CN109354351A

CN109354351A - 一种降解畜禽粪便中抗生素的方法

Info

Publication number: CN109354351A
Application number: CN201811229103.XA
Authority: CN
Inventors: 陈先锐
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2019-02-19

Abstract

本发明公开了一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，该方法首先通过具有抗性的短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉和绿色木霉对畜禽粪便中抗生素进行第一次发酵降解，然后再利用分解藻剂结合红外辐射技术进一步将抗生素降解成小分子物质，最后通过二次发酵产生的高温将微生物进行灭活。该方法能有效降解畜禽粪便中的抗生素为小分子无毒物质，还能杀灭粪便中的虫卵，从根本上解决了畜禽粪便中抗生素对环境的危害，同时经过二次发酵的畜禽粪便还能制作为有机肥，循环利用，变废为宝。

Description

一种降解畜禽粪便中抗生素的方法

技术领域

本发明属于环境污染修复技术领域，特别涉及一种降解畜禽粪便中抗生素的方法。

背景技术

随着集约化养殖的大力发展，兽用抗生素已成为现代农业与养殖业不可或缺的组成部分。但是抗生素经过动物肠道并不能被完全吸收，大部分的会以原形或代谢产物的形式由粪便和尿液排出体外，从而造成畜禽粪便中抗生素大量累积的情况。目前，在畜禽养殖过程中广泛使用的抗生素包括喹诺酮类、多肽类、四环素类、大环内酯类、磺胺类、氨基糖苷类六大类。由于此类抗生素结构复杂、生物降解困难且水溶性较好，很容易在环境中存储和积累。这些抗生素进入环境中会对微生物及植物种群产生严重影响，进而对人类的健康、生存造成危害，因此被视为重要的污染物。

微生物降解为目前常用的技术手段，具有效果好、环保无害的优点。抗生素的微生物降解是指在微生物作用下，抗生素残留物的结构和理化性质发生改变，从大分子化合物降解为小分子化合物，最终转变为水和二氧化碳，在这过程中，具有抗生素抗性的菌株起最重要的作用。

中国专利CN201710281415.4公开了一种利用微生物复合菌群降解畜禽粪污的工艺方法，在降解粪便抗生素过程中使用粪球产碱菌、硝化脱氮菌、硫化自养除臭菌、低温忌养菌、放线菌、嗜热杆菌、纤维素分解菌、芽孢杆菌复合菌群，发酵降解抗生素；专利CN201510636598.8公开了一种去除禽畜粪便中氟喹诺酮类抗生素的方法，使用高温堆肥结合产黄纤维单胞菌降解畜禽粪便中的氟喹诺酮类抗生素；专利CN201710077317.9公布了一种高效降解畜禽粪便中抗生素的堆肥方法，该方法使用凹凸棒土、活性炭和黄孢原毛平革菌进行对抗生素的降解。

上述方法中均采用了微生物进行抗生素降解，但忽略了微生物菌株对人体或者环境所造成的潜在致病危险，忽略了菌株对抗生素的敏感性，没有抗生素抗性的菌株被抗生素抑制生产，从而不能降解抗生素，且粪便中抗生素种类繁多，单一菌株和方法不能将这些抗生素的残留全部除去，效果降低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种降解畜禽粪便中抗生素的方法。本发明采用复合菌剂对抗生素进行初步降解，并结合分解藻剂和红外辐射技术，更加全面地降解粪便中抗生素，且所用菌株对环境和人体均无致病性，均具有抗生素抗性，能分泌相应的抗生素降解酶，最后能通过高温除去。本发明所用材料均为绿色环保材料，不会对环境造成二次污染。

本发明的技术方案如下：

一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，包括以下步骤：

（1）收集畜禽粪便，将其平铺在地面或者塑料薄膜上晾晒，晾晒至粪便的含水量为30-50%；

（2）往平铺的粪便上喷洒复合发酵菌剂，搅拌均匀后继续均匀铺开，并铺上一层薄土，进行第一次发酵降解抗生素，在室温条件下发酵5~7天，每隔3~4天搅拌一次，至含水量为10-20%；

