CN109364240B - 一种孕马血清促性腺激素冻干粉及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于畜牧业兽医技术研究领域，涉及一种孕马血清促性腺激素冻干粉及其制备方法。每1g PMSG冻干粉中，包括以下质量的成分：孕马血清促性腺激素：500～2000IU，卵磷脂：30～100mg，赋形剂：30～80mg，环氧丙基磷酸二钠盐10～50mg，pH调节剂适量。

Description

一种孕马血清促性腺激素冻干粉及其制备方法
技术领域
本发明属于畜牧业兽医技术研究领域，涉及一种孕马血清促性腺激素冻干粉及其制备方法。
背景技术
孕马血清促性腺激素(PregnantMareSerumGonadotropin PMSG)是从妊娠母马血清中分离纯化的促性腺激素，由妊娠早期母马子宫内膜杯状结构的滋养层所分泌。PMSG是糖蛋白激素中唯一独特的促性腺激素，同一分子中具有黄体生成素和促卵泡生成素两种促性腺激素的活性，在畜牧生产上有广泛应用：促进卵巢卵泡生长；促进卵泡颗粒细胞的增生和雌激素合成和分泌，刺激卵泡上LH受体产生；在雌性动物，促进卵泡的成熟和排卵；刺激卵泡内内膜细胞产生雌激素，促进排卵后的颗粒细胞黄体化，维持黄体细胞分泌孕酮等等。
目前市场上的PMSG多为冻干粉状，采用冷冻干燥的方法将PMSG液态加工成固态，最大限度地保持PMSG的生物活性和稳定性，并延长保存时间，同时降低运输费用。然而在PMSG的整个冷冻干燥的各个阶段，存在多种因素会引起PMSG结构变化，例如：低温的影响，随着温度降低，非极性基团水合作用逐渐增强，PMSG内部的疏水基团相互作用减弱，从而降低PMSG稳定性；再如，降温速率的影响，通常冷冻干燥降温速度越快，PMSG内部产生的冰晶就越小，而冰晶大小决定PMSG在干燥过程中的结构活性。PMSG在冻干过程中的结构变化，会导致PMSG的活性下降，从而影响PMSG在动物体内的作用效果。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术中冷冻干燥过程对PMSG结构影响，从而降低PMSG作用效果的缺陷，提供一种PMSG冻干粉及其制备方法，通过PMSG冻干粉成分和制备方法的合理搭配，提高PMSG冻干粉在母畜上的作用效果。
本发明的一个目的通过以下技术方案实现：一种孕马血清促性腺激素冻干粉，每1g冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：500～2000IU，卵磷脂：30～100mg，赋形剂：30～80mg，环氧丙基磷酸二钠盐10～50mg，pH调节剂适量。
作为优选，所述赋形剂为甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖中的一种或多种。
作为优选，所述右旋糖酐为右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70中的一种或多种。
作为优选，所述pH调节剂为盐酸、柠檬酸、山梨酸、苹果酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种。
作为优选，每1g冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：1000IU，卵磷脂：50mg，甘露醇：35mg，右旋糖酐40：20mg，环氧丙基磷酸二钠盐30mg，pH调节剂适量。
本发明的另一个目的通过以下技术方案实现：一种孕马血清促性腺激素冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)配料：按照成分配比称取孕马血清促性腺激素、卵磷脂、甘露醇、环氧丙基磷酸二钠盐和右旋糖酐，分别用水溶解，然后合并溶解液，pH调节剂调pH至7.0～7.5，200-1000rmp下搅拌20-60min，过滤；
(2)灌装：过滤药液置于转移灌中，经灌装机灌装入容器中；
(3)冷冻干燥：将灌装有药液的容器置于冷冻干燥箱中，冷冻干燥箱埋植感温仪，药液经冷冻干燥过程成粉末状。
作为优选，所述冷冻干燥过程包括以下步骤：在0.5～1.5h内降温至-40～-55℃，保持30～60min；然后抽真空至2～30Pa，在8～10h内升温至20～35℃；在真空状态下4～5h内升温至35～40℃，然后继续保温2～4h。
