CN109381515A - 一种干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质在制备用于治疗疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及一种干扰或阻断ER‑α36/EGFR信号环路的物质在制备用于治疗疾病的药物中的应用，在一个优选的方案中，所述物质为汉黄芩素，利用汉黄芩素通过干扰或阻断ER‑α36/EGFR信号环路可以有效的抑制三阴性乳腺癌细胞生长，并能够提高三阴性乳腺癌细胞对抗雌激素药物的敏感性，汉黄芩素和抗雌激素药物联用具有协同作用，通过干扰或阻断ER‑α36/EGFR信号环路治疗肿瘤等疾病在临床应用中具有巨大的前景。

Description

一种干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质在制备用于治疗 疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质在制备用于治疗疾病的药物中的应用。
背景技术
雌激素是主要在卵巢、睾丸和可能的肾上腺皮质中形成的类固醇化合物的总称。雌激素和具有雌激素活性的化合物的实例包括二乙基己烯雌酚、己烯雌酚二磷酸酯、己雌酚、聚磷酸雌二醇、溴苯雌酚、氯烯雌醚、己二烯雌酚、二乙基己烯雌酚、丙甲雌酚、雌二醇、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、雌三醇环戊醚、炔雌醚、拟雌内酯、芹黄素、4’,5,7-三羟基黄酮、柑桔苷元、香豆雌酚、金雀异黄酮、黄豆苷元和雌马醇等。雌激素调节生殖组织和乳房、心血管、骨、肝和脑组织中的多种生理过程。雌激素也用在口服避孕药中。雌激素的其它用途包括，缓解绝经的不适，抑制泌乳，和治疗骨质疏松症、先兆流产和各种功能性卵巢病症。抗雌激素药可用于治疗转移性乳腺癌和晚期前列腺癌。
雌激素的作用是由雌激素受体介导完成，在1986年Greene等人克隆出了首个雌激素受体(ER)(Greene等人，Nature,320:134,1986和Greene等人，Science,231:1150,1986)，该受体现在称为ER-α(ER-α66)，其由3个独立的但是能相互作用的功能结构域组成：N-末端A/B结构域、C或DNA-结合结构域和D/E/F或配体-结合结构域。ER-α的N-末端结构域编码独立于配体的激活功能(AF-1)，既参与与辅激活物的相互作用和靶基因的转录活化的区域。DNA-结合结构域或C结构域含有2个锌指结构，其在受体二聚化和与特定的DNA序列的结合中起重要作用。C-末端D/E/F结构域是一种配体-结合结构域，其能介导配体结合、受体二聚化、核转位和配体-依赖性的反式激活功能(AF-2)。AF-1和AF-2对转录控制的相对贡献以细胞特异性的和DNA启动子特异性的方式变化(Berry等，EMBO J.,9：2811(1990))。
2006年王兆一教授成功克隆一种ER-α66的剪接变体，分子量为36kDa的ER-α亚型，命名为ER-α36，发现证实ER-α36的功能不同于ER-α66，ER-α36主要存在于细胞膜上，相比于ER-α66，ER-α36结构中缺乏具有转录活化功能的AF-1和AF-2域，但保留着DNA结合域及其部分二聚化和配体结合域(图7)。ER-α36可介导快速雌激素信号通路如活化MAPK/ERK和PI3K/AKT信号传导(王兆一等人，Identification,cloning,and expression of humanestrogen receptor-α36,a novel variant of human estrogen receptor-α66,Biochemical and biophysical research communications,336(2005)1023-1027.王兆一等人，A variant of estrogen receptor-α,hER-α36:transduction of estrogen-andantiestrogen-dependent membrane-initiated mitogenic signaling,Proceedings ofthe National Academy of Sciences,103(2006)9063-9068.)。
由于缺乏ER-α66表达，众所周知，三阴性乳腺癌(TNBC)细胞无法使用抗雌激素药物如他莫昔芬等治疗。但是，有报道发现高浓度的他莫昔芬能抑制TNBC细胞增长(Obrero,M.等人(2002)Estrogen receptor-dependent and estrogen receptor-independnetpathways for Tamoxifen and 4-hydroxytamoxifen-induced programmed celldeath.J.Biol.Chem.,277,45695-45703.Mandleker,S.等人(2000)Activation ofcaspase-3and cJun NH2-terminal Kinase-1signaling pathways in tamoxifen-induced apoptosis of human cancer cells.Cancer Res.60,5995-6000.)