（3）发酵结束后，加入分解藻剂，搅拌均匀后继续平铺，平铺高度≤3cm，然后利用红外辐射装置进行红外辐射，每天照射5h，共照射3~5天，进一步降解抗生素；

（4）红外辐射结束后，将粪便堆起，形成小山丘，并采用塑料薄膜将粪便包住，采用高温堆肥进行二次发酵降解抗生素，每隔4~5天搅拌一次，连续发酵8天。

作为本发明的进一步说明：所述复合发酵菌剂由以下重量份的组分组成：短小芽孢杆菌菌剂7~15%、鞘氨醇单胞菌菌剂5~13%、黑曲霉菌剂6~12%、绿色木霉菌剂6~10%。

作为本发明的进一步说明：所述复合发酵菌剂加入量为100~500g/m³。

作为本发明的进一步说明：所述复合发酵菌剂是通过以下制作方法制得：

第一步，菌种活化，将初代菌使用涂布法接种到相应固体培养基中，25~37℃培养5~7天；

第二步，筛选和纯化抗性菌株，用无菌接种环从培养基中挑选生长良好的正确的菌株，使用三线法接种于含抗生素的相应的固体培养基中，培养箱温度设置为25~37℃；待菌株进入生长期即生长到第三线时，使用无菌接种环挑选第三线中生长良好的单一菌落接种于新的含抗生素的相应的固体培养基中，25~37℃条件下进行纯化培养，记录每种菌株进入生长期的时间为T；

第三步，抗性菌株液体发酵，待纯化的菌株生长到第三线中端时，使用无菌接种环将第三线中的菌落接种到相应的无抗生素添加的液体培养基中，震荡培养，培养时间为T，培养温度为25~37℃，培养时间结束后，离心，收集菌体并称重；

第四步，抗性菌株菌剂的制备，将收集的各菌种的菌体与稻壳粉及保护剂按1 : 3 :0.3的比例混合，喷雾干燥，即得菌剂；

第五步，复合抗性菌剂的使用，将4种菌剂按照比例进行混合均匀，即为复合发酵菌剂。

作为本发明的进一步说明：所述复合发酵菌株所用培养基为：短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌所用培养基包括蛋白胨12g 、酵母提取物10g、磷酸氢二钾1.2g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁4.5g、氯化钠1g，加水至1000mL，调节pH为7.2~7.5；绿色木霉和黑曲霉所用培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g，加水1000mL，其中，固体培养基中加入琼脂10~15g/1000mL，液体培养基中无琼脂。

作为本发明的进一步说明：所述含抗生素的培养基中加入抗生素为青霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、氟苯尼考，加入量为0.05 % : （0.01~0.05）% : 0.15% : 0.05% :（0.02~0.1）%。

作为本发明的进一步说明：所述菌剂保护剂为β-环糊精和吐温-80，按1 : 0.2比例混合加入。

作为本发明的进一步说明：所述分解藻剂为红藻、三氯化铁和氯化钠混合。

作为本发明的进一步说明：所述分解藻剂的添加量为红藻12~24g、三氯化铁2~4.8g、氯化钠1.2~3.4g；将三氯化铁和氯化钠溶解于100mL水中，高温灭菌后，再将红藻接入无菌水中，在光照下，25℃震荡培养3~5天。

