CN109387481A - 一种检测圆二色性的装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测圆二色性的装置与方法，使波长在可见光区的激光经过调制成为左圆偏振光和右圆偏振光，使调制好的手性光透过具有超分辨成像能力的透明微球照射到手性分子膜上，透明微球对光的聚焦能力使手性分子对左圆偏振光和右圆偏振光的吸收差异增大进而被锁相放大器检测，从而达到降低圆二色谱的检测限的目的，同时利用透明微球的超分辨能力来识别相邻的手性分子团簇，能够更有效的检测手性物质。与传统技术相比，本发明可实现快速、准确、非侵入的检测手性分子，增强检测信号。具有操作方便、样品用量少，对生物样品无接触性损伤，保持手性物质原有的生物特性等优点。

Description

一种检测圆二色性的装置与方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测圆二色性的装置与方法。

背景技术

手性(Chirality)是几何学上的一个概念,含义是手。早在19世纪中期，就有化学家发现晶体的溶液可以分别把线偏振光转变为左圆偏振光和右圆偏振光，即之后所谓的旋光现象。手性分子的定义是一个分子与它的镜像不重合，那么它和其镜像均为手性分子，且互为对映体。人们通常将手性分子标记为L-(levo，左旋)构象和D-(Dextro，右旋)构象,或者是S(sinister,左旋)和R(rectus，右旋)构象。手性分子是生命的要素之一，很多生物手性分子如蛋白质，氨基酸，核酸，糖类，自然产物如类固醇，激素，信息素，等在生命活动中起着重要的作用。

过去，最常用的手性定量计算的是根据圆二色谱进行的，圆二色谱的横坐标是波长，纵坐标是椭圆率θ，单位是毫度(mdeg)。圆二色谱信号产生的原理是手性分子对左圆偏振光和右圆偏振光吸收差异，对这种差异程度进行测量和计算就可以定量的表征手性分子的手性程度的大小，也就是圆二色性的大小。

由于大多数生物分子都是在紫外区有吸收，可见光区的研究较少，但又因为可见光具有更稳定并且有更好的光学性质，学者们一直致力于可见光区的圆二色性的研究。在2011年，Yiqiao Tang等人利用543nm激光经过液晶相位可变延迟器调制为手性光用以提高手性分子的对映选择性。其主要理论是，利用基片上涂有的金属膜的反射作用，使入射圆偏振光光和经金属膜部分反射的圆偏振光光产生带有节点的驻波，由于驻波的节点处的电场能量密度减少，也就是减小上图不对称因子g公式中的Ue，进而轻微的提高了手性分子的圆二色信号。在2017年，Chi-Sing Ho等人提出设想，利用电介质硅微球增大光手性程度C的性质，提高对映体选择性，与没有微球的圆偏振光情况下相比，可以使库恩不对称因数增加7倍，从而增大圆二色信号。

在科学工作者们的长期探索下，已经有一些比较成熟的方式用于检测手性分子，常见的手性识别的方法有高效液相色谱、核磁共振和光谱法三种，而其中的圆二色谱法简便快速，对样品要求不高，得到广泛的应用。但通常圆二色谱的信号比较弱，对于小的或低浓度手性分子信号可能会被掩盖，例如非侵入，低浓度等检测条件,所以提高圆二色谱信号的方法一直是研究者们追求的。而且对手性分子进行圆二色性检测时，样品大多是溶液，且测试的时间较久，无法广泛应用于低浓度分子膜检测和实时观察识别相邻手性分子颗粒方面的研究中。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种装置简单、结果可靠的新型检测圆二色性的装置及方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种检测圆二色性的装置，该装置包括用于放置待测样品的样品台、设置在样品台上方的物镜、与物镜连接的及激光单元和照明单元、设置在样品台下方的聚光镜以及与聚光镜连接的检测单元，所述待测样品包括两块盖玻片、设置在两块盖玻片之间的透明微球以及铺设在下方盖玻片上表面的待测手性分子膜，所述激光单元包括依次设置的激光光源、一号二色向镜、偏振棱镜和手性光调制元件，并可在相邻两个元件之间设置用于改变光传播方向的反射镜，所述照明单元包括依次设置的白光光源、一号二色向镜、偏振棱镜和手性光调制元件，并可在相邻两个元件之间设置用于改变光传播方向的反射镜，从所述手性光调制元件射出的光射入物镜中，所述检测单元包括二号二色向镜、一号透镜、二极管阵列检测器、二号透镜和CCD相机，从所述二号二色向镜射出的一路光线经过二号透镜被CCD相机检测，所述CCD相机与计算机连接用于观测透明微球的成像；从所述二号二色向镜射出的另一路光线经过一号透镜被二极管阵列检测器检测，然后通过锁相放大器将光信号传递给计算机。

