CN109342634A - 一种柱前衍生-hplc测定dxs酶催化活性的方法 - Google Patents

一种柱前衍生-hplc测定dxs酶催化活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种柱前衍生‑HPLC测定1‑脱氧‑D‑木酮糖5‑磷酸合酶(DXS)催化活性的方法，明确了1,2‑邻氨基苯(OPDA)及其类似物为适宜的衍生化试剂。DXS催化的1‑脱氧‑D‑木酮糖5‑磷酸(DXP)合成反应结束后，加入1,2‑邻氨基苯或其类似物对反应中剩余的反应底物丙酮酸、D‑甘油醛‑3‑磷酸进行衍生化，再以HPLC利用甲醇‑水或乙腈‑水为流动相进行梯度洗脱，紫外检测仪检测，然后通过计算反应体系中丙酮酸和/或D‑甘油醛‑3‑磷酸的消耗量来确定DXS的催化活性。本发明限定的衍生化试剂，衍生化反应条件温和，反应迅速，操作简单，HPLC检测灵敏度高，重现性好，检测结果准确。

Description

一种柱前衍生-HPLC测定DXS酶催化活性的方法
技术领域
本发明属于酶研究领域，涉及一种柱前衍生-HPLC测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的方法。
背景技术
萜类化合物又称类异戊二烯，是生物体内广泛存在的一类天然烃类化合物，它们在生物体中发挥着重要的作用，如植物甾醇参与生物膜的构建；泛醌参与呼吸作用；类胡萝卜素及叶绿素的侧链和质体醌参与光合作用；雌激素参与细胞间信号传递过程并可控制个体的生长发育；多萜醇和异戊二烯基团参与蛋白修饰；甜椒醇(capsidiol)等可作为抗菌素及植物抗毒素用于物种间相互防御；赤霉素、脱落酸、细胞分裂素和油菜素内酯调节植物生长发育；维生素A的存在可促进视网膜的正常功能，缺乏则导致夜盲症；维生素D能促进钙、磷在肠内的吸收，维持血钙血磷的平衡，促进骨质的钙化等。同时，植物中所含的其它一些萜类化合物在调节植物与环境的关系上发挥重要的生态功能，如防御食草动物和病原微生物，吸引传粉动物和播种动物，作为中间感应化合物参与中间竞争等。萜类物质还具有抗氧化活性，在人体中可起着延缓衰老和增强免疫力的作用，其中不少萜类化合物还具有很好的药理活性，是中药和天然植物药的主要有效成分，如目前广泛使用的抗疟药物青蒿素、抗心血管疾病的银杏内酯及具有很强抗癌活性的化合物紫杉醇等。
长期以来，生物体内的萜类化合物被认为是由乙酰辅酶A经甲羟戊酸(MVA)而合成，并认为MVA是萜类化合物生物合成的唯一前体，故该生物合成途径被称为MVA途径。但到上世纪九十年代初，人们发现萜类化合物的生物合成除MVA途径外，还存在一条非甲羟戊酸途径，由于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)和2-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸(MEP)是这一新途径中的两个重要中间体，故称为DXP/MEP途径，现称为MEP途径。
最新研究证明，动物(包括人类)主要通过经典的MVA途径来合成其所需的萜类化合物，而人类的一些主要致病菌及原虫，则是利用MEP途径来合成其所必需的萜类化合物，这种途径完全不同于哺乳动物和植物胞浆中的MVA途径。由于该途径合成的类异戊二烯及其衍生物在微生物的代谢过程及其细胞壁合成中至关重要，抑制或切断该途径即可达到抑菌或杀菌的目的，这就为人们提供了一个利用MEP途径中的酶为靶标进行新抗菌活性化合物筛选的强有力的方法，而使用该方法进行筛选的最大优点在于筛选的过程不需考虑选择性。因此，这条新发现的MEP途径在新类型抗菌素的发现方面将具有非常广阔的应用前景，尤其是在当前病菌对现存的各种抗菌素的耐受性日益提高的情况下。目前，对该生物合成途径中的酶及它们的作用机理的研究已成为一个热点，由于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)是MEP途径中的第一个关键酶，也是该途径的第一个关键调控位点，所以对它的研究也倍受重视，而对该酶催化活性测定方法的研究则是所有其它研究开展的基础。
目前DXS催化活性的测定方法已有一些报道，包括以14C标记的丙酮酸为底物的放射性示踪法，以3,5-二氨基苯甲酸为显色剂的荧光光度法，以丙酮酸脱氢酶或1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构化酶(DXR)为偶合酶的酶联测定法，LC-MS方法等等。这些方法虽然可用于DXS催化活性的测定，但均存在着各自不可克服的缺点，如放射性示踪法需要使用放射性同位素，荧光光度法中来自反应底物D-GAP的干扰，酶联测定法需要引入另外一个酶，LC-MS法中需要昂贵的大型仪器及同位素标记的化合物为参照。为解决这些问题，科学工作者建立了以柱前衍生-HPLC为基础的测定方法，衍生化试剂包括2-或4-氨基苯甲酸及2,4-二硝基苯肼。但这两种方法的主要缺点是这些衍生化试剂很难与DXS反应的产物DXP直接反应生成衍生化产物，故需要先将DXP去磷酸化得到1-脱氧-D-木酮糖(DX)，然后再于较温和的反应条件下进行衍生化反应。而DXP去磷酸化又涉及到碱性磷酸酶使用，这就使得这些衍生化方法并不适合用于DXS抑制剂的筛选实验。因此发现并建立更加实用的DXS催化活性的测定方法仍然很有意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更加实用的DXS催化活性的测定的方法，该方法适用于在实验室中以常见的HPLC这种检测手段，经柱前衍生后测定DXS的催化活性，解决了背景技术中DXS催化活性测定的方法中需要大型昂贵的仪器、或需要进行放射性检测、或需要引入另外一个酶等技术问题。
