CN109394754B - 一种fty720和莪术醇联合制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗癌药物研究领域，具体涉及一种FTY720和莪术醇联合制剂及其应用。本发明的FTY720和莪术醇联合制剂，具有协同效应，比单用其中任意一种药物，具有更强的抑制细胞增殖作用和显著诱导细胞凋亡的功能。本发明中药物联合制剂的应用，在实验室具有显著效果，适用于临床上红白血病患者的治疗以及慢性粒细胞性白血病患者的治疗。

Description

一种FTY720和莪术醇联合制剂及其应用
技术领域
本发明属于抗癌药物研究领域，具体涉及一种FTY720和莪术醇联合制剂及其应用。
背景技术
红白血病属于急性非淋巴细胞白血病中的一种，亦称之为Di Guglielmo综合征，指造血系统中红系与白系同时增生的恶性疾病，按FAB分型标准定为M6型，约占急性白血病的3％，男女发病率相等，无年龄差异。红白血病也可由化疗诱发，少数由慢性粒细胞白血病或真性红细胞增多症转化而成。本专利中使用的k562细胞既可以归类为红白血病细胞，也可以归类为慢性粒细胞白血病细胞。
细胞凋亡(apoptosis)，亦称程序性细胞死亡(programmed cell death)，指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，由基因控制的主动的死亡过程。细胞凋亡是一种不同于坏死的死亡方式，是细胞内在的有规律的自我消亡。这种死亡没有溶酶体和细胞膜的破裂，没有细胞内容物外泄，而是细胞膜皱缩、内陷将细胞自行分割包被形成多个内含数目不等的细胞器凋亡小体，凋亡小体被吞噬细胞识别、吞噬或自然脱落而离开生物体，不引起炎症反应和次级损伤。研究发现，细胞凋亡与细胞的正常发育有关，而且使得损坏细胞或者机能紊乱细胞的自我毁损能够在一种可控的方式下进行。细胞凋亡中很多重要调节子都是潜在的癌基因，细胞凋亡失控会导致细胞内DNA受损，进而发展成为癌细胞。细胞凋亡调控细胞生长和增殖之间的平衡，清除不需要的细胞，其凋亡机制作为可能的癌症治疗策略是目前研究的热点，与caspase基因家族、bcl-2基因家族密切相关。
FTY720(2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)]-1,3-propanediol hydro-chloride)商品名为芬戈莫德(Fingolimod)，化学式C19H33NO2.HCl，其相对分子质量为343.9，是一种新型免疫抑制剂。于1995年由日本藤多哲朗教授与吉富制药公司合作，从冬虫夏草(子囊菌亚门赤僵菌)培养液中提取出来的抗生素成分ISP-1进行化学修饰(在ISP-1的羟链上引入苯环和羟烷基)后改造合成的。易溶于水和乙醇。目前。FTY720主要应用于治疗自身免疫病和降低器官移植的免疫排斥，微摩尔级别的FTY720对较多肿瘤存在治疗效果，包括：人体卵巢癌、肺癌、结肠癌、肝移植瘤、乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、肝癌等。FTY720能激活caspase信号通路或者线粒体凋亡信号通路进而诱导细胞发生凋亡，并能与部分化疗药物有协同效应。我们研究研究发现FTY720对粒系(白细胞)有明显抑制作用。
莪术醇(Curcumol)，异名为姜黄醇，姜黄环氧薁醇，分子式C15H24O2，其相对分子质量为236.34，从姜科植物莪术根茎的挥发油中的提取物，是一种广谱抗肿瘤药物。莪术醇是一种具有半缩酮的氢化奥类化合物,由五元环和六元环并合而成,其中的七元环通过半缩酮的氧桥，又形成了一个五元环和六元环，因而使得三个环的张力变小，形成了具有刚性结构的较稳定的化合物易溶于DMSO(二甲基亚砜)和乙醇。莪术醇已见报导中对多种肿瘤具有治疗作用，包括：人结肠癌、三阴性乳腺癌、膀胱癌、人肺腺癌，胆管癌、非小细胞肺癌等，但鲜见莪术醇在恶性血液肿瘤方面的报导。前期研究发现，莪术醇能诱导红白血病细胞K562细胞株向粒细胞分化，并抑制其增殖。莪术醇具有广谱的抗肿瘤效用，在抗肿瘤研究中存在巨大的开发利用价值。
目前未见FTY720和莪术醇联合应用，也未见其应用于红白血病及慢性粒细胞白血病研究。
发明内容
针对现有研究存在的空白，本发明提供一种FTY720和莪术醇联合制剂及其应用，目的是利用FTY720和莪术醇的协同效应，产生比两者药物单用具有更好的抑制细胞增殖的作用，并显著诱导细胞凋亡，产生更强的生物学功能。基于本研究发现，以后将适用于作为临床上红白血病患者以及慢性粒细胞性白血病患者的治疗药物。