本装置采用一束可见光区的激光调制成左圆偏振光和右圆偏振光，聚焦在具有超分辨成像能力的透明微球上然后照射到样品手性分子上。具体来说，当一束高会聚的圆偏振光经过一透明微球时，透明微球本身的折射率大于周围介质的折射率，光束会在透明微球中发生折射，圆偏振光经过透明微球后照射到样品膜表面，由透明微球产生的折射光透过样品膜被聚光镜所收集，经二极管阵列检测器所检测。由此，将透明微球折射光的光信号转换成数字信号，由数据采集卡采集，从而可以测得样品分子的手性程度大小。另外，本装置的照明光源经过样品池后被CCD相机获取而成像，将图像信息传输至计算机中。至此，操作者通过计算机屏幕实时观察到样品池中透明微球与激光光斑的关系，从而可以通过本装置快速的检测手性分子的圆二色性信号的大小。

两块所述的盖玻片相互粘结并在中部留有中空区域，所述透明微球和待测手性分子膜设置在中空区域中，所述透明微球的顶端和底端分别与两块盖玻片抵接，所述中空区域中填充水。

所述透明微球为钛酸钡微球，所述透明微球的直径为2～100μm。

所述激光光源为紫外-可见区激光。

所述激光光源的波长为400～800nm。

所述手性光调制元件为温度稳定液晶可变相位延迟器。

所述装置包括用于温度稳定液晶可变相位延迟器偏振光切换频率及锁相放大器切换频率的频率发生器。

一种利用如上所述装置进行检测圆二色性的方法，包括以下步骤：

1)将待测样品放置在样品台上，打开白光光源及激光光源，通过计算机观测所述CCD相机的成像，然后调整样品台的位置，使得激光光源发出的激光聚焦在单个透明微球上，固定样品台并关闭白光光源；

2)确定手性光调制元件发出左圆偏振光和右圆偏振光时所需的电压；

3)调节手性光调制元件，使之发出的光在左圆偏振光和右圆偏振光两者之间切换，并同时调整锁相放大器的检测频率使之与手性光调制元件发出左圆偏振光或右圆偏振光相匹配，通过二极管阵列检测器检测来自于聚光镜的光信号，并通过锁相放大器传递给计算机，完成检测。

步骤2)中确定手性光调制元件发出左圆偏振光和右圆偏振光时所需的电压的步骤如下：

在手性光调制元件(7)下方添加一块可拆卸的线偏振片，然后在线偏振片下方放置功率计，旋转线偏振片，观察功率计的度数变化，当旋转一周线偏振片，功率计的读数出现两次0和两次最大值时，可以确定该电压下手性光调制元件(7)发出的为偏振光；

调节手性光调制元件(7)的电压，当旋转一周线偏振片，功率计的读数最小值及最大值的幅度稳定在5％内时，即确定手性光调制元件(7)输出的是是左圆偏振光或右圆偏振光。

所述锁相放大器(17)将降噪后的检测样品的电信号数据传递给计算机，计算机根据数据采集卡得到一段时间内的检测数据，然后根据一定检测时间内的电压值可以计算得到电压值的变化图，即为待测手性分子膜(21)的圆二色性。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：