作为本发明的进一步说明：所述红外辐射照射波长为8~22，功率为250W~475W，辐射装置与物料间垂直距离为10~20cm。

作为本发明的进一步说明：分解藻剂的添加量为300~500mL/m³。

本发明的技术原理如下：

在降解过程中，具有降解抗生素功能的微生物主要是具有抗生素抗性的耐药菌。在降解过程中，如果降解菌株没有抗生素抗性，则不能产生相应的降解酶，或者被粪便中抗生素抑制从而不能生长，无法产生降解作用。在对复合菌种传代过程时在培养基中加入抗生素，可使微生物适应抗生素存在的环境，产生一定的抗生素抗性，通过分离纯化能在抗生素培养基中生长的菌株即可获得降解抗生素所需要的具有抗生素抗性微生物。在本发明中，我们在培养基中添加了青霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、氟苯尼考，它们分别是β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素和氯霉素类抗生素，是目前动物养殖中常用的抗生素种类，抗生素的添加量最高为0.4%，低浓度抗生素对微生物培养能够起到筛选作用，使具有抗生素抗性的微生物得以保留。使用菌种为短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉和绿色木霉，该菌种均可通过高温进行灭活，发酵结束后可以通过高温将具有耐药性菌种灭活，减少抗性菌株对环境造成的二次污染。

β-环糊精和吐温-80作为菌剂的保护剂被添加入菌剂中，为了让复合菌种能更容易保藏和运输，我们将复合菌种制作成固体菌剂，在制作过程中，特别是后期干燥，由于高温和干燥的作用会使菌种失活，β-环糊精具有良好的包裹性能，能将菌种包裹在其结构中，吐温-80则进入细胞中，在细胞失水时进入，使细胞环境维稳，减少高温和干燥对菌株造成的影响，从而减少菌种的失活。将菌种洒在畜禽粪便中后，由于粪便中水分的存在，吐温-80具有吸潮性，吸收水分，使菌种细胞水分增加，菌种恢复其活性，然后利用稻壳粉和β-环糊精作为碳源和氮源生长，稻壳粉、β环糊精被分解。

在降解抗生素过程中，由于抗生素种类繁多，使用单一微生物不能很好的完全降解，所以使用复合微生物能更高效完全地降解畜禽粪便中的抗生素。短小芽孢杆菌为芽孢杆菌属，其在土壤中广泛存在，具有无毒害、繁殖能力快、抗逆能力强、易存活等优点。在抗生素降解中，通过前期抗生素抗性培养，能产生氯霉素乙酰转移酶和β-内酰胺酶，通过修饰氯霉素类抗生素的母体结构和β-内酰胺类抗生素杂环硫醇侧链C3位置使β-内酰胺环开环，从而改变抗生素的结构使其失活。在生长过程中，短小芽孢杆菌还能分泌多种酶类如蛋白酶和纤维素酶，将畜禽粪便中的蛋白物质和纤维降解，且在畜禽粪便处理中，其对蚊蝇的生长繁殖也具有抑制作用，在厌氧条件下发酵后可改变粪便中锌、铜等的化学变化，降解吲哚类物质，从而去除粪便堆积带来的恶臭气味。

鞘氨醇单胞菌为典型的好氧、化能自养、革兰氏阴性菌，其对大环内酯和四环素类抗生素具有强的分解作用，通过对抗生素母体及其降解产物中的苯环进行修饰、开环和脱氮等过程将抗生素降解为醛类和醇类。且在寡营养的条件下，其和短小芽孢杆菌能将抗生素作为碳源和氮源加以利用，进一步降解抗生素。

绿色木霉和黑曲霉分泌的过氧化物酶能通过取代基氧化、单羟基化作用将畜禽粪便中的抗生素降解。除此之外，绿色木霉和黑曲霉在降解粪便对堆肥质量具有辅助协同作用。绿色木霉能产生大量的内切和外切葡聚糖酶，催化粪便中纤维素类底物产生大量纤维二糖，纤维二糖进一步诱导黑曲霉生产大量的β-葡萄糖苷酶，有效降解纤维二糖生成葡萄糖，供给绿色木霉和黑曲霉利用，改善纤维素酶的组分配比，提高纤维素酶的总体酶活。在生成纤维素酶的同时，绿色木霉和黑曲霉还能通过产酶作用提高温度，第二次发酵使用薄膜保温，使粪便中温度随着纤维素酶产生而升高，最高可达70℃，从而杀死粪便中的不耐热细菌和虫卵，加快粪便的腐熟，提高堆肥质量。