与现有技术相比，本发明通过添加卵磷脂和环氧丙基磷酸二钠盐，以及使用特殊的冷冻干燥过程，成分和冻干过程的配合，最大程度降低PMSG在冻干中的结构变化。而且环氧丙基磷酸二钠盐和卵磷脂成分具有的药理活性，可协同增强PMSG作用效果。最终本发明获得的PMSG冻干粉应用于母畜中，可显著诱导母畜排卵、发情等。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
本发明的一个实施例中，每1g孕马血清促性腺激素冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：500～2000IU，卵磷脂：30～100mg，赋形剂：30～80mg，环氧丙基磷酸二钠盐10～50mg，pH调节剂适量。
孕马血清促性腺激素一般以冻干粉形式在市场上售卖，而在冻干过程中PMSG的结构会受到一定程度的影响。赋形剂除提供PMSG冻干粉基本骨架，保持冻干粉外观外，还作为PMSG的保护剂，一定程度上维持PMSG结构的稳定性。环氧丙基磷酸二钠盐分子量很小，易于进入PMSG分子空隙中，而其环氧结构在冻干过程中能够支撑住PMSG，防止PMSG结构紧缩，有效限制PMSG分子内部的结构变化。而卵磷脂由含磷亲水基团和长烃基疏水基团形成，在搅拌混匀和冻干过程中，可以在PMSG表面形成薄膜，防止PMSG在冻干过程中结构伸展。环氧丙基磷酸二钠盐和卵磷脂相互配合，最大程度降低PMSG在冻干中的结构变化。而且环氧丙基磷酸二钠盐和卵磷脂也具有一定的药理活性，可协同增强PMSG在动物体内的作用效果。
赋形剂为甘露醇、右旋糖酐、山梨醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖中的一种或多种。甘露醇和右旋糖酐的复配使用为较优赋形剂，赋形剂甘露醇作为载体可形成疏松结实的均匀骨架，改善PMSG冻干制剂的外观，此外，甘露醇可以作为PMSG冻干过程中的保护剂，降低冻干后PMSG的聚集；右旋糖酐可提高制品的玻璃化温度，防止在冻干过程中因制品塌陷而诱导PMSG结构的破坏。其中右旋糖酐可为右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70中的一种或多种。
pH调节剂为盐酸、柠檬酸、山梨酸、苹果酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种。pH调节剂的用量为将PMSG的pH调至目标值即可。
本发明的较优实施例中，每1g冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：1000IU，卵磷脂：50mg，甘露醇：35mg，右旋糖酐：20mg，环氧丙基磷酸二钠盐30mg，pH调节剂适量。
为方便起见，一般每次采用1g冻干粉兑生理盐水形成注射剂应用于动物体，而1g冻干粉中1000国际单位的PMSG用量作用效果较优，其他成分的使用则最大程度保护PMSG在冻干过程中的结构，此外，卵磷脂和环氧丙基磷酸二钠盐的用量还从协同增效上进行了考量。
本发明的一个实施例中，孕马血清促性腺激素冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)配料：按照成分配比称取孕马血清促性腺激素、卵磷脂、甘露醇、环氧丙基磷酸二钠盐和右旋糖酐，分别用水溶解，然后合并溶解液，pH调节剂调pH至7.0～7.5，200-1000rmp下搅拌20-60min，过滤。
孕马血清促性腺激素用5-10％总体积的注射用水溶解，卵磷脂加10-15％总体积的注射用水在200-1000rmp下搅拌20-30min分散均匀，甘露醇、环氧丙基磷酸二钠盐和右旋糖酐分别用10-15％总体积的注射用水直接溶解，然后将各溶解液合并至配料罐中，加注射用水至总体积的90-95％，pH调节剂调pH至7.0～7.5，因PMSG本身为酸性蛋白，通过加碱性pH调节剂来达到目标pH，如果在滴加过程中出现pH偏高，则使用酸性pH调节剂进行回调，将PMSG药液在pH 7.0～7.5下结构状态最稳定。pH调节后，加注射用水至总体积，200-1000rmp下搅拌20-60min，先用0.45μm过滤器粗滤，然后再用0.22μm过滤器精滤，精滤滤液检查可见物合格，同时目测色泽合格后通过0.22μm的终端过滤器过滤至转移灌内待灌装。其中，配料罐和过滤器最好事先经过灭菌处理，灭菌条件：121℃，30min；过滤器最好通过完整性测试；从配料到开始灌装时间最好不得超过3小时。
