿，发生脂肪营养不良及皮下脂肪萎缩。

据2012年世界糖尿病日，国家公布的我国糖尿病发病率占人口的11.6％，约1.139亿人，发病率为世界的一。中国疾病与防治中心统计结果显示，中国成年人群中糖尿病前期(IGT)患病率为50.1％。而且，中国大约三分之二的糖尿病患者没有进行足够的血糖控制。据WTO最新数据，到2010年全世界已有2.4亿糖尿病患者。发达国家II型糖尿病发病多为老年人，而我国发病年龄在逐年提前，而且儿童II型糖尿的发病率已远远大于I型糖尿病。随着我国社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率逐年升高，发病年龄愈来愈年轻化，已成为威胁人民健康的重大社会问题。因此防治糖尿病已是一个迫不及待的紧急任务。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体。

具体而言，所述配体由牛磺胆酸和甘氨胆酸组成。本发明的核心贡献在于，发现牛磺胆酸和甘氨胆酸组成的配体可以与蛋白质类药用活性成分形成结合物以保护所述药用活性成分经口服而不被降解。具体而言，所述配体可以与蛋白质类药用活性成分(如胰岛素)的蛋白酶酶切位点结合，且不与其活性功能位点结合。所述蛋白酶包括胃蛋白酶和/或胰蛋白酶。

为了确保所述配体的发挥最优作用，本发明优选所述牛磺胆酸和甘氨胆酸的用量比为1:1～1:6，更优选为1:2～1:4。

本发明同时保护所述配体在制备蛋白质类药物制剂中的应用。所述蛋白质类药物制剂中蛋白质类药用活性成分可选自胰岛素、生长素、黄体酮、睾丸酮、雌激素等。

本发明进一步保护一种口服蛋白质类药物制剂，所述制剂为：以所述配体与蛋白质类药用活性成分形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒。

在所述配体与蛋白质类药用活性成分形成的核心结构之外，是一层纳米脂质体的第二层包裹，其生理作用有两个，一是增加对核心结构的保护，二是当所述蛋白质类药用活性成分为胰岛素时，为胰岛素质粒接触胰岛素受体时产生自磷酸化提供磷离子。这种结合不但可抵御蛋白降解酶对生物活性成分的的降解，而且可以消除胰岛素的受体抵抗。依据上述原理制备而成的口服蛋白质类药物制剂，可使过去不能口服的功能蛋白，有希望研制成可口服的新药。所述纳米级脂质体是脂、表面活性剂和助表面活性剂或少量水组成的均一透明溶液，通过将药物包裹在脂质体中，口服后遇体液在胃肠蠕动下自发分散形成O/W型微乳，通过提高药物的溶解度，降低表面张力，形成易通过胃、肠壁的水化层，增加对肠道上皮细胞的穿透性等优势显著提高药物生物利用度。

本发明提供的口服蛋白质类药物制剂微粒的粒径为纳米级，优选为10～100nm。

作为本发明的第一种优选方案，所述口服蛋白质类药物制剂中，作为中心的结合物由如下重量份的成分组成：蛋白质类药用活性成分1份，牛磺胆酸1～9份，甘氨胆酸5～19份。热涌动实验(MST)证实当牛磺胆酸与甘氨胆酸在此比率内两者与胰岛素的结合率就高，偏离此比率这两个配体与胰岛素的结合率就低。

作为本发明的第二种优选方案，所述口服蛋白质类药物制剂中，作为中心的结合物由如下重量份的成分组成：蛋白质类药用活性成分1份，牛磺胆酸101～160 份，甘氨胆酸101～500份。动物实验证实，药物在此比率时也有较好的降糖效果，但比第一种优选方案的效果稍差。