。他莫昔芬的长期治疗的主要问题是它在子宫内膜中的负作用，可增加子宫内膜癌的风险，另外高剂量的他莫昔芬会产生更大的其他毒副作用。另外据报道，不同生长因子信号通路的激活也可能通过绕过雌激素信号传递造成他莫昔芬抗性(Mandleker,S.and Kong,T.A.N.(2001)Mechanisms of tamoxifen-induced apoptosis.Apoptosis,6,469-477)，三阴性乳腺癌即雌激素，孕激素和人表皮生长因子2均显阴性，为乳腺癌亚型之一，约占乳腺癌的15％，比起其他型的乳腺癌，具有更高的复发率，总生存期更短等恶性特点。由于缺乏相应的靶点如ER和HER2,TNBC难于使用基于HER2和激素受体为靶点的疗法，如Herceptin,他莫昔芬和芳香酶抑制剂。考虑到传统化疗的严重的细胞毒性及其不良反应，目前迫切需要一种更有效更低毒性的治疗方法。因此寻求更安全有效的治疗三阴性乳腺癌的治疗剂是亟待需要解决的问题。
汉黄芩素(Wogonin，5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮)，是唇形科(Labiatase)植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)及同属多种植物的根中所含的黄酮类化合物，具有如下结构(图1A)：
是从传统的草本黄芩中提取纯化得到，很早就广泛应用于中草药中。早期研究表明汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗惊厥，抗氧化，消炎，抗菌，抗病毒和抗肿瘤等活性。(姜岑等人，汉黄芩素抗肿瘤作用机制中的主要信号通路研究进展，成都中医药大学学报，2015年第38卷第4期30-33页)。但是，这些活性的作用机理还没被彻底或正确阐明，只有深入透彻的研究药物作用机制，才能够精准有效的选择合适的药物，才能够更好的应用现有技术中已有的药物达到治愈疾病的目的。
发明内容
为了克服现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种汉黄芩素的新用途：汉黄芩素用于干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环路的用途。
进一步，本发明提供了一种干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质在制备用于治疗疾病的药物中的应用。
所述疾病主要包括：肝癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫内膜癌，前列腺癌。
在一个优选的实施方案中，所述疾病为乳腺癌。
在一个优选的实施方案中，所述疾病为三阴性乳腺癌。
在一个优选的实施方案中，所述干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环路的物质来源于黄芩提取物，例如，可以来源于唇形科植物黄芩根，滇黄芩根，半支莲根，夹竹桃科植物鳝藤等提取物。
在一个优选的实施方案中，所述干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质为汉黄芩素。
在一个优选的实施方案中，本发明检测了汉黄芩素和对三阴性乳腺癌细胞生长的影响，发现汉黄芩素可干扰ER-α36和EGFR正调节环路，抑制TNBC细胞生长并有效的下调ER-α36/EGFR蛋白水平。我们也观察到汉黄芩素可减弱在三阴性乳腺癌细胞中雌激素和EGF的细胞刺激活性。
在一个优选的实施方案中，加入汉黄芩素干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环路，能够提高三阴性乳腺癌细胞对抗雌激素药物的敏感性。雌激素受体阳性乳腺癌选用的药物有选择性雌激素受体调节剂(Henke BR等人，Recent advances in estrogen receptormodulators,CurrOpin Drug Devel，2005，8(4)：437-448、纯抗雌激素剂(Elkak AE等人，Pure antiestrogens and breast cancer.Curr Med Res Opin,2001,17(4),282-289)和芳构化酶抑制剂(Younus J等人，A practical overview of aromatase inhibitors inpostmenopausal women with hormone receptor positive breast cancer.BullCancer,2005,92(4),E39-E44)三大类。前两类药物可与ER高度亲和，通过消除或干扰雌激素与ER的相互作用，促进癌细胞凋亡。后一类药物通过对细胞色素P450酶的抑制作用，减少体内雌激素水平，显示类似抗雌激素的疗效。本文所述的抗雌激素药物主要选自前两种抗雌激素药物例如：他莫昔芬、氟维司群等，常用为他莫昔芬。
因此汉黄芩素能增强并恢复三阴性乳腺癌细胞对抗雌激素药物的敏感性。从而降低抗雌激素的使用量。