采用真菌与细菌的复合，能协同降解畜禽粪便中的抗生素，在降解过程前期，由于真菌较细菌生长速度快，真菌快速繁殖，一方面降解畜禽粪便中抗生素，一方面分泌蛋白酶、纤维素酶等将畜禽粪便中的大分子物质降解，给细菌繁殖提供了良好的碳源和氮源；待细菌与真菌同时快速增长时，由于畜禽粪便中营养物质有限，真菌开始进入产孢期，而短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌能利用抗生素作为唯一氮源和碳源继续繁殖，进一步降解畜禽粪便中抗生素。该四种微生物均为环境中广泛存在的无毒害的微生物，对环境和人体友好，不会造成人和动物染病等。

通过微生物的复合发酵作用，将抗生素转化为生物体的组成部分或小分子物质，但是其降解还不够彻底，需要更进一步将已经失活的抗生素降解为水和二氧化碳等小分子、环境无害的物质。采用光敏剂结合红外辐射可以对抗生素进行更进一步的降解。光敏剂通过吸收光能后，把能量传递给抗生素分子从而进行光化学反应红藻中含有大量的藻蓝蛋白，红藻细胞中藻蓝蛋白经过光照后，吸收光子的能量，经单重态系间串跃到三重态，电子的转移，直接或者间接使抗生素分子的结构进行分解成更小的分子物质。红外辐射可传播光能，在波长为8~22μm时，其波长可被物料吸收，其辐射功率越高，产生的能量越大，高功率辐射产生光能的同时可产生热能，所以选择250w~475w为红外辐射功率，在此功率下，10~20cm物料距离内，可以让物料很好的接收红外光能，且让物料表面温度保持在正常温度下。通过红外辐射，表层的土壤还会形成大量的自由基、过氧化物和单重态氧，加速抗生素分子的降解。红藻在光照条件下能利用二氧化碳为碳源生长。三氯化铁和氯化钠溶液能为红藻提供营养，使红藻在溶液中进行繁殖，且铁离子和氯化钠能促进红藻产生藻蓝蛋白，三氯化铁和氯化钠中铁离子和钠离子还能提高藻蓝蛋白的稳定性，通过添加铁离子和钠离子，能增强藻蓝蛋白对光的吸收，且在光照下，Fe³⁺能发生氧化还原反应，为藻蓝蛋白降解抗生素提供电子转移的能量。

本发明的有益效果：

本发明利用对环境和人体无害的复合菌剂使畜禽粪便中的抗生素结构和性质发生改变，降解或转变为无毒物质，然后利用分解藻剂结合红外辐射技术进一步将抗生素分子进行降解后二次发酵形成高温灭活粪便中微生物，使抗生素降解更加完全，所用材料均为无毒无害物质，不对环境造成二次污染，经过处理后的畜禽粪便可直接作为肥料，变废为宝。

具体实施方式

实施例1：

（1）抗性菌株的制备：将短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉、绿色木霉的初代菌使用涂布法分别接种到相应固体培养基中，短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌在37℃下培养7天，黑曲霉和绿色木霉在25℃下培养5天；培养结束后，用无菌接种环从培养基中挑选生长良好的正确的菌株，使用三线法接种于含抗生素的相应的固体培养基中，培养箱温度设置为30℃；待菌株进入生长期即生长到第三线时，使用无菌接种环挑选第三线中生长良好的单一菌落接种于新的含青霉素0.05%、卡那霉素0.01%、四环素0.15%、红霉素0.05%和氟苯尼考0.02%的相应的固体培养基中，30℃条件下进行纯化培养；待纯化的菌株生长到第三线中端时，记录培养时间为T，使用无菌接种环将第三线中的菌落接种到相应的无抗生素添加的液体培养基中，震荡培养。培养时间为T，培养温度为30℃。培养时间结束后，离心，收集菌体并称重；然后将收集的各菌种的菌体与稻壳粉及保护剂（β-环糊精和吐温-80）按1 : 3 : 0.3的比例混合，喷雾干燥后得到相应菌剂；最后按照7%、5%、6%、6%的比例分别加入短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉和绿色木霉混合得复合菌剂。