(1)通过本装置实现对手性分子的圆二色性的测量，降低检测限，更能准确的实时识别相邻的不同的手性分子纳米颗粒，为十分微小的圆二色信号的提高提供一个可行性方法；

(2)通过本装置中小型腔体的构建，用较小的剂量，保证透明微球所需的液体环境；同时对样品膜不会造成接触性损伤，在实验中也保持了手性分子的生物特性；

本发明构建较为简单，便于观察与控制透明微球对激光的聚焦；能够实时识别相邻的不同的手性分子纳米颗粒，并快速测量手性分子的圆二色性。

附图说明

图1为本发明装置的光路示意图；

图2为本发明待测样品的结构示意图；

图3为实施例1中测得的信号响应差异图。

其中，1为激光光源，2为一号反射镜，3为一号二向色镜，4为白光光源，5为二号反射镜，6为偏振棱镜，7为手性光调制元件，8为物镜，9为样品台，10为聚光镜，11为三号反射镜，12为二号二向色镜，13为一号透镜，14为二极管阵列检测器，15为二号透镜，16为CCD相机，17为锁相放大器，18为频率发生器，19为盖玻片，20为透明微球，21为待测手性分子膜。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种新型的检测圆二色性的装置，该装置包括激光单元、照明单元和检测单元，样品池中放置透明微球水溶液，本次选择的是钛酸钡微球水溶液和手性分子膜，本次选择的是叶绿素a分子膜(模拟涂覆手性分子膜的表面)。光路如图1所示，其中，激光单元和检测单元包括依次设置的：激光光源1、一号反射镜2、一号二向色镜3、二号反射镜5、偏振棱镜6、手性光调制元件7、物镜8、样品台9、聚光镜10、三号反射镜11、二号二向色镜12、一号透镜13及二极管阵列检测器14。而照明单元和检测单元依次包括白光光源4、一号二向色镜3、二号反射镜5、偏振棱镜6、手性光调制元件7、物镜8、样品台9、聚光镜10、三号反射镜11、二号二向色镜12、二号透镜15及CCD相机16。待测样品包括不锈钢支撑板以及粘结在不锈钢支撑板一侧的双层盖玻片19，不锈钢支撑板的中部设有通孔，双层盖玻片包括两片相互粘结的盖玻片19，在两块盖玻片19之间形成小型腔体，透明微球20和待测手性分子膜21，如图2所示。

利用上述装置进行检测圆二色性的方法，包括以下步骤：

(1)样品及样品池的制作；

首先，取盖玻片，并对其清洗，步骤为：依次在2％洗液、超纯水、丙酮、超纯水、甲醇、超纯水中超声30分钟，用高纯N₂吹干备用。其次，取不锈钢支撑板，在一侧粘上双面胶，放上玻片，将透明微球均匀地分散在样品膜上，滴入一滴纯水，再放另一盖玻片，轻压两盖玻片，使形成小型的腔体，从而使透明微球固定于两玻片间。最后，将样品池放置在样品台固定。

(2)圆二色性信号差异响应的实验操作部分：

将样品池放置在样品台上，打开激光光源和白光光源，激光经过物镜被高度聚焦于样品池内，通过手动粗调节样品台，直至使激光聚焦在钛酸钡微球表面，通过计算机观测CCD所成的像，再进一步调节样品台，使激光聚焦在单个的透明微球上。然后关闭白光光源，使激光调制为手性光，使调制光学元件出射的光分别是左圆偏振光和右圆偏振光。再使用二极管阵列检测器检测经微球折射后的透过样品膜的光信号，将其转换成数字信号，由数据采集卡所采集，传输至另一计算机中并储存。

其中，圆偏振光的检测的具体的方法是在手性光调制元件的下方添加一块可拆卸的线偏振片，在其后再放置一个功率计用来检测光强，每旋转一周线偏振片，通过观察功率计的示数变化，可以判断是否为圆偏振光。

调试装置得到光信号响应差异的具体做法是，设置手性光调制元件的状态，使其出射光是互相垂直的线偏振光，再把一块可拆卸的线偏振片放置在调制元件的下方，其后再放置功率计，用以检验两个电压下的光是否是垂直的线偏振光。调制完成后，把线偏振片的偏振轴放在这两束垂直的线偏振光的中间，在此基础上，分别把线偏振片向左右各旋转1°，再使用二极管阵列检测器直接检测光信号，将其转换成数字信号，由数据采集卡所采集，传输至另一计算机中并储存。

(3)由数据采集卡所采集的数据经处理之后，得装置信号响应差异图，如图3所示，由此得到装置可以检测到0.1°微小变化的信号，即能检测到0.3％的能量差异信号，故此装置可以有望于降低圆二色性的检测限。

Claims (10)