本发明的FTY720和莪术醇联合制剂，最佳联合用药的浓度组合为：FTY720(3μM)+莪术醇211.6μM；具有协同效应的联合用药的浓度组合为：FTY720(3μM)+莪术醇211.6μM；FTY720(1μM)+莪术醇211.6μM；FTY720(0.5μM)+莪术醇211.6μM；FTY720(3μM)+莪术醇105.8μM。
凡是在上述浓度组成范围内的两种药物的浓度配比都受到专利授权保护，即FTY720的浓度范围为0.5μM-3μM，莪术醇浓度范围为105.8nM-211.6nM。
本发明的FTY720和莪术醇联合制剂用于红白血病和慢性粒细胞白血病治疗的药物的用途。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明的FTY720和莪术醇两者联用形成的联合制剂，比两者单用具有更好的抑制细胞增殖的作用，两者联用能极显著的诱导k562细胞发生凋亡。
该FTY720和莪术醇联合制剂，大大提高了杀伤红白血细胞及慢性粒细胞白血病细胞K562的效率，这一协同效应，具有极大的发展前景和潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例采用CCK-8法检测FTY720和莪术醇对K562细胞单用和使用联合制剂后对K562细胞存活率的影响；
其中K562是人类红白血病细胞系，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图2为本发明实施例采用CCK-8法检测不同组分浓度的FTY720和莪术醇联合制剂对K562细胞的协同效应；
其中：Fa：抑制率；CI：协同指数；
图3为本发明实施例采用Annexin V/PI双染色法流式检测FTY720和莪术醇对K562细胞单用和使用联合制剂后对凋亡的诱导作用；
其中DMSO组为对照；
图4为本发明实施例采用PI单染色法流式检测FT Y720和莪术醇对K562细胞单用和使用联合制剂后对周期的阻滞作用；
其中DMSO组为对照。
具体实施方式
下面列举实施例并结合附图对本发明进行详细说明，但本发明不受这些实施例的限制。
本发明实施例中采用的FTY720和莪术醇皆是购买自Selleck公司。
实施例1
本实施例采用CCK-8方法检测FTY720和莪术醇对K562细胞单用和采用联合制剂后对K562细胞存活率的影响。
实验步骤：
(1)收集对数生长期的K562细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，96孔板铺板，使待测细胞密度为1*105个/mL；
(2)设置不加细胞只有培基的凋零组以及不加药物适当浓度的DMSO组，每个浓度设置3-5个平行孔；
(3)分别加入3μM FTY720、211.6μM莪术醇以及3μM FTY720和211.6μM莪术醇联合制剂，置于5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育48小时；
(4)每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃条件下避光孵育2小时，用酶标仪在450nm波长处测量各孔的OD值，进行统计学分析，计算细胞相对存活率。
实验结果如图1所示。结果表明，FTY720和莪术醇联合制剂对K562细胞的抑制增殖效果比FTY720和莪术醇单用更强，统计学分析具有极显著性差异。
实施例2
本实施例采用CCK-8方法检测不同浓度组合的FTY720和莪术醇制剂对K562细胞的协同效应。
实验步骤：
(1)收集对数生长期的K562细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，96孔板铺板，使待测细胞密度为1*105个/mL；
(2)设置不加细胞只有培基的调零组以及不加药物适当浓度的DMSO对照组，每个浓度设置3-5个平行孔；
(3)分别加入不同浓度组合的FTY720和莪术醇制剂，联合制剂浓度分别为0.5μM+211.6μM、1μM+105.8μM、1μM+211.6μM、3μM+105.8μM、3μM+211.6μM，置于5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育48小时；