（2）畜禽粪便的收集：将其平铺在地面或者塑料薄膜上晾晒，晾晒至粪便的含水量为30-50%；

（3）往平铺的粪便上喷洒复合发酵菌剂，喷洒量为500g/m³，搅拌均匀后继续均匀铺开，并铺上一层薄土，进行第一次发酵降解抗生素，在室温条件下发酵7天，每隔4天搅拌一次，至含水量为10-20%；

（4）分解藻剂配置：将2g三氯化铁和1.2g氯化钠溶解于100mL水中，高温灭菌后，再将12g红藻接入无菌水中，在光照下，25℃震荡培养3天。

（5）发酵结束后，加入配置好的分解藻剂，加入量为300mL/m³，搅拌均匀后继续平铺，平铺高度≤3cm，然后利用红外辐射装置进行红外辐射，功率为250W，波长为8 ，与物料距离为10cm条件下每天照射5h，共照射5天，进一步氧化降解抗生素；

（6）红外辐射结束后，将粪便堆起，形成小山丘，并采用塑料薄膜将粪便包住，采用高温堆肥进行二次发酵降解抗生素，每隔4天搅拌一次，连续发酵8天。

实施例2：

（1）抗性菌株的制备：将短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉、绿色木霉的初代菌使用涂布法分别接种到相应固体培养基中，短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌在37℃下培养6天，黑曲霉和绿色木霉在25℃下培养5天；培养结束后，用无菌接种环从培养基中挑选生长良好的正确的菌株，使用三线法接种于含抗生素的相应的固体培养基中，培养箱温度设置为25℃；待菌株进入生长期即生长到第三线时，使用无菌接种环挑选第三线中生长良好的单一菌落接种于新的含青霉素0.05%、卡那霉素0.02%、四环素0.15%、红霉素0.05%和氟苯尼考0.04%的相应的固体培养基中，30℃条件下进行纯化培养；待纯化的菌株生长到第三线中端时，记录培养时间为T，使用无菌接种环将第三线中的菌落接种到相应的无抗生素添加的液体培养基中，震荡培养。培养时间为T，培养温度为25℃。培养时间结束后，离心，收集菌体并称重；然后将收集的各菌种的菌体与稻壳粉及保护剂（β-环糊精和吐温-80）按1 : 3 : 0.3的比例混合，喷雾干燥后得到相应菌剂；最后按照15%、13%、12%、10%的比例分别加入短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉和绿色木霉混合得复合菌剂。

（3）往平铺的粪便上喷洒复合发酵菌剂，喷洒量为100g/m³，搅拌均匀后继续均匀铺开，并铺上一层薄土，进行第一次发酵降解抗生素，在室温条件下发酵5天，每隔3天搅拌一次，至含水量为10-20%；

（4）分解藻剂配置：将4.8g三氯化铁和2.4g氯化钠溶解于100mL水中，高温灭菌后，再将24g红藻接入无菌水中，在光照下，25℃震荡培养5天。

（5）发酵结束后，加入配置好的分解藻剂，加入量为500mL/m³，搅拌均匀后继续平铺，平铺高度≤3cm，然后利用红外辐射装置进行红外辐射，功率为300W，波长为10 ，与物料距离为15cm条件下每天照射5h，共照射5天，进一步氧化降解抗生素；