本发明发现汉黄芩素可下调ER-α36和EGFR蛋白的稳定态表达水平，我们以前发现在三阴性乳腺癌细胞中存在ER-α36/EGFR正调节环路。在这些三阴性乳腺癌细胞中，ER-α36表达的敲除可通过蛋白酶体系增强EGFR蛋白的降解，而EGFR信号通路通过ER-α36基因的5'侧翼区的Ap1结合位点上调ER-α36的启动子活性。本发明的研究结果表明，汉黄芩素可有效地下调了非常低水平表达EGFR的ER阳性MCF7细胞中的ER-α36表达，并且汉黄芩素对ER-α36表达敲除的三阴性乳腺癌细胞生长的无效性表明ER-α36可能是三阴性乳腺癌细胞中汉黄芩素活性的主要靶标。我们也做了AutoDock实验，发现汉黄芩素能够结合ER-α36，并与ER-α36Glu180形成氢键。值得注意的是汉黄芩素也可下调ER阳性乳腺癌细胞的ER-α的表达。
以前研究报道高浓度汉黄芩素可通过减弱抗凋亡蛋白表现出强的促细胞凋亡作用。本发明研究人员未能观察到在所用浓度的汉黄芩素处理的细胞中出现显著的凋亡细胞，但是能有效抑制MAPK/ERK信号。因此本发明研究人员推测有可能汉黄芩素的作用是剂量依赖的。
在一个优选的实施方案中，所述汉黄芩素的有效剂量为1-20μM。
在一个优选的实施方案中，所述汉黄芩素的有效剂量为1-10μM。
在一个优选的实施方案中，所述汉黄芩素的有效剂量为1-5μM。
例如他莫昔芬作为抗雌激素药物已广泛应用于ER阳性乳腺癌的激素疗法。这些抗雌激素已被确定能减轻复发，恶性率和乳腺癌转移风险。不幸的是，由于三阴性乳腺癌缺乏ER-α66表达，这些抗雌激素药物不能抑制三阴性乳腺癌细胞生长。之前已经有报道高浓度(>15μM)的他莫昔芬可以引起ER阴性乳腺癌细胞凋亡(Obrero,M.等人(2002)Estrogenreceptor-dependent and estrogen receptor-independnet pathways for Tamoxifenand 4-hydroxytamoxifen-induced programmed cell death.J.Biol.Chem.,277,45695-45703.Mandleker,S.等人(2000)Activation of caspase-3and cJun NH2-terminalKinase-1signaling pathways in tamoxifen-induced apoptosis of human cancercells.Cancer Res.60,5995-6000.Mandleker,S.等人，(2001)Mechanisms of tamoxifen-induced apoptosis.Apoptosis,6,469-477)。本发明的研究人员发现若降低ER-α36表达水平，0.5μM他莫昔芬则可有效的抑制三阴性乳腺癌细胞生长，此发现表明，ER-α36/EGFR信号环路参与三阴性乳腺癌细胞的他莫昔芬耐药性。汉黄芩素干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环路，可使三阴性乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感，意味着汉黄芩素和他莫昔芬联用具有协同作用。
进一步的，在上述发现的基础上，本发明的研究人员进一步测试了利用汉黄芩素干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环路是否可以提高其他抗雌激素药物对三阴性乳腺癌细胞的敏感性，如氟维司群，试验结果表明干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环路可以提高氟维司群对三阴性乳腺癌细胞的敏感性，意味着汉黄芩素和抗雌激素药物联用具有协同作用。
在本发明中，所列举的抗雌激素药物仅是示例性的，本发明所涵盖的雌激素药物，除了列举的示例性抗雌激素药物，还可以包括这些抗雌激素药物的前体药物，变体、衍生物或代谢产物，例如他莫昔芬的代谢产物：4-羟基他莫昔芬。通过本发明公开的作用机制可以推断，可与ER高度亲和，通过消除或干扰雌激素与ER的相互作用，促进癌细胞凋亡的抗雌激素药物，与汉黄芩素联用均可以提高其对三阴性乳腺癌细胞的敏感性。
在一个优选的实施方案中，所述干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质为汉黄芩素与抗雌激素药物的组合物。
所述抗雌激素药物选自他莫昔芬、氟维司琼。
在一个优选方案中，所述汉黄芩素的有效剂量为0.5-10μM。
特别优选的，所述汉黄芩素的有效剂量为1-5μM。
在一个优选方案中，所述抗雌激素药物的有效剂量为0.1-10μM。
特别优选的，所述抗雌激素药物的有效剂量为0.5-5μM。
MAPK/ERK信号通路是细胞生长的重要信号(K.Knudsen等人Cyclin D1:polymorphism,aberrant splicing and cancer risk,Oncogene,25(2006)1620-1628)。本发明公开了汉黄芩素能够减弱三阴性乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞中雌激素和EGF诱导的MAPK/ERK信号的激活，推测是通过下调三阴性乳腺癌细胞中ER-α36和EGFR的表达。