(2)灌装：过滤药液置于转移灌中，经灌装机灌装入容器中。
在百级层流的保护下，安装好灌装机的各零部件，已经干燥灭菌的西林瓶经联动线到灌封机，在振荡器内加满合格的胶塞，开启灌装机调试装置在0.98-1.02ml之间，调试合格后开始正式灌装。从待灌装到开始冷冻干燥时间不得超过5小时。
(3)冷冻干燥：将灌装有药液的容器置于冷冻干燥箱中，冷冻干燥箱埋植感温仪，药液经冷冻干燥过程成粉末状。
冷冻干燥箱经清洁消毒后，将灌装有药液的西林瓶均匀放入箱内，冻干燥箱埋植感温仪，设定冻干程序进行自动冷冻干燥过程，冷冻干燥过程主要分三个阶段：第一阶段预冻，先将产品用0.5～1.5h降温至-40～-55℃，保持30～60min；第二阶段是升华，抽真空至2～30Pa，在8～10h内缓慢升温至20～30℃，95％以上的水分在这个阶段去除；第三阶段是再干燥，在真空状态下4～5h内缓慢升温至35～40℃，然后保温2～4小时，确保去除掉所有水分。
冷冻干燥箱中的降温速率以及升温速率对PMSG的结构影响很大。降温速率越大，成核速度越快，容易形成颗粒较多、尺寸较小的细冰晶，因而冰晶升华后，PMSG内形成的孔隙尺寸较小，干燥速率会有所降低，但是PMSG的复水性良好；然而降温速率过快，形成的小颗粒冰晶导致冰水界面变大，PMSG吸附至冰水界面导致结构伸展。为保持平衡，应选择适当的降温速率。而升华和再干燥阶段的升温速率太快，PMSG内冰晶快速升华，形成的孔隙越大，对PMSG结构产生不利影响，而升温速率太慢，PMSG中的固态冰晶缓慢升华，冰晶升华速度过慢同样影响PMSG结构。
实施例1
本实施例中，每1g PMSG冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：1000IU，卵磷脂：70mg，甘露醇：50mg，环氧丙基磷酸二钠盐40mg，pH调节剂适量。
PMSG冻干粉通过以下制备方法获得：
以1000g冻干粉计，按照以上成分配比称取各成分，孕马血清促性腺激素用10％总体积的注射用水溶解，卵磷脂加15％总体积的注射用水在800rmp下搅拌25min分散均匀，甘露醇、环氧丙基磷酸二钠盐分别用15％总体积的注射用水直接溶解，然后将各溶解液合并至配料罐中，加注射用水至总体积的95％，氢氧化钠调pH至7.0，如果在滴加过程中出现pH偏高，则使用盐酸进行回调，pH调节后，加注射用水至总体积，800rmp下搅拌40min，先用0.45μm过滤器粗滤，然后再用0.22μm过滤器精滤，精滤滤液检查可见物合格，同时目测色泽合格后通过0.22μm的终端过滤器过滤至转移灌内待灌装。将过滤药液灌装至西林瓶中，调整西林瓶中药液体积为0.98-1.02ml。将灌装好的西林瓶置于冷冻干燥箱中，冷冻干燥箱埋植感温仪，设定冻干程序，先将产品用1h降温至-45℃，保持50min，然后抽真空至22Pa，在10h内缓慢升温至25℃，然后在真空状态下5h内升温至40℃，保温3h。
实施例2
本实施例中，每1g PMSG冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：1000IU，卵磷脂：70mg，甘露醇：40mg，右旋糖酐40：10mg，环氧丙基磷酸二钠盐40mg，pH调节剂适量。
PMSG冻干粉通过以下制备方法获得：
以1000g冻干粉计，按照以上成分配比称取各成分，孕马血清促性腺激素用10％总体积的注射用水溶解，卵磷脂加15％总体积的注射用水在800rmp下搅拌25min分散均匀，甘露醇、环氧丙基磷酸二钠盐分别用15％总体积的注射用水直接溶解，然后将各溶解液合并至配料罐中，加注射用水至总体积的95％，氢氧化钠调pH至7.0，如果在滴加过程中出现pH偏高，则使用盐酸进行回调，pH调节后，加注射用水至总体积，800rmp下搅拌40min，先用0.45μm过滤器粗滤，然后再用0.22μm过滤器精滤，精滤滤液检查可见物合格，同时目测色泽合格后通过0.22μm的终端过滤器过滤至转移灌内待灌装。将过滤药液灌装至西林瓶中，调整西林瓶中药液体积为0.98-1.02ml。将灌装好的西林瓶置于冷冻干燥箱中，冷冻干燥箱埋植感温仪，设定冻干程序，先将产品用1h降温至-45℃，保持50min，然后抽真空至22Pa，在10h内缓慢升温至25℃，然后在真空状态下5h内升温至40℃，保温3h。