实施例3：

（1）抗性菌株的制备：将短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉、绿色木霉的初代菌使用涂布法分别接种到相应固体培养基中，短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌在37℃下培养7天，黑曲霉和绿色木霉在25℃下培养5天；培养结束后，用无菌接种环从培养基中挑选生长良好的正确的菌株，使用三线法接种于含抗生素的相应的固体培养基中，培养箱温度设置为30℃；待菌株进入生长期即生长到第三线时，使用无菌接种环挑选第三线中生长良好的单一菌落接种于新的含青霉素0.05%、卡那霉素0.03%、四环素0.15%、红霉素0.05%和氟苯尼考0.06%的相应的固体培养基中，30℃条件下进行纯化培养；待纯化的菌株生长到第三线中端时，记录培养时间为T，使用无菌接种环将第三线中的菌落接种到相应的无抗生素添加的液体培养基中，震荡培养。培养时间为T，培养温度为30℃。培养时间结束后，离心，收集菌体并称重；然后将收集的各菌种的菌体与稻壳粉及保护剂（β-环糊精和吐温-80）按1 : 3 : 0.3的比例混合，喷雾干燥后得到相应菌剂；最后按照10%、8%、9%、8%的比例分别加入短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉和绿色木霉混合得复合菌剂。

（3）往平铺的粪便上喷洒复合发酵菌剂，喷洒量为400g/m³，搅拌均匀后继续均匀铺开，并铺上一层薄土，进行第一次发酵降解抗生素，在室温条件下发酵7天，每隔4天搅拌一次，至含水量为10-20%；

（4）分解藻剂配置：将3g三氯化铁和3g氯化钠溶解于100mL水中，高温灭菌后，再将20g红藻接入无菌水中，在光照下，25℃震荡培养4天。

（5）发酵结束后，加入配置好的分解藻剂，加入量为350mL/m³，搅拌均匀后继续平铺，平铺高度≤3cm，然后利用红外辐射装置进行红外辐射，功率为470W，波长为22 ，与物料距离为20cm条件下每天照射5h，共照射5天，进一步氧化降解抗生素；

（6）红外辐射结束后，将粪便堆起，形成小山丘，并采用塑料薄膜将粪便包住，采用高温堆肥进行二次发酵降解抗生素，每隔5天搅拌一次，连续发酵8天。

实施例4：

（1）抗性菌株的制备：将短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉、绿色木霉的初代菌使用涂布法分别接种到相应固体培养基中，短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌在37℃下培养5天，黑曲霉和绿色木霉在25℃下培养5天；培养结束后，用无菌接种环从培养基中挑选生长良好的正确的菌株，使用三线法接种于含抗生素的相应的固体培养基中，培养箱温度设置为25℃；待菌株进入生长期即生长到第三线时，使用无菌接种环挑选第三线中生长良好的单一菌落接种于新的含青霉素0.05%、卡那霉素0.04%、四环素0.15%、红霉素0.05%和氟苯尼考0.08%的相应的固体培养基中，25℃条件下进行纯化培养；待纯化的菌株生长到第三线中端时，记录培养时间为T，使用无菌接种环将第三线中的菌落接种到相应的无抗生素添加的液体培养基中，震荡培养。培养时间为T，培养温度为25℃。培养时间结束后，离心，收集菌体并称重；然后将收集的各菌种的菌体与稻壳粉及保护剂（β-环糊精和吐温-80）按1 : 3 : 0.3的比例混合，喷雾干燥后得到相应菌剂；最后按照10%、5%、10%、10%的比例分别加入短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉和绿色木霉混合得复合菌剂。

（3）往平铺的粪便上喷洒复合发酵菌剂，喷洒量为200g/m³，搅拌均匀后继续均匀铺开，并铺上一层薄土，进行第一次发酵降解抗生素，在室温条件下发酵7天，每隔4天搅拌一次，至含水量为10-20%；

（4）分解藻剂配置：将4.8g三氯化铁和1.2g氯化钠溶解于100mL水中，高温灭菌后，再将15g红藻接入无菌水中，在光照下，25℃震荡培养4天。

（5）发酵结束后，加入配置好的分解藻剂，加入量为400mL/m³，搅拌均匀后继续平铺，平铺高度≤3cm，然后利用红外辐射装置进行红外辐射，功率为350W，波长为20 ，与物料距离为15cm条件下每天照射5h，共照射5天，进一步氧化降解抗生素；