细胞周期素D1在细胞生长中起到重要的作用，可通过雌激素和EGF信号通路进行调节。雌激素和EGF皆可诱导细胞周期素D1表达，促进G1期细胞周期进程及刺激细胞生长。本发明证实汉黄芩素可减弱雌激素和EGF诱导的细胞周期素D1表达，此研究证明汉黄芩素作用于三阴性乳腺癌细胞的另一分子事件为下调细胞周期素D1表达。
三阴性乳腺癌治疗时，减少副反应同时增强疗效为临床首选。我们研究表明汉黄芩素可干扰或阻断三阴性乳腺癌细胞中ER-α36/EGFR信号环路，从而抑制三阴性乳腺癌细胞中由E2和EGFR刺激的细胞增长。我们的研究也表明汉黄芩素和抗雌激素药物联合应用可有效的抑制三阴性乳腺癌细胞增长，证明应用汉黄芩素临床治疗三阴性乳腺癌具有巨大的潜力。应用汉黄芩素可以提高抗雌激素药物治疗三阴性乳腺癌的疗效，可减少抗雌激素药物的给药量，存在巨大的应用前景。
在本发明的一个方面，提供了汉黄芩素与抗雌激素药物的组合物，所述的抗雌激素药物的具体实例，例如可以为他莫昔芬，氟维司群等，该药物组合物可以制成本领域常用的剂型，如针剂、片剂、胶囊、丸剂、散剂、膏剂、颗粒剂、糖浆、口服液、冻干粉剂等。
在本发明中汉黄芩素与抗雌激素药物的组合药物制剂中，根据不同的剂型和制剂规格，制剂使用的辅料可采用制药领域常规辅料，以不和本发明组合物发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提。例如常规辅料包括填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯已定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，须在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料。
在一个优选的实施方案中，本发明药物组合物中，所述汉黄芩素与抗雌激素药物摩尔比为(2-10)：1。
在一个优选的实施方案中，本发明药物组合物中，所述汉黄芩素与抗雌激素药物摩尔比为(2-5)：1。
优选的，所述抗雌激素药物为他莫昔芬。
本发明种的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的剂型不同可以进行适当的变化、但以保证该药物组合物在体内能够达到有效的血药浓度为前提。
术语：
EGFR：(epidermal growth factor receptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR分为三区：胞外配体结合区，跨膜区和胞内激酶区。
细胞周期素D1：cyclin D1，的主要功能是促进细胞增殖。cyclin D1通过结合并激活G1时期特有的周期蛋白依赖性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的Rb蛋白从其所结合的E2F转录因子上解离，E2F转录因子起始转录活细胞周期的基因，从而推动细胞周期由G1时期进入到S时期。此外，研究发现，除了促进细胞进行分裂外，D型cyclin还具有某些独立于CDK激酶活性的促进基因转录的功能。cyclin D1可以结合组蛋白去乙酰基酶P/CAF，亦可以结合转录因子TF II D等，通过和这些转录因子的结合，cyclin D1起到促进基因转录的功能。目前，cyclin D1已被公认为是一种原癌基因，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。研究表明，在多种肿瘤中发现了Cyclin D1基因过表达和基因扩增，包括乳腺癌、膀胱癌、甲状旁腺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤/肺癌及细胞中心型淋巴瘤等。
他莫昔芬：tamoxifen，中文名：(Z)-2-[4-(1,2-二苯基-1-丁烯)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，结构式如下：
存在Z型和E型异构体，Z型具有抗雌激素样作用，阻止雌激素发挥效应，而E型则具有弱雌激素活性(丁瑜莉等人，他莫昔芬临床应用研究进展，国际药学研究杂志2016年4月第43卷第2期，275-279)。本发明所述的他莫昔芬主要为Z型。用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌。临床治疗乳腺癌，有效率一般在30％作用，雌激素受体阳性患者疗效较好(49％)，阴性患者疗效差(7％)。绝经前和绝经后患者均可使用，而绝经后和60岁以上的人较绝经前和年轻患者的效果为好。从病灶部位来看，皮肤、淋巴结和软组织的肿瘤疗效较好，骨和内脏转移肿瘤的效果较差。三阴性乳腺癌：三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因人表皮生长因子2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0％～20.8％，多项研究表明，三阴性乳腺癌多发生于绝经前年轻女性，尤其是非洲裔美国妇女。三阴性乳腺癌临床表现为一种侵袭性病程，其远处转移风险较高，内脏转移机会较骨转移高，脑转移几率也较高。三阴性乳腺癌的远处转移风险在3年时达到高峰，之后可能会有所下降。三阴性乳腺癌的中位肿瘤大小为2cm，50％有淋巴结转移。