该方法是结合HPLC技术，在柱前衍生的基础上通过检测底物的消耗量来分析DXS酶催化活性并测定其稳态动力学参数。
本发明首先给出了更为适宜的衍生化试剂，即：1,2-邻氨基苯(OPDA)及其类似物。原理是：
在酸性条件下丙酮酸可与1,2-二氨基苯(OPDA，也称1,2-邻氨基苯)、4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)或2,3-二氨基萘(DAN)生成喹喔啉衍生物，利用HPLC分离并紫外检测就可对其进行定量分析。而丙酮酸为DXS催化反应中的底物，那么通过测定反应中消耗的丙酮酸就可以测定DXS的催化活性及稳态动力学参数等。过程如下：
丙酮酸可与1,2-二氨基苯及其类似物在酸性条件下可生成喹喔啉衍生物，再利用HPLC即可对丙酮酸进行定量分析。这种丙酮酸的分析方法已有报道，常用于食品及体液中酮酸类化合物测定，我们首次将该方法用于DXS酶的活性测定及稳态动力学分析。同时我们还发现，1,2-二氨基苯及其类似物在同样的条件下也可与DXS酶的另一底物D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)反应生成磷酸化的喹喔啉衍生物，再利用HPLC即可对D-GAP进行定量分析，这是一个我们首次发现并将其应用于DXS酶催化活性测定定及稳态动力学分析的反应，具体过程如下：
所以，1,2-邻氨基苯(OPDA)及其类似物，具有作为衍生化试剂以柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的用途。
其中，所述类似物可以是4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)和2,3-二氨基萘(DAN)等。
需要说明的是，相应的权利要求保护方案应当理解为1,2-邻氨基苯及其类似物中的任意一种具有这种用途。
利用上述衍生化试剂以柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的方法，主要包括以下步骤：
(1)DXS催化反应的反应体系：
将D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)、丙酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及DXS酶加入到缓冲液中，进行孵育；
(2)丙酮酸及D-GAP的衍生化：
步骤(1)催化反应结束后，反应体系中加入所述衍生化试剂，孵育，进行衍生化反应；
(3)反相HPLC检测：
将步骤(2)中得到的样品，经过离心后取上清液，过0.22μM膜，然后进行HPLC检测；
(4)根据HPLC检测结果计算丙酮酸、D-GAP的消耗量，进而得出DXS催化活性及稳态动力学参数。
其中，步骤(1)的反应体系可为：以反应总体积50-200μL计，底物D-GAP及丙酮酸的浓度均为1.0-5.0mM；二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+，浓度为2.0-10.0mM；ThPP浓度为0.5-2.0mM，酶为微生物源或植物源DXS，用量为0.2-1.0mg/ml；所用缓冲液为40-200mM的Tris-HCl或PBS或柠檬酸或MOPS缓冲液，pH6.0-8.5；孵育温度为25-40℃，孵育时间为0.5-2h。
上述衍生化试剂的储备液是以1.0-3.0M盐酸配制为10.0-20.0mM溶液。
进一步的，步骤(2)的具体操作如下：将步骤(1)获得的反应液中加入衍生化试剂50-200μL，孵育温度为40-80℃，孵育时间为0.2-2h。
进一步的，步骤(3)的检测体系中，HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies1200HPLC仪或Waters 1525HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为10-50μL；流速为0.5-2.0mL/min；检测波长为240-400nm；柱温为20-40℃；流动相为甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为10-30min。梯度洗脱的具体条件如下：
甲醇/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B；
乙腈/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min,80％流动相B；23min,40％流动相B；
四氢呋喃/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：四氢呋喃；梯度为0min，35％流动相B；15min，60％流动相B；18min，35％流动相B；20min，35％流动相B。