实施例3
本实施例中，每1g PMSG冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：1000IU，卵磷脂：50mg，甘露醇：35mg，右旋糖酐40：20mg，环氧丙基磷酸二钠盐30mg，pH调节剂适量。
PMSG冻干粉通过以下制备方法获得：
以1000g冻干粉计，按照以上成分配比称取各成分，孕马血清促性腺激素用10％总体积的注射用水溶解，卵磷脂加15％总体积的注射用水在800rmp下搅拌25min分散均匀，甘露醇、环氧丙基磷酸二钠盐分别用15％总体积的注射用水直接溶解，然后将各溶解液合并至配料罐中，加注射用水至总体积的95％，氢氧化钠调pH至7.0，如果在滴加过程中出现pH偏高，则使用盐酸进行回调，pH调节后，加注射用水至总体积，800rmp下搅拌40min，先用0.45μm过滤器粗滤，然后再用0.22μm过滤器精滤，精滤滤液检查可见物合格，同时目测色泽合格后通过0.22μm的终端过滤器过滤至转移灌内待灌装。将过滤药液灌装至西林瓶中，调整西林瓶中药液体积为0.98-1.02ml。将灌装好的西林瓶置于冷冻干燥箱中，冷冻干燥箱埋植感温仪，设定冻干程序，先将产品用1h降温至-45℃，保持50min，然后抽真空至22Pa，在10h内缓慢升温至25℃，然后在真空状态下5h内升温至40℃，保温3h。
对比例1
对比例1与实施例3的区别在于，对比例1的PMSG冻干粉中不包括卵磷脂成分，其它与实施例3相同。
对比例2
对比例2与实施例3的区别在于，对比例2的PMSG冻干粉中不包括环氧丙基磷酸二钠盐成分，其它与实施例3相同。
对比例3
对比例3与实施例3的区别在于，对比例3的PMSG冻干粉中不包括环氧丙基磷酸二钠盐和卵磷脂成分，其它与实施例3相同。
对比例4
对比例4与实施例3的区别在于，对比例4的PMSG冻干粉冷冻干燥过程为：先将产品用3h降温至-45℃，保持50min，然后抽真空至22Pa，在10h内缓慢升温至25℃，然后在真空状态下5h内升温至40℃，保温3h。
对比例5
对比例4与实施例3的区别在于，对比例4的PMSG冻干粉冷冻干燥过程为：先将产品用1h降温至-45℃，保持50min，然后抽真空至22Pa，在6h内升温至25℃，然后在真空状态下5h内升温至40℃，保温3h。
将实施例1-3和对比例1-5的PMSG冻干粉应用于母畜中。
1、PMSG冻干粉在母猪上的应用
集约化的养殖、、夏季高温、二胎母猪综合症、后备母猪发情利用率低等因素影响母猪发情，使用PMSG冻干粉来诱导母猪发情处理。
1.1实验对象：初产母猪450头，经产母猪450头，后备母猪450头。
1.2实验方法：初产母猪、经产母猪和后备母猪各分成9组，每组50头，取1g实施例1-3以及对比例1-5的PMSG冻干粉，加生理盐水调配成1ml注射液，初产母猪和经产母猪的第1-8组分别在断奶后24小时注射1ml由实施例1-3以及对比例1-5的PMSG冻干粉调配的注射液，第9组不做任何处理，然后自然发情配种；在180日龄没有情期记录的后备母猪，第1-8组分别注射由实施例1-3以及对比例1-5的PMSG冻干粉调配的注射液，第9组不做任何处理，230日龄后，静立发情者配种。统计实验头数、妊娠率、窝均总仔数、窝均活仔数和产仔指数。实验结果如表1所示。
表1
Figure BDA0001805512590000081
Figure BDA0001805512590000091
从表1中可以看出，经PMSG处理组妊娠率比自然发情组高，且差异很显著；窝均总仔数和窝均活仔数相比，PMSG处理组也比自然发情组多，因PMSG可以促进多个卵泡发育，使产仔数提高。而注射对比例1-5PMSG的母猪，其妊娠率显著低于注射实施例3PMSG的第3组，窝均总仔数和窝均活仔数也要低于第3组。实施例3PMSG为采用最优选参数制备而得，其诱导母猪发情效果最佳。
2、PMSG冻干粉对母兔排卵作用效果