1.一种检测圆二色性的装置，其特征在于，该装置包括用于放置待测样品的样品台(9)、设置在样品台(9)上方的物镜(8)、与物镜(8)连接的及激光单元和照明单元、设置在样品台(9)下方的聚光镜(10)以及与聚光镜(10)连接的检测单元，所述待测样品包括两块盖玻片(19)、设置在两块盖玻片(19)之间的透明微球(20)以及铺设在下方盖玻片(19)上表面的待测手性分子膜(21)，所述激光单元包括依次设置的激光光源(1)、一号二色向镜(3)、偏振棱镜(6)和手性光调制元件(7)，并可在相邻两个元件之间设置用于改变光传播方向的反射镜，所述照明单元包括依次设置的白光光源(4)、一号二色向镜(3)、偏振棱镜(6)和手性光调制元件(7)，并可在相邻两个元件之间设置用于改变光传播方向的反射镜，从所述手性光调制元件(7)射出的光射入物镜(8)中，所述检测单元包括二号二色向镜(12)、一号透镜(13)、二极管阵列检测器(14)、二号透镜(15)和CCD相机(16)，从所述二号二色向镜(12)射出的一路光线经过二号透镜(15)被CCD相机(16)检测，所述CCD相机(16)与计算机连接用于观测透明微球(20)的成像；从所述二号二色向镜(12)射出的另一路光线经过一号透镜(13)被二极管阵列检测器(14)检测，然后通过锁相放大器(17)将光信号传递给计算机。

2.根据权利要求1所述的一种检测圆二色性的装置，其特征在于，两块所述的盖玻片(19)相互粘结并在中部留有中空区域，所述透明微球(20)和待测手性分子膜(21)设置在中空区域中，所述透明微球(20)的顶端和底端分别与两块盖玻片(19)抵接，所述中空区域中填充水。

3.根据权利要求1所述的一种检测圆二色性的装置，其特征在于，所述透明微球(20)为钛酸钡微球，所述透明微球(20)的直径为2～100μm。

4.根据权利要求1所述的一种检测圆二色性的装置，其特征在于，所述激光光源(1)为紫外-可见区激光。

5.根据权利要求4所述的一种检测圆二色性的装置，其特征在于，所述激光光源(1)的波长为400～800nm。

6.根据权利要求1所述的一种检测圆二色性的装置，其特征在于，所述手性光调制元件(7)为温度稳定液晶可变相位延迟器。

7.根据权利要求6所述的一种检测圆二色性的装置，其特征在于，所述装置包括用于温度稳定液晶可变相位延迟器偏振光切换频率及锁相放大器(17)切换频率的频率发生器(18)。

8.一种利用如权利要求1～7任一所述装置进行检测圆二色性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将待测样品放置在样品台(9)上，打开白光光源(4)及激光光源(1)，通过计算机观测所述CCD相机(16)的成像，然后调整样品台(9)的位置，使得激光光源(1)发出的激光聚焦在单个透明微球(20)上，固定样品台(9)并关闭白光光源(4)；

2)确定手性光调制元件(7)发出左圆偏振光和右圆偏振光时所需的电压；

3)调节手性光调制元件(7)，使之发出的光在左圆偏振光和右圆偏振光两者之间切换，并同时调整锁相放大器(17)的检测频率使之与手性光调制元件(7)发出左圆偏振光或右圆偏振光相匹配，通过二极管阵列检测器(14)检测来自于聚光镜(10)的光信号，并通过锁相放大器(17)传递给计算机，完成检测。

9.根据权利要求8所述的一种检测圆二色性的方法，其特征在于，步骤2)中确定手性光调制元件(7)发出左圆偏振光和右圆偏振光时所需的电压的步骤如下：

在手性光调制元件(7)下方添加一块可拆卸的线偏振片，然后在线偏振片下方放置功率计，旋转线偏振片，观察功率计的度数变化，当旋转一周线偏振片，功率计的读数出现两次0和两次最大值时，可以确定该电压下手性光调制元件(7)发出的为偏振光；

调节手性光调制元件(7)的电压，当旋转一周线偏振片，功率计的读数最小值及最大值的幅度稳定在5％内时，即确定手性光调制元件(7)输出的是是左圆偏振光或右圆偏振光。

10.根据权利要求8所述的一种检测圆二色性的方法，其特征在于，所述锁相放大器(17)将降噪后的检测样品的电信号数据传递给计算机，计算机根据数据采集卡得到一段时间内的检测数据，然后根据一定检测时间内的电压值可以计算得到电压值的变化图，即为待测手性分子膜(21)的圆二色性。