本发明所述重量份可以是μm、mg、g、kg等医药领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。

本发明优选所述蛋白质类药用活性成分为胰岛素、生长素、黄体酮、睾丸酮、雌激素等，优选为胰岛素。

当所述蛋白质类药用活性成分为胰岛素时，所述制剂为口服胰岛素制剂，其为以配体与胰岛素形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒。本发明通过大量实验发现并证实，哺乳动物消化道内本身存在有生物活性的胰岛素。在此基础上，本发明利用仿生学的方法，创造性地提出一种针对II型糖尿病的口服胰岛素制剂，所述口服胰岛素制剂能够有效降低血糖，针对性防治II型糖尿病并发症，且能够调节血脂和蛋白质代谢。

本发明进一步保护所述口服蛋白质类药物制剂在制备治疗和/或预防蛋白质类药用活性成分缺乏所导致疾病的药物中的应用。

优选地，当所述蛋白质类药用活性成分为胰岛素时，本发明保护所述药物制剂在制备治疗或/和预防II型糖尿病药物中的应用。

在实际应用中，本发明提供的药物可采用口服方式使用。具体的服用方法为：每日共服用1～3个单位。在实际服用过程中，可每日服用1～2次，优选为早晚各一次。

本发明技术效果包括：

1、按仿生学原理，将胰岛素与两个配体有效结合，即甘氨胆酸和牛磺胆酸与胰岛素有效结合组成仿生复合剂，在消化道内可抵御强大的蛋白降解酶的灭活，其主要原因是所述仿生复合剂中胰岛素的结合形式，即胰岛素与牛磺胆酸和甘氨胆酸之间的结合状态。这种结合状态有两个重要的生理意义：第一、牛磺胆酸和甘氨胆酸与胰岛素的结合屏蔽了胰岛素可被蛋白降解酶结合的位点；保护了胰岛素的完整性，这样局部的屏蔽，使胰岛素的功能位敞开，因此，这样的生理保护不会影响胰岛素的生理利用度；第二、可消除胰岛素受体的抵抗；我们的实验证实胰岛素与其受体结合时需要其配体的存在，其配体即是牛磺胆酸和甘氨胆酸。在这核心结构之外是一层纳米脂质体的第二层包裹，其生理作用有两个，一是增加对核心结构的保护，二是胰岛素质粒接触胰岛素受体时、为胰岛素产生自磷酸化提供磷离子。

通过将蛋白质类药物如胰岛素和配体结合，屏蔽了胰岛素等蛋白质类药物被蛋白降解酶结合的位点，抵御了被强大的蛋白降解酶的降解。这解决了目前蛋白质类药物口服吸收易被降解的问题。

2、胰岛素与配体结合后所得的胰岛素复合剂，所产生的生理作用比用单纯注射胰岛素的效果还好，还更符合哺乳动物的生理性。本发明的“口服胰岛素复合剂”的核心是按仿生学原理，将胰岛素与两个配体有效结合，解决了胰岛素受体抵抗的问题。这就从病因方面治疗了II型糖尿病。

3、本发明与现有的口服胰岛素相比，具有如下显著的技术效果：本发明是按哺乳动物机体内发现的胰岛素新的代谢途径为生理基础而研制的，它的作用途径更符合哺乳动物机体的生理代谢特点，因此，本发明提供的复合剂不但能调节血糖、血脂，主要是能防治II型糖尿病的并发症；本发明的生物利用度高于注射胰岛素；本发明不会引起低血糖，更不会至低血糖引起脑死亡；本发明给药方便，每日早晚各一次，口服即可；本发明给药后血糖平稳，不会大起大落，因此更为安全，对机体的内环境的稳定更有益。