氟维司群：氟维司群是由阿斯利康公司研发的一种肌肉注射药物，2002年4月美国食品与药品管理局批准上市，适用于治疗经过抗雌激素治疗疾病仍趋恶化的绝经后妇女所患的雌激素受体阳性的转移性乳腺癌。许多乳腺癌细胞中都有雌激素受体(ER)，雌激素可刺激此类肿瘤的生长。氟维司群是一种“纯粹”的雌激素受体拮抗剂，没有部分雌激素样激动效应，它通过结合、阻断并下调ER从而抑制雌激素信号通路，能与ER竞争性结合，与ER的亲和力接近雌激素，化学名称为(7a,17b)-7-[9-(4,4,5,5,5-五氟戊亚磺酰基)壬烷基]-雌甾-1,3,5-(10)-三烯-3,17-二醇，结构式如下：
孕激素受体：也称孕酮受体(progesterone receptor，缩写PR，也被称为NR3C3，nuclear receptor subfamily 3,group C,member 3，即核受体第三亚族C组成员3)是一种细胞内蛋白质，由甾体激素孕酮激活。
原癌基因人类表皮生长因子受体2：(human epidermal growth factorreceptor-2，HER2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色体17q12-21.32上，编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。
AP-1：活化蛋白1，英文名称Activator protein 1，是调节基因表达的转录因子，其响应于各种刺激物，包括细胞因子，生长因子，应激和细菌和病毒感染(Hess,J等人"AP-1subunits:quarrel and harmony among siblings."Journal of Cell Science.117(Pt25):5965–73.)。AP-1控制多种细胞过程，包括分化，增殖和凋亡(Ameyar,M等人"A rolefor AP-1in apoptosis:the case for and against.".Biochimie.85(8):747–52.)，AP-1的结构是由属于c-Fos，c-Jun，ATF和JDP家族的蛋白质组成的异源二聚体。
G1期细胞周期：G1期(first gap)从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。
附图说明
图1中，1A表示汉黄芩素化学结构式；1B表示免疫印迹法分析三阴性乳腺癌MDA-MB-231，MDA-MB-436细胞和雌激素受体阳性乳腺癌MCF7细胞中ER-α36，ER-α66和EGFR的表达；1C显示免疫印迹法分析ER-α36被敲除的三阴性乳腺癌细胞中ER-α36和EGFR的表达.为确保相同的上样量，所有的膜都用β-actin抗体重新检测；1D表示与用空载体转染的对照细胞相比，ER-α36敲除后减缓三阴性乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞生长，*P＜0.05。
图2表示汉黄芩素可下调ER-α36和EGFR的蛋白表达，免疫印迹法分析MDA-MB-231细胞(2A，2B)和MDA-MB-436细胞(2C，2D)中ER-α36和EGFR的蛋白表达。图标显示汉黄芩素处理的浓度。每个柱子代表三个独立实验的平均数加减标准差，与用空载体(V)转染的对照细胞对比，*P＜0.05。2E表示免疫印迹法分析用5μM汉黄芩素处理的ER阳性乳腺癌MCF7细胞中ER-α36,ER-α66和EGFR的表达。
图3表示汉黄芩素可抑制MAPK/ERK磷酸化，降低细胞周期素D1表达和减缓三阴性乳腺癌细胞生长。免疫印迹法分析了三阴性乳腺癌细胞中ERK磷酸化(3A，3B)和细胞周期素D1表达(3C，3D)。3E表示汉黄芩素对三阴性乳腺癌细胞生长的延缓，每点代表三个独立实验的平均数加减标准差。
图4表示汉黄芩素可抑制导致三阴性乳腺癌细胞生长的雌激素信号；(4A,4B)表示免疫印迹法分析三阴性乳腺癌细胞中MAPK/ERK磷酸化，其中三阴性乳腺癌细胞用17β-雌二醇(E2)单独处理或与标示浓度的汉黄芩素共同处理。(4C，4D)表示免疫印迹法分析三阴性乳腺癌细胞中细胞周期素D1表达，其中三阴性乳腺癌细胞用(E2)单独处理或与标示浓度的汉黄芩素共同处理。(4E，4F)表示用(E2)单独处理或与标示浓度的汉黄芩素共同处理过的三阴性乳腺癌细胞生长情况，每点代表三个独立实验的均数加减标准差，与用溶剂(V)处理的对照组相比，*P＜0.05。
图5表示汉黄芩素可减弱三阴性乳腺癌细胞中EGF信号对细胞生长刺激效应；(5A，5B)表示免疫印迹法分析三阴性乳腺癌细胞中MAPK/ERK磷酸化，其中三阴性乳腺癌细胞用10ng/ml EGF单独处理或与标示浓度的汉黄芩素共同处理过。(5C，5D)表示免疫印迹法分析三阴性乳腺癌细胞中cyclin D1蛋白表达，其中三阴性乳腺癌细胞用10ng/ml EGF单独处理或与标示浓度的汉黄芩素共同处理，(5E，5F)表示用EGF单独处理或与标示浓度的汉黄芩素共同处理过的三阴性乳腺癌细胞生长情况，每点代表三个独立实验的平均数加减标准差，与用溶剂(V)处理的对照组相比，*P＜0.05。