2.1实验对象：90只大小、年龄相仿的健康母兔。
2.2实验方法：将母兔分成9组，每组10只，取1g实施例1-3和对比例1-5PMSG冻干粉，加生理盐水调配成1ml注射液，母兔第1-8组分别在颈部皮下注射由实施例1-3和对比例1-5PMSG冻干粉调配的60微升注射液，72h后耳静脉HCG 100单位，然后与公兔合笼配种，母兔第9组不注射PMSG，自然发情，与公兔合笼前耳静脉注射HCG 100单位。在注射HCG 14h后手术冲卵，同时记录左右卵巢的排卵点、回收卵子数、充血卵泡数。实验结果如表2所示。
表2
Figure BDA0001805512590000101
表3结果显示，注射PMSG的第1-8组比自然发情的第9组排卵数、充血卵泡数、卵子回收数显著增加，第4-8组注射的是对比例1-5的PMSG，其排卵效果要低于注射实施例3PMSG的第3组，实施例3具有最优的超排效果。
3、PMSG冻干粉对母貉卵巢的影响
3.1实验对象：90只大小、年龄相仿的健康的母貉。
3.2实验方法：将母貉分成9组，每组10只，取1g实施例1-3和对比例1-5PMSG冻干粉，加生理盐水调配成1ml注射液，试验第1天，第1-8组分别肌肉注射0.5ml由实施例1-3和对比例1-5PMSG冻干粉调配的注射液，第6天注射再分别注射150单位HCG，第9组第一天注射生理盐水，第6天注射150单位HCG。第7天去除各组母貉的卵巢，置于10％中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片，H.E。染色，显微镜下观察。实验结果如表3所示。
表3
Figure BDA0001805512590000111
表3结果显示，注射PMSG的第1-8组卵巢重量和卵巢大小显著大于未注射PMSG的第9组，第4-8组注射的是对比例1-5的PMSG，其母貉卵巢重量和大小要小于注射实施例3PMSG的第3组。
通过以上实施例1-3以及对比例1-5的PMSG冻干粉对母猪、母兔及母貉作用效果对比可知，注射实施例1-3的PMSG冻干粉制剂的实验组不管是诱导发情、超排效果、卵巢增重方面都要优于注射对比例1-5的PMSG冻干粉制剂的实验组。
另外，本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (4)

1.一种孕马血清促性腺激素冻干粉，其特征在于，每1g冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：500～2000IU，卵磷脂：30～100mg，赋形剂：30～80mg，环氧丙基磷酸二钠盐10～50mg，pH调节剂适量；
所述赋形剂为甘露醇和右旋糖酐；
孕马血清促性腺激素冻干粉的制备方法包括以下步骤：
(1)配料：按照成分配比称取孕马血清促性腺激素、卵磷脂、甘露醇、环氧丙基磷酸二钠盐和右旋糖酐，分别用水溶解，然后合并溶解液，pH调节剂调pH至7.0～7.5，200～1000rmp下搅拌20～60min，过滤；
(2)灌装：过滤药液置于转移灌中，经灌装机灌装入容器中；
(3)冷冻干燥：将灌装有药液的容器置于冷冻干燥箱中，冷冻干燥箱埋植感温仪，药液经冷冻干燥过程成粉末状；
所述冷冻干燥过程包括以下步骤：在0.5～1.5h内降温至-40～-55℃，保持30～60min；然后抽真空至2～30Pa，在8～10h内升温至20～35℃；在真空状态下4～5h内升温至35～40℃，然后继续保温2～4h。
2.根据权利要求1所述的孕马血清促性腺激素冻干粉，其特征在于，所述右旋糖酐为右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的孕马血清促性腺激素冻干粉，其特征在于，所述pH调节剂为盐酸、柠檬酸、山梨酸、苹果酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的孕马血清促性腺激素冻干粉，其特征在于，每1g冻干粉中，包括以下质量的成分：
孕马血清促性腺激素：1000IU，卵磷脂：50mg，甘露醇：35mg，右旋糖酐40：20mg，环氧丙基磷酸二钠盐30mg，pH调节剂适量。
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