4、将胰岛素和牛磺胆酸及甘氨胆酸组成的纳米脂质体制剂，通过生物小角X-射线散射线试验，其分子粒径仅为67.4nm，分子粒径较小，稳定性更好，易被吸收。

MST试验证明胰岛素单独和甘氨胆酸没有结合，和牛磺胆酸结合力一般，当甘氨胆酸和牛磺胆酸同时存在时，胰岛素和两者有很好的结合。同时牛磺胆酸与甘氨胆酸的配比为1：1～1：6之间的配比，均有一定的结合；但当牛磺胆酸与甘氨胆酸的配比为1:2～1:4时，结合力最佳。这是本领域技术人员无法根据现有专利知识和技术资料轻易得到，需要在一定的研究基础和大量实验摸索情况下获得，非显而易见的。

通过模拟配制人工肠液和人工胃液，将本发明药物制剂经过孵育后，实验证明经人工胃液孵育的口服胰岛素复合剂中的胰岛素在人工肠液中稳定性好，在人工肠液中，口服胰岛素在37℃孵育30分钟，活性几乎不变，60分钟仍有 60％活性，120分钟后仍有20％的峰面积。复合剂，能够在消化道内可抵御强大的蛋白降解酶的灭活，避免胰岛素在胃肠道被降解。

通过高脂模型糖尿病SD大鼠动物实验证明，本发明仿生复合剂对高脂饲料造模II型糖尿病SD大鼠的血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数与模型组及注射胰岛素相比，均有一定的显著性差异。本发明仿生复合剂可显著降低高脂饲料造模II型糖尿病SD大鼠血糖，提高血清胰岛素含量，降低胰岛素抵抗指数。

MI-CRO实验证实口服胰岛素复合剂的有效剂量比注射胰岛素的用量更低，与生理剂量几乎相似，口服胰岛素复合剂带入细胞内的葡萄糖多于注射胰岛素。动物药效学实验证实口服胰岛素复合剂可使胰岛素受体抵抗明显降低(小剂量 P<0.001)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供了一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体，所述配体由牛磺胆酸和甘氨胆酸以质量比1:1组成。

实施例2

本实施例提供了一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体，所述配体由牛磺胆酸和甘氨胆酸以质量比1:2组成。

实施例3

本实施例提供了一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体，所述配体由牛磺胆酸和甘氨胆酸以质量比1:4组成。

实施例4

本实施例提供了一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体，所述配体由牛磺胆酸和甘氨胆酸以质量比1:6组成。

实施例5

本实施例提供了一种口服胰岛素制剂，其为配体与胰岛素形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒；所述结合物由胰岛素1份、牛磺胆酸1份、甘氨胆酸5份组成。

实施例6

本实施例提供了一种口服胰岛素制剂，其为配体与胰岛素形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒；所述结合物由胰岛素1份、牛磺胆酸9份、甘氨胆酸19份组成。

实施例7

本实施例提供了一种口服胰岛素制剂，其为配体与胰岛素形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒；所述结合物由胰岛素1份、牛磺胆酸101份、甘氨胆酸101份组成。

实施例8

本实施例提供了一种口服胰岛素制剂，其为配体与胰岛素形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒；所述结合物由胰岛素1份、牛磺胆酸160 份、甘氨胆酸500份组成。

实验例1

通过国家蛋白质科学研究中心(上海)位于上海同步辐射光源(SSRF)的生物小角X-射线散射线站BL19U2进行了样品BioSAXS数据收集，用于对样品分子形貌的表征。

检测过程中，样品取自实施例6提供的药物制剂，检测结果如下：样品结构参数：

(1)质量回转半径(R_g)＝22.96nm

(2)分子粒径(D_max)＝67.4nm

该复合剂为脂质体系统，粒径为67.4nm，小于100nm。其分子粒径较小，促进其在体内的分布与吸收，较为稳定。

实验例2：MST法检测胰岛素(Insulin)与牛磺胆酸(TCA)和甘氨胆酸(GCA) 的相互作用

1、实验过程：

(1)称取2.9mg的胰岛素粉末溶解在Hepes9.0的缓冲液中，待充分溶解后调 pH至7.0定容至1mL；

(2)用Monolith^TM Protein Labeling Kits蛋白标记试剂盒标记胰岛素蛋白，放在冰上标记50min(现用现标记)，并按照操作手册进行洗脱，将回收后的胰岛素 13,000rpm，离心10min，4℃，并加入0.1％Tween20；