图6表示汉黄芩素可增强三阴性乳腺癌细胞对它莫西芬敏感性，6A表示ER-α36被敲除的三阴性乳腺癌细胞在0.5M他莫昔芬中生长情况，*P＜0.05(6B&6C)。用他莫昔芬单独处理或与标示浓度的汉黄芩素共同处理过的三阴性乳腺癌细胞生长情况，每点代表三个独立实验的平均数加减标准差，与用溶剂(V)处理的对照组相比，*P＜0.05。
图7显示了ER-α66和ER-α36的蛋白结构，结构域(用A-F标记)，氨基酸序列编号、AF-1和AF-2、DNA结合结构域、配体-结合结构域和二聚体结构域，也指示了磷酸化位点和每个结构域的功能。
为了使本领域技术人员更容易理解本发明的技术方案，下面结合具体的实施方式对本发明的内容做详细说明，但是具体的实施方式并不是对本发明内容的限制。
具体实施方式
材料与方法
1细胞株
MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞均为本实验室保存。
2药物,抗体及试剂
汉黄芩素(98％纯度)购买于阿拉丁(Aladdin)(W101155)。胎牛血清(FBS，批号1581731)、碳吸附胎牛血清(CS-FBS，批号1598176)、DMEM培养基(批号8416246)、无酚红DMEM培养基(批号1802669)、胰蛋白酶(含0.25％EDTA，批号1816869)，缓冲液PBS(批号8116481)购自于美国Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)雌激素(E2)，表皮生长因子(EGF)，他莫昔芬，氟维司群购自于美国Sigma公司，BCA试剂盒(批号P0009)，购自于北京碧云天生物工程有限公司，一抗：EGFR批号2232S，P-ERK批号#9106S，ERK批号4695S，购自于美国CST公司，ER-α66批号Sc-8002、Cyclin D1批号Sc-8396购自于美国Santa Cruz Technology公司，ER-α36来自于Pacific Immunology Corp。二抗(羊抗兔，批号A0208；羊抗鼠，批号A0216)购自于北京碧云天生物工程有限公司。
1.3仪器
CO2细胞培养箱、超净工作台，美国Thermo Fisher公司；Mini-Protean电泳和电转移系统、酶标仪，美国Bio-Rad公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；BP-211D十万分之一分析天平，德国Sartorius公司；4℃超速离心机，美国Sigma公司；细胞计数仪，美国LifeTechnologies Corporation公司。
1.4细胞培养及处理
细胞复苏后用含10％FBS的DMEM培养基培养，每隔2-3天传代一次；实验前用含2.5％CS-FBS的无酚红DMEN培养基饥饿处理24h。
1.5免疫印迹法
取对数生长期的细胞，以105个每孔传于6孔板中，饥饿处理24h，24h后加入相对应的药物处理16h(检测P-PERK时处理30min)，提取细胞总蛋白，测定浓度后以每孔40μg的量进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转移到PVDF膜上，5％BSA封闭2h，TBST缓冲液洗膜3次每次10min，一抗(ER-α36 1:10000，EGFR 1：2000，ER-α66 1：2000，P-ERK 1：2000，CyclinD1 1:2000)4°孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次每次10min，二抗(1:2000)孵育1h，TBST缓冲液洗膜3次，以β-actin和ERK为对照，加入发光液进行曝光。
1.6细胞生长实验
将细胞以每皿104个细胞传于60mm培养皿中，用无酚红DMEM培养至24h后加入相应浓度的黄芩素，并以相同浓度的DMSO作为对照组。7天后用 II Automated CellCounter进行细胞计数。
1.7CCK-8检测细胞活性
将细胞以104每孔传于96孔板中培养12小时，12小时后加入设计好浓度的黄芩素，每个浓度设置3个重复，同时设置对照组和调零组。将细胞继续培养至相应的天数后，每孔中加入10μL CCK-8，继续培养1h，酶标仪检测450nm处吸光值计算细胞存活数。
1.8数据分析和统计
上述说有实验均独立重复3次，采用SPSS 19软件进行统计学分析，所有实验数据通过均数±标准差(±s)方式表示，各组间采用单因素方差分析，p<0.05(*)为差异具有统计学意义。
实验步骤及结果分析
实施例1：干扰ER-α36/EGFR信号环路可以抑制三阴性乳腺癌细胞生长
为研究汉黄芩素(图1A)对三阴性乳腺癌细胞生长的作用，我们使用三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-436和MDA-MB-231进行实验，首先我们检测了这两种细胞中ER-α36、ER-α66和EGFR蛋白的表达水平。以1x105个每孔将细胞传与6孔板中，12h后提取细胞总蛋白，用免疫印迹法检测ER-α36、ER-α66和EGFR的蛋白水平。结果显示两种细胞均高表达ER-α36和EGFR，但未检测到全长的ER-α表达(图1B)。同时我们通过转染针对ER-α36的3’UTR靶点的shRNA构建ER-α36低表达的细胞亚株，并通过与转染空载体的细胞作对照，发现转染shRNA的细胞中ER-α36蛋白表达降低了80％以上(见图1C)。同时，敲降ER-α36后的细胞，其EGFR表达水平也显著降低。通过检测培养7天后的细胞数量发现，与对照细胞相比，敲降ER-α36的细胞均表现出生长减缓的现象(见图1D)。这些结果表明，TNBC细胞中存在ER-α36/EGFR正调节环路，并且其对三阴性乳腺癌细胞生长至关重要。