(4)每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃条件下避光孵育2小时，用酶标仪在450nm波长处测量各孔的OD值，进行统计学分析，计算细胞相对存活率。
实验结果如图2和表1所示所示。结果表明，高浓度FTY720和莪术醇联合制剂的具有较强的协同作用(CI值为0.21)，在K562细胞中，莪术醇低浓度时和FTY720的协同作用不强，甚至是拮抗作用(CI值为1.36)；当莪术醇浓度达到50ug/mL(211.6μM)时，莪术醇和FTY720的显示出较好的协同作用。
表1不同的组分浓度FTY720和莪术醇联合制剂对K562细胞的作用效果表
FTY720(μM) 莪术醇(μM) Fa CI
0.5 211.6 0.64 0.21
1 105.8 0.76 1.36
1 211.6 0.61 0.23
3 105.8 0.59 0.51
3 211.6 0.14 0.023
实施例3
本实施例采用Annexin V/PI方法检测FTY720和莪术醇对K562细胞单用和使用联合制剂后诱导凋亡的作用。
实验步骤：
(1)收集对数生长期的K562细胞，调整细胞悬液浓度为2.5*105个/mL于6孔板中，总体积为2mL，然后分别加入3μM FTY720、211.6μM莪术醇、以及3μM FTY720和211.6μM莪术醇的联合制剂，以对应浓度的DMSO处理组为对照，置于细胞培养箱中孵育48小时；
(2)收集细胞，300g，4℃离心5min收集细胞，用预冷的DPBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4℃离心5min，收集2-5*105个细胞；
(3)加入100μL 1xBinding Buffer重悬细胞；
(4)加入5μL Annexin V-FITV和5μL PI Staining Solution，轻轻混匀；
(5)避光，室温反应10min；
(6)加入400μL DPBS，轻轻混匀，并将其转移至流式管中，用流式细胞仪检测凋亡情况。
实验结果如图3所示。结果表明，FTY720和莪术醇联合制剂能极显著的诱导K562细胞发生凋亡，与FTY720、莪术醇单用相比，两药联用凋亡诱导率上调60％以上。
实施例4
本实施例采用PI法流式检测FTY720和莪术醇对K562细胞单用和联用后的周期阻滞作用。
实验步骤：
(1)收集对数生长期的K562细胞，调整细胞悬液浓度为2.5*105个/mL于6孔板中，总体积为2mL，然后分别加入3μM FTY720、211.6μM莪术醇、以及3μM FTY720和211.6μM莪术醇联合制剂，以对应浓度的DMSO处理组为对照，置于细胞培养箱中孵育48小时；
(2)收集细胞，300g，4℃离心5min收集细胞，用预冷的DPBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4℃离心5min，收集2-5*105个细胞；
(3)加入300μL DPBS重悬细胞后，将300μL DPBS细胞悬液逐滴加入700μL冰乙醇，-20℃固定3小时以上；
(4)13000rpm/10s，吸弃上清，加入1mL DPBS重悬，13000rpm/10s，吸弃上清，再加入1mL DPBS重悬，吸弃上清，加入200μLPI染液；
(5)避光，室温反应30min；
(6)加入1mL DPBS，轻轻混匀，洗去染液，加入500mL DPBS重悬细胞，过单细胞滤网，将其转移至流式管中，用流式细胞仪检测周期变化。
实验结果如图4所示。结果表明，FTY720和莪术醇联合制剂能极显著的诱导K562细胞发生周期阻滞，与FTY720、莪术醇单用相比，联合制剂的周期阻滞作用更明显。
虽然结合附图描述了本发明的实施方式，但是专利所有者可以在所附权利要求的范围之内做出各种变形或修改，只要不超过本发明的权利要求所描述的保护范围，都应当在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种FTY720和莪术醇联合制剂，具有协同效应的联合用药的浓度组合为：FTY720 3μM+莪术醇211.6μM；FTY720 1μM+莪术醇211.6μM；FTY720 0.5μM+莪术醇211.6μM；FTY720 3μM+莪术醇105.8μM。
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