(3)准备16个PCR管，将每种小分子(TCA，GCA以及GCA和TCA)依次进行16个梯度稀释，浓度从100000nM～3.05nM，再按照1：1加入标记好的胰岛素 (100nM)；小分子的使用浓度依次为：TCA终浓度为100uM，GCA终浓100uM， GCA和TCA按照1：1～1:10的范围均进行不同样品配比的检测。

(4)从PCR管中用标准型毛细管(Monolith NT^TM Standard Treated Capillaries)吸取样品，用Monolith^TMNT.115仪器进行检测，检测条件：在室温条件下，TCA 与胰岛素相互作用：LED Power:40％，MST Power:20％；GCA与胰岛素相互作用以及GCA&TCA与胰岛素相互作用：LED Power:80％，MST Power:20％，数据分析用NanoTemper分析软件，通过荧光强度的变化来确定Kd。

2、实验结果：

从MST结合曲线的结果可以看出，Insulin与TCA的相互作用的Kd＝19.3±4.77uM。同时牛磺胆酸与甘氨胆酸的配比为1：1～1：6之间的配比，均有一定的结合；但当牛磺胆酸(TCA)与甘氨胆酸(GCA)的配比为1：2～1：4时，结合力最佳。 Insulin与GCA&TCA的相互作用的Kd＝142±15.1uM，以上结果说明TCA与胰岛素之间有较强的结合，当胰岛素与GCA和TCA同时存在时，仍然有较强的结合，而Insulin单独与GCA之间却没有结合。

MST实验证实：胰岛素单独和甘氨胆酸没有结合，和牛磺胆酸结合力一般，当甘氨胆酸和牛磺胆酸同时存在时，胰岛素和两者有很好的结合。

实验例3：口服胰岛素制剂中胰岛素的活性

1、材料：

模拟胃液：2.0g NaCl，3.2g胃蛋白酶，7ml浓盐酸，双蒸水定容于1000ml。 pH约为1.2。胃蛋白酶活力为2330U/ml pro；

模拟肠液：将6.8gKH₂PO4溶于250ml双蒸水，振荡，完全溶解后加190ml 0.2mol/LNaOH和400ml的双蒸水。加胰蛋白酶10.0，混匀，用0.2mol/L NaOH调PH 7.5，双蒸水定容于1000ml.胰蛋白酶活力为10010U/ml prot。

目的蛋白：实施例6提供的口服胰岛素制剂；

人工胃液的配置：NaCl 10mg；胃蛋白酶：16mg；浓盐酸：35ul；双蒸水定容于5ml；

人工肠液的配置：KH₂PO434mg，溶于1.25ml双蒸水；0.2mol/L NaOH 0.95ml加2ml双蒸水；胰蛋白酶：50mg，用0.2mol/L NaOH调pH至7.5±0.1 双蒸水定容于5ml.

(2)样品：

第一组：不含胰岛素的复合剂(与实施例6相比，区别仅在于：所述制剂中不含有胰岛素)；

第二组：口服胰岛素复合剂(即：实施例6提供的口服胰岛素制剂)；

第三组：标准胰岛素

(3)操作步骤：

标准胰岛素直接上样，以其出峰保留时间为对照。

人工胃液100ul 37℃孵育10分钟，加入标准胰岛素100ul，37℃孵育37℃孵育3分钟，加入无水乙醇90ul，，离心，取上清上样。观察纯胰岛素在胃液中的情况。