实施例2：汉黄芩素下调三阴性乳腺癌细胞中ER-α36和EGFR表达水平
将MDA-MB-436和MDA-MB-231细胞以每孔105个传于6孔板中，以2.5％CS-FBS的无酚红DMEM培养基饥饿处理24小时，24小时后加入汉黄芩素使其终浓度分别为(0.1μM,1μM,5μM和10μM)，并以添加相同浓度的DMSO作为对照组。药物处理16小时后收集细胞，提取总蛋白，进行免疫印迹法检测。结果显示汉黄芩素可以呈剂量依赖的方式降低三阴性乳腺癌细胞中ER-α36的表达。先前的研究发现ER-α36和EGFR之间存在一个正向的调节环路，因此我们也检测了汉黄芩素处理后细胞中EGFR的表达情况，结果显示汉黄芩素同样可以稳定的下调三阴性乳腺癌细胞中EGFR的表达水平(见图2A-2B)。因为ER阳性乳腺癌细胞MCF7只表达很微量的EGFR，我们检测了汉黄芩素处理后MCF7细胞中ER-α36的表达水平，发现汉黄芩素仍然可以有效地降低ER-α36的表达(见图2C)。这些结果说明汉黄芩素可能通过降低ER-α36来作用于ER-α36/EGFR调节环路。
实施例3：汉黄芩素可以抑制MAPK/ERK的磷酸化、降低cyclinD1的表达并抑制三阴性乳腺癌细胞的生长
因为ER-α36/EGFR正向调节环路对三阴性乳腺癌细胞的生长至关重要，因此我们检测了汉黄芩素处理后对细胞MAPK/ERK磷酸化和cyclinD1表达的影响，并观察其对三阴性乳腺癌细胞生长的作用。将MDA-MB-436和MDA-MB-231细胞以每孔105个传于6孔板中，以2.5％CS-FBS的无酚红DMEM培养基饥饿处理24小时，24小时后加入汉黄芩素使其终浓度为(0.1μM,1μM,5μM和10μM)，并添加相同浓度的DMSO作为对照组。药物处理16小时(检测磷酸化水平处理30min)后收集细胞，提取总蛋白，进行进行免疫印迹法检测。结果显示黄芩素处理后细胞中磷酸化-ERK和cyclinD1表达水平均有所降低(图3A-B)。通过对汉黄芩素处理后细胞数量的统计发现，汉黄芩素处理7天后可以显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增长(图3C)。上述结果表明汉黄芩素可以抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。
实施例4：汉黄芩素可以抑制雌激素信号通路刺激的三阴性乳腺癌细胞生长
由于ER-α36可以调节快速雌激素信号通路刺激三阴性乳腺癌细胞生长，因此我们检测了汉黄芩素是否能够抑制雌激素(E2)对三阴性乳腺癌细胞生长的刺激作用。将细胞铺板并饥饿24小时后，设置单独雌激素(1nM)处理组和雌激素与汉黄芩素(1μM，5μM)同时处理组，或添加相同体积的DMSO作为对照组。药物处理30min后进行免疫印迹法检测磷酸化-ERK和cyclinD1的表达水平，并对处理7天后的活细胞数量进行计数。结果显示，1nM的雌激素可以诱导MAPK/ERK的磷酸化、刺激cyclinD1的表达，但添加汉黄芩素则可以有效地对其进行抑制(图4A-B)。此外，汉黄芩素也可以降低雌激素对三阴性乳腺癌细胞生长的刺激作用(图4C)。说明汉黄芩素可以通过下调ER-α36的表达来抑制雌激素信号通路对三阴性乳腺癌细胞生长的刺激作用。
实施例5：汉黄芩素减弱EGF信号通路对三阴性乳腺癌细胞生长的刺激作用因为汉黄芩素可以降低三阴性乳腺癌细胞中EGFR的表达，因此我们检测了汉黄芩素对EGFR调节的促有丝分裂信号通路的作用。分别设置EGF(10ng)单独处理组、EGF(10ng)与汉黄芩素(1μM)和EGF(10ng)与汉黄芩素(5μM)同时处理组，并以添加DMSO组作为对照组，处理30min后免疫印迹法检测磷酸化ERK和cyclinD1的表达水平，并对处理7天后的活细胞数量进行计数。结果显示，添加EGF可以诱导三阴性乳腺癌细胞中MAPK/ERK的磷酸化并提高cyclinD1的表达，而汉黄芩素可以呈浓度依赖式抑制EGF的作用(图5A-B)。我们也发现汉黄芩素可以抑制由EGF刺激的三阴性乳腺癌细胞的增长(图5C)。当汉黄芩素浓度达到5μM时，也可以将无EGF处理的细胞数量抑制到正常水平之下(图5C)，说明汉黄芩素可能还会影响除EGF之外的其它促有丝分裂信号通路。
实施例6：汉黄芩素增加三阴性乳腺癌细胞对抗雌激素的敏感性