实施例5：

（1）抗性菌株的制备：将短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉、绿色木霉的初代菌使用涂布法分别接种到相应固体培养基中，短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌在37℃下培养7天，黑曲霉和绿色木霉在25℃下培养5天；培养结束后，用无菌接种环从培养基中挑选生长良好的正确的菌株，使用三线法接种于含抗生素的相应的固体培养基中，培养箱温度设置为37℃；待菌株进入生长期即生长到第三线时，使用无菌接种环挑选第三线中生长良好的单一菌落接种于新的含青霉素0.05%、卡那霉素0.05%、四环素0.15%、红霉素0.05%和氟苯尼考0.1%的相应的固体培养基中，37℃条件下进行纯化培养；待纯化的菌株生长到第三线中端时，记录培养时间为T，使用无菌接种环将第三线中的菌落接种到相应的无抗生素添加的液体培养基中，震荡培养。培养时间为T，培养温度为37℃。培养时间结束后，离心，收集菌体并称重；然后将收集的各菌种的菌体与稻壳粉及保护剂（β-环糊精和吐温-80）按1 : 3 : 0.3的比例混合，喷雾干燥后得到相应菌剂；最后按照10%、12%、6%、8%的比例分别加入短小芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、黑曲霉和绿色木霉混合得复合菌剂。

（3）往平铺的粪便上喷洒复合发酵菌剂，喷洒量为200g/m³，搅拌均匀后继续均匀铺开，并铺上一层薄土，进行第一次发酵降解抗生素，在室温条件下发酵6天，每隔4天搅拌一次，至含水量为10-20%；

（4）分解藻剂配置：将2g三氯化铁和3.4g氯化钠溶解于100mL水中，高温灭菌后，再将20g红藻接入无菌水中，在光照下，25℃震荡培养5天。

（5）发酵结束后，加入配置好的分解藻剂，加入量为400mL/m³，搅拌均匀后继续平铺，平铺高度≤3cm，然后利用红外辐射装置进行红外辐射，功率为450W，波长为10 ，与物料距离为10cm条件下每天照射5h，，进一步氧化降解抗生素；

Claims

1.一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于，所述复合发酵菌剂由以下重量份的组分组成：短小芽孢杆菌菌剂7~15%、鞘氨醇单胞菌菌剂5~13%、黑曲霉菌剂6~12%、绿色木霉菌剂6~10%。

3.根据权利要求1所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于，所述复合发酵菌剂加入量为100~500 g/m³。

4.根据权利要求1所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于，所述复合发酵菌剂是通过以下制作方法制得：

第四步，抗性菌株菌剂的制备，将收集的各菌种的菌体与稻壳粉及保护剂按1:3:0.3的比例混合，喷雾干燥，即得菌剂；

5.根据权利要求4所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于：所述复合发酵菌株所用培养基为：短小芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌所用培养基包括蛋白胨12g、酵母提取物10g、磷酸氢二钾1.2g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁4.5g、氯化钠1g，加水至1000mL，调节pH为7.2~7.5；绿色木霉和黑曲霉所用培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g，加水1000mL，其中，固体培养基中加入琼脂10~15g/1000mL，液体培养基中无琼脂。

6.根据权利要求4所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于：所述含抗生素的培养基中加入抗生素为青霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、氟苯尼考，加入量为0.05 % :（0.01~0.05）% : 0.15% : 0.05% : （0.02~0.1）%。

7.根据权利要求4所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于，所述菌剂保护剂为β-环糊精和吐温-80，按1 : 0.2比例混合加入。

8.根据权利要求1所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于：所述分解藻剂为红藻、三氯化铁和氯化钠混合；所述分解藻剂的添加量为红藻12~24g、三氯化铁2~4.8g、氯化钠1.2~3.4g；将三氯化铁和氯化钠溶解于100mL水中，高温灭菌后，再将红藻接入无菌水中，在光照下，25℃震荡培养3~5天。

9.根据权利要求1所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于：所述红外辐射照射波长为8~22，功率为250W~475W，辐射装置与物料间垂直距离为10~20cm。

10.根据权利要求1所述一种降解畜禽粪便中抗生素的方法，其特征在于：分解藻剂的添加量为300~500mL/m³。