不含胰岛素的复合剂100ul加无水乙醇90ul混合，离心，取上清25ul,上样。

不含胰岛素的复合剂100ul加人工胃液100ul 37℃孵育10分钟，反应结束时加入无水乙醇90ul，-20℃1分钟，终止反应。离心，取上清25ul,上样。

观察单纯复合剂中的情况。

取6个干净离心管，在每个管中加入100ul人工胃液，37℃孵育10分钟，再分别加入口服胰岛素复合剂100ul，分别孵育2分钟、10分钟、30分钟、45 分钟、60分钟、120分钟。反应结束时，立即加入无水乙醇90ul,并放入-20℃1 分钟。离心，25ul上样。

(4)高效液相色谱条件：Kromasil C8 250*4.6mm 5um流动相：A相： 0.1％TFA；B相：CH₃CN流速：1.0ml/min梯度：0到30min B相：5％到45％ UV：214nm；仪器Agilent 1200液相色谱仪进样：25ul样100ul+470ul C₂H₅OH离心进上清液。

(5)检测结果：胰岛素出峰时间为26.194，与胰岛素标准品出峰时间一致。

经人工胃液孵育的口服胰岛素复合剂中的胰岛素在人工肠液中稳定性好，在人工肠液中，口服胰岛素在37℃孵育30分钟，活性几乎不变，60分钟仍有 60％活性，120分钟后仍有20％的峰面积。

本实验说明由实施例6组成的复合剂，能够在消化道内可抵御强大的蛋白降解酶的灭活，避免胰岛素在胃肠道被降解。牛磺胆酸和甘氨胆酸与胰岛素的结合屏蔽了胰岛素可被蛋白降解酶结合的位点。

实验例4：SD大鼠药效学实验

1、实验方法及过程

通过高脂模型糖尿病SD大鼠动物实验，观察胰岛素仿生制剂的治疗糖尿病的作用；包括：降糖、胰岛素抵抗、及对糖代谢的作用等。

取成年雄性SD大鼠(清洁级)80只，体重180g－200g，共分为7组。大鼠称重，随机抽出12只作正常组，余下动物随机分成六组，每组12只。高脂高糖饲料：10％猪油，5％蛋黄粉，10％蔗糖，0.5％胆固醇，73％普通饲料。正常组喂普通饲料。2型糖尿病组、胰岛素皮下注射组、去胰岛素复合剂组、三个治疗组，均喂高脂、高糖饲料，共八周。

第九周注射链脲佐菌酶素(STZ)STZ注射前，动物禁食36小时，次日，用PH4的柠檬酸液配STZ.用1％的STZ按25mg/Kg一次性腹腔注射.7天后，餐前血糖≥7mmol/l,或餐后血糖≥16mmol/l为入选目标。

动物按血糖随机分六组，分别为：

正常组：正常饲料，用普通水灌胃，每日1次；

II型糖尿病模型组：高脂高糖饲料，用普通水灌胃，每日1次；

皮下注射胰岛素组：高脂高糖饲料，皮下注射胰岛素27.5uU/100g，每日1 次；

空复合剂组：高脂高糖饲料，除去胰岛素的复合剂，直接灌胃，按中剂量的空复合剂药量(即27.5uU/100g)，每日1次；

小剂量组：高脂高糖饲料，口服胰岛素仿生复合剂(即实施例6提供的口服胰岛素制剂)，直接灌胃8.3uU/100g，每日1次；

中剂量组：高脂高糖饲料，口服胰岛素仿生复合剂(即实施例6提供的口服胰岛素制剂)，直接灌胃27.5uU/100g，每日1次；

大剂量组：高脂高糖饲料，口服胰岛素仿生复合剂(即实施例6提供的口服胰岛素制剂)，直接灌胃55uU/100g，每日1次。

用眼眶静脉丛采血法取血，测给药前、成模后及实验结束时三次血糖，口服糖耐量实验，用葡萄糖氧化酶法检测血糖，用胰岛素Elisa测给药前、成模后及实验结束时两次血清胰岛素含量。