由于缺乏ER-α表达，三阴性乳腺癌细胞表现出对抗雌激素不敏感，无法用抗雌激素药物进行治疗。前期研究发现，ER-α36参与乳腺癌细胞对抗雌激素他莫昔芬的抗性，而阻断ER-α36/EGFR/HER2信号环路可以让抗他莫昔芬的乳腺癌细胞重新对他莫昔芬敏感。因此，我们猜想阻断ER-α36/EGFR信号环路是否可以让三阴性乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感。首先，我们检测了他莫昔芬对表达不同水平ER-α36的三阴性乳腺癌细胞生长的影响。将104个细胞传于60mm培养皿中，24小时后添加0.5μM他莫昔芬继续培养，7天后对细胞进行数量检测。结果发现，与对照组相比0.5μM的他莫昔芬可以显著抑制敲降ER-α36的三阴性乳腺癌细胞的生长(图6A)，说明ER-α36/EGFR信号环路在三阴性乳腺癌细胞抗他莫昔芬中发挥着重要的作用。接着我们又检测了汉黄芩素和他莫昔芬协同处理对三阴性乳腺癌细胞生长的影响。将104个细胞铺于60mm培养皿中，24小时后在其中两组中分别单独添加汉黄芩素或他莫昔芬，使其终浓度分别为1μM和0.5μM，在另一组细胞中同时添加相同浓度的汉黄芩素和他莫昔芬，并以DMSO组为对照，处理7天后检测活细胞数量。结果显示，与对照组和单独添加他莫昔芬组相比，同时添加汉黄芩素和他莫昔芬可以提高三阴性乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性，抑制细胞生长。
实施例7：不同浓度组合的汉黄芩素和他莫昔芬对三阴性乳腺癌细胞生长的影响
我们将细胞以104每孔传于96孔板中培养12小时，12小时后加入不同组合的的汉黄芩素和他莫昔芬，每个浓度设置3个重复，同时设置对照组和调零组。将细胞继续培养三天后，每孔中加入10μL CCK-8，继续培养1小时，酶标仪检测450nm处吸光值计算细胞存活数。组1:汉黄芩素(0.5μM)+他莫昔芬(0.1μM)；组2:汉黄芩素(0.5μM)+他莫昔芬(0.2μM)；组3:汉黄芩素(0.5μM)+他莫昔芬(0.5μM)；组4:汉黄芩素(0.5μM)+他莫昔芬(1μM)；组5:汉黄芩素(1μM)+他莫昔芬(0.1μM)；组6:汉黄芩素(1μM)+他莫昔芬(0.2μM)；组7:汉黄芩素(1μM)+他莫昔芬(0.5μM).我们发现汉黄芩素在不同浓度皆可与不同浓度的他莫昔芬产生协同作用，有效抑制三阴性乳腺癌细胞生长。而汉黄芩素(1μM)+他莫昔芬(0.5μM)浓度对细胞抑制能力在我们所设浓度组中最强。试验结果见表1和表2。
汉黄芩素与他莫昔芬的组合协同增效促进MDA-MB-231细胞死亡实验
存活率＝药物组OD值/对照组OD值
表1
汉黄芩素与他莫昔芬的组合协同增效促进MDA-MB-436细胞死亡实验
存活率＝药物组OD值/对照组OD值
表2
实施例8：不同浓度组合的汉黄芩素和氟维司群对三阴性乳腺癌细胞生长的影响
我们将细胞以104每孔传于96孔板中培养12小时，12小时后加入不同组合的汉黄芩素和氟维司群，每个浓度设置3个重复，同时设置对照组和调零组。将细胞继续培养三天后，每孔中加入10μL CCK-8，继续培养1小时，酶标仪检测450nm处吸光值计算细胞存活数。组1:汉黄芩素(0.5μM)+氟维司群(0.1μM)；组2:汉黄芩素(0.5μM)+氟维司群(0.2μM)；组3:汉黄芩素(0.5μM)+氟维司群(0.5μM)；组4:汉黄芩素(0.5μM)+氟维司群(1μM)；组5:汉黄芩素(1μM)+氟维司群(0.1μM)；组6:汉黄芩素(1μM)+氟维司群(0.2μM)；组7:汉黄芩素(1μM)+氟维司群(0.5μM).我们发现汉黄芩素在不同浓度皆可与不同浓度的氟维司群产生协同作用，有效抑制三阴性乳腺癌细胞生长。而汉黄芩素(1μM)+氟维司群(0.5μM)浓度对细胞抑制能力在我们所设浓度组中最强。试验结果见表3和表4。
汉黄芩素与氟维司群的组合协同增效促进MDA-MB-231细胞死亡实验
存活率＝药物组OD值/对照组OD值
表3
汉黄芩素与氟维司群的组合协同增效促进MDA-MB-436细胞死亡实验
存活率＝药物组OD值/对照组OD值
表4

Claims (10)

1.一种干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质在制备用于治疗疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述疾病选自：肝癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫内膜癌，前列腺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，所述疾病为乳腺癌。
4.根据权利要求3所述的应用，所述疾病为三阴性乳腺癌。
5.根据权利要求1所述的应用，干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质选自黄芩提取物，唇形科植物黄芩根，滇黄芩根，半支莲根，夹竹桃科植物鳝藤提取物。
6.根据权利要求5所述的应用，所述干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质为汉黄芩素。
7.根据权利要求1所述的应用，所述干扰或阻断ER-α36/EGFR信号环的物质为汉黄芩素与抗雌激素药物的组合物。
8.根据权利要求7所述的应用，所述抗雌激素药物选自他莫昔芬、氟维司琼。
9.根据权利要求7所述的应用，所述汉黄芩素的有效剂量为0.5-10μM。
10.一种用于治疗三阴性乳腺癌的药物组合物，含有汉黄芩素和抗雌激素药物。
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