胰岛素抵抗指数：HOMA-IR FBG×FINS/22.5

2、实验结果：

(1)高脂饲料造模II型糖尿病SD大鼠口服胰岛素仿生复合剂治疗过程中血糖比较如表1所示。

表1：血糖比较

	剂量	治疗前血糖	治疗后血糖
				正常组	--	5.0	5.0
模型组	--	26.6	22.6
				注射胰岛素阳性对照组	27.5uU/100g	13.7	15.9
空复合剂组	27.5uU/100g	25.2	20.3
				小剂量组	8.3uU/100g	16.8	10.2
中剂量组	27.5uU/100g	19.8	9.4
				大剂量组	55uU/100g	21.7	12.9

经统计分析，模型组与正常组比较有显著性差异(P<0.01)；空复合剂组与模型组比较无差异；注射胰岛素组，小剂量组与模型组比较有差异(P<0.05)。中剂量组、大剂量组与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。

(2)高脂饲料造模II型糖尿病SD大鼠口服胰岛素仿生复合剂治疗前后, 血清胰岛素含量比较如表2所示。

表2：血清胰岛素比较(uU/L)

	剂量	治疗前血清胰岛素含量	治疗后血清胰岛素含量
				正常组	--	36.271	31.079
模型组	--	33.237	22.970
				注射胰岛素阳性对照组	27.5uU/100g	36.374	22.300
空复合剂组	27.5uU/100g	43.688	23.264
				小剂量组	8.3uU/100g	36.673	25.300
中剂量组	27.5uU/100g	31.947	48.650
				大剂量组	55uU/100g	43.357	28.497

经统计分析，中剂量组与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。

(3)口服胰岛素仿生复合剂治疗后各组胰岛素抵抗指数比较如表3所示。其中，胰岛素抵抗指数计算公式：空腹胰岛素*空腹血糖/22.5。

表3：胰岛素抵抗指数比较

经统计分析，注射胰岛素组，大剂量组与模型组比较有差异(p<0.05)，小剂量组与模型组比较有显著性差异(p<0.01)。可见，本制剂有较好的降糖效果，显著降低胰岛素抵抗指数等。

实验例5：Micro PET方法评价口服胰岛素复合剂(实施例6提供的口服胰岛素制剂)与皮下注射胰岛素对ICR糖尿病小鼠糖代谢影响

实验结果显示：动物在口服胰岛素灌胃45分钟后，血糖开始下降，下降峰值在1.5-2.5小时，很少出现严重低血糖的情况，其降糖速度与幅度低于皮下注射胰岛素，但口服胰岛素对机体糖代谢的作用远优于皮下注射胰岛素，表现在重要脏器，如心、脑、肠、肝和肾等18F-FDG的浓聚程度高于皮下注射胰岛素组小鼠，更接近正常组小鼠。口服胰岛素对心脏糖代谢的影响是一个持续上升的过程。对脑糖代谢的影响远优于皮下注射胰岛素途径。结论：皮下注射胰岛素组可以在短时间内迅速降低血糖，但极易出现严重低血糖，甚至死亡等情况；口服胰岛素不但能降低血糖，且极少发生低血糖情况；最重要的是口服胰岛素组动物重要脏器上摄取18F-FDG的能力明显高于皮下注射胰岛素组小鼠，更接近正常组的情况。与皮下注射胰岛素相比，口服胰岛素能更好地调节糖尿病机体的糖代谢紊乱，值得进一步研究。具体各组动物重要脏器糖代谢情况如下：

(1)心脏：各组小鼠心脏摄取18F-FDG的情况：正常组动物的心肌摄取 SUV最高，口服胰岛素组动物的心肌摄取高于皮下注射组、空复合剂组和糖尿病组动物，但低于正常组。皮下注射组动物的心肌摄取高于糖尿病组，但低于正常组和口服胰岛素组。空复合剂组动物的心肌摄取和糖尿病组动物相当。另外，皮下注射胰岛素组动物心肌18F-FDG的摄取在1500s左右时开始不再变化，达到平衡；而口服胰岛素组动物心肌摄取18F-FDG的量在动态扫描的全部过程 (3600s)一直处于上升趋势，直至实验结束时仍未到达平衡状态。

(2)脑：各组动物脑摄取18F-FDG的情况：正常组动物的脑摄取SUV值最高，口服胰岛素组动物的脑摄取高于皮下注射胰岛素组动物，皮下注射胰岛素组动物和空复合剂组动物的脑摄取相当，均高于糖尿病组动物。但皮下注射胰岛素组动物和糖尿病组动物脑摄取趋势一致，在动态扫描的全程中(3600s)， 300s后基本处于缓慢下降过程，而口服胰岛素组动物和正常组动物脑摄取18F-FDG趋势基本一致，300s后处于平衡状态。

(3)肠：各组动物肠摄取情况：口服胰岛素组要高于其他四组，其他四组摄取情况相当。

(4)肝：各组动物肝脏摄取情况：口服胰岛素组和空复合剂组动物肝脏摄取18F-FDG的情况和糖尿病组动物相当，稍高于正常组和皮下注射胰岛素组动物，但是各组动物在动态扫描的3600s内，肝脏摄取趋势基本一致，都是在30 s左右肝脏18F-FDG摄取逐渐降低。

(5)肾：各组动物肝脏摄取情况：每一组都有约6-7只出现个体左右肾摄取 18F-FDG差别较大的情况，但从各组动物肾脏平均值的直方图来看，肾脏上 18F-FDG摄取基本一致，无明显变化。

实验例6：小量临床实验

各案例中病人服用的药物均为实施例6提供的口服胰岛素制剂。

案例1：徐xx，女性，55岁；职业：护士长

病史：发现血糖异常升高近两年，到当地市医院就诊，查空腹血糖9.7mmol/l. 餐后2小时血糖20mmol/l.诊断2型糖尿病，用二甲双胍0.25,每日三次。血糖不能很好控制，加用基因重组人胰岛素。开始用小剂量，每日两次，血糖控制不佳，直至用胰岛素，早19个单位，晚13个单位。二甲双胍0.5每日三次，血糖才控制在空腹5.3-7.3mmol/l,餐后2小时10.9-11.0mmol/l.因不能耐受天天注射，且经常易发生低血糖反映，要求口服胰岛素。

病人从2008年11月20日开始接受实施例1提供的口服胰岛素治疗，剂量为早6-8个单位，中午4个单位，晚6-8个单位。中成药协和胰宝两粒，每日三次，血糖控制在空腹4-6mmol/l,餐后两小时7-10mmol/l.口服胰岛素治疗至今，自我感觉良好，原血脂增高，现基本正常。

案例2：袁xx，男性，62岁；职业：医生

病史：患2型糖尿病7年，平时服二甲双胍0.25每日两次，迪沙,早5mg，晚2.5mg血糖控制在空腹5.6-6.0mmol/l,餐后2小时8.4-9.0mmol/l.

2008年9月28日开始，改服实施例1提供的口服胰岛素，4个单位每日两次，血糖空腹5.2-6.4mmol/l，餐后两小时7.0-10.0mmol/l。

案例3：崔xx，女性，81岁；职业：干部

病史：患2型糖尿病26年余，长期服二甲双胍0.5,每日三次，优降糖、达美康、拜糖苹等药物治疗.效果越来越差。2004年患脑中风，1995年开始注射胰岛素，2000年该用诺和灵R30，五年前改用诺和灵R50至改用口服胰岛素之前。诺和灵R50用量：早20个单位，晚12个单位。因餐后血糖控制差，加用拜糖苹每日2次。血糖控制在空腹3.0-5.0mmol/l,餐后2小时9.9-12.0mmol/l.但经常出现较严重的低血糖反映，年龄越大，出现这种情况越多。

2008年11月24日改用实施例1提供的口服胰岛素，早8个单位，晚6 个单位，并各加协和胰宝(一种中成药，以下相同)2粒，拜糖苹50mg各一次，血糖控制在空腹5.1-6.0mmol/l,餐后2小时9.0-12.0mmol/l。

案例4：薛xx，女性，49岁；职业：干部

病史：患2型糖尿病19年(围产期糖尿病)，发病后服二甲双胍，每日三次，拜糖苹50mg,每日2次，同时控制饮食加锻炼，一般血糖控制在空腹 5.0-7.0mmol/l,餐后10.0mmol/l左右，后因血糖逐渐控制不佳，加用协和胰宝，去掉拜糖苹，血糖控制在理想范围。

2008年10月3日开始服用实施例1提供的口服胰岛素，早6个单位，晚 4个单位，协和胰宝2粒，每日两次.血糖控制在空腹3.0-6.4mmol/l,餐后2小时 7.0-10.0mmol/l。

小结：2型糖尿病人，病史从1年至29年不等。患者年龄最长84岁，口服本胰岛素前注射胰岛素患者2例，注射剂量为32u/日，34u/日；改口服胰岛素后，口服剂量每人20u/日；全部病人大部分时间空腹血糖控制在4～7mmol/l, 餐后血糖控制在8～10mmol/l左右，较其他药物控制的血糖更平稳。且无一例发生低血糖反应。对II型糖尿病所引起的各种不适如四肢发麻、触电感，眼分泌物增多，胸闷不适等症状得到缓解。可使体重减轻，血脂下降，血压平稳，推测本制剂对II型糖尿病所引发的并发症有防治作用。(早期应用时，口服胰岛素的用量如上所述，但在最近几年，因工艺的改进，口服胰岛素的用量优选为 1～2u/d)

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种与蛋白质类药用活性成分结合使用的配体，其特征在于，所述配体由牛磺胆酸和甘氨胆酸组成。

2.根据权利要求1述的配体，其特征在于，所述配体通过与蛋白质类药用活性成分形成结合物以保护所述药用活性成分经口服而不被降解；

优选地，所述配体与蛋白质类药用活性成分的蛋白酶酶切位点结合，且不与其活性功能位点结合；所述蛋白酶包括胃蛋白酶和/或胰蛋白酶。

3.根据权利要求1或2所述的配体，其特征在于，所述牛磺胆酸和甘氨胆酸的用量比为1:1～1:6，优选为1:2～1:4。

4.权利要求1～3任一项所述配体在制备蛋白质类药物制剂中的应用；优选所述蛋白质类药物制剂中蛋白质类药用活性成分选自胰岛素、生长素、黄体酮、睾丸酮、雌激素。

5.一种口服蛋白质类药物制剂，其特征在于，所述制剂为：以权利要求1～3任一项所述配体与蛋白质类药用活性成分形成的结合物为中心、外侧包裹纳米脂质体的微粒。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述微粒的粒径为纳米级，优选为10～100nm。

7.根据权利要求5或6所述的制剂，其特征在于，所述结合物由如下重量份的成分组成：蛋白质类药用活性成分1份，牛磺胆酸1～9份，甘氨胆酸5～19份；

或由如下重量份的成分组成：蛋白质类药用活性成分1份，牛磺胆酸101～160份，甘氨胆酸101～500份。

8.根据权利要求5～7任意一项所述的制剂，其特征在于：所述蛋白质类药用活性成分选自胰岛素、生长素、黄体酮、睾丸酮、雌激素，优选为胰岛素。

9.权利要求5～8任一项所述口服蛋白质类药物制剂在制备治疗和/或预防蛋白质类药用活性成分缺乏所导致疾病的药物中的应用；

优选所述蛋白质类药用活性成分缺乏所导致疾病为II型糖尿病。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物通过口服使用，每日口服共1～3个单位，优选为1～2个单位；每日口服1～2次。