本发明具有以下有益效果：
1、衍生化反应条件温和，反应迅速，检测结果准确，检测灵敏度高，方法操作简单，重现性好。
2、该方法适用于在实验室中采用常见的反相HPLC检测手段通过测定方法底物的消耗量来计算DXS的催化活性及稳态动力学参数，不需大型昂贵的仪器，或进行放射性检测等。
3、不仅可用于DXS催化活性测定及稳态动力学参数分析，还可用于DXS抑制剂的筛选。
附图说明
图1为两种衍生化试剂分别测定丙酮酸的工作曲线，左图：DAN作为衍生化试剂；右图：NPDA作为衍生化试剂。
图2为两种衍生化试剂分别测定D-GAP的工作曲线，左图：DAN作为衍生化试剂；右图：NPDA作为衍生化试剂。
图3为2,3-二氨基萘(DAN)为衍生化试剂时LC-MS和HPLC测定结果，其中A、DAN试剂本身；B、DAN与丙酮酸(pyruvate)标准品的衍生化结果；C、DAN与D-GAP标准品的衍生化结果；D、DAN与DXS催化的反应混合物的衍生化结果。
图4为4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)为衍生化试剂时LC-MS和HPLC测定结果，其中A、NPDA试剂本身；B、NPDA与丙酮酸标准品的衍生化结果；C、NPDA与D-GAP标准品的衍生化结果；D、NPDA与DXS催化的反应混合物的衍生化结果。
图5为以两种衍生化试剂测定DXS稳态动力学参数的结果(以丙酮酸的消耗量计算)，其中A、DAN作为衍生化试剂；B、NPDA作为衍生化试剂。
图6为以两种衍生化试剂测定DXS稳态动力学参数的结果(以D-GAP的消耗量计算)，其中A、DAN作为衍生化试剂；B、NPDA作为衍生化试剂。
具体实施方式
该方法包括以下具体步骤：
1、DXS催化的反应：
将1.0-5.0mM的D-GAP、1.0-5.0mM的丙酮酸，2-10mM的Mg2+、0.5-2.0mM的ThPP，0.2-1.0mg/ml的DXS酶加入到50-200μL的40-200mM的Tris-HCl或PBS(pH6.0-8.5)缓冲液中，25-40℃孵育0.5-2h。
2、衍生化反应：
DXS催化的反应结束后，取反应混合物50-200μL，加入衍生化试剂50-200μL(衍生化试剂储备液均以1.0-3.0M盐酸配制为10.0-20.0mM溶液)，40-80℃孵育0.2-2h。
3、HPLC检测：
衍生化后所得的样品在12000rpm条件下离心，取上清液过0.22μm滤膜，然后取10-50μL滤液进入HPLC系统中进行测定。色谱条件为：
HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200HPLC仪或Waters 1525HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为10-50μL；流速为0.5-2.0mL/min；检测波长为240-400nm；柱温为20-40℃；流动相为甲醇/水或乙腈/水，梯度洗脱。甲醇/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B。乙腈/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min,80％流动相B；23min,40％流动相B。
4.根据HPLC测定结果计算DXS催化活性及稳态动力学参数。
实施例一：以2,3-二氨基萘(DAN)为衍生化试剂
1、2,3-二氨基萘(DAN)与丙酮酸及D-GAP的衍生物的LC-MS鉴定：
丙酮酸水溶液(1.0mM)或D-GAP水溶液(1.0mM)50μL中分别加入等体积的DAN储备液(10.0mM，1.0M盐酸溶水液)，混合均匀后60℃下孵育1h。衍生化后的样品10000rpm离心5min后，上清液分别以0.22μm膜过滤，然后各取20μL滤液进行LC-MS测定，测定结果见图3。
2、DXS催化活性测定：
1)工作曲线：不同浓度的丙酮酸水溶液(1.0μM-1.0mM)50μL中分别加入等体积的DAN储备液(10.0mM，1.0M盐酸溶水液)，混合均匀后60℃下孵育1h。衍生化后的样品10000rpm离心5min后，上清液分别以0.22μm膜过滤，然后各取20μL滤液进行HPLC测定。HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为20μL；流速为0.7mL/min；检测波长为364nm；柱温为25℃；流动相为甲醇/水，梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B。根据测定结果，以峰面积对丙酮酸浓度作图，制备丙酮酸的工作曲线。D-GAP的工作曲线按照完全相同的步骤测定。
2)DXS催化的反应：将2.0mM的D-GAP、2.0mM的丙酮酸，2.0mM的Mg2+、0.5mM的ThPP，25μg的DXS酶加入到150μL的50mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，37℃孵育0.5h。
3)衍生化反应：DXS催化的反应结束后，取反应混合物50μL，加入衍生化试剂DAN的储备液50μL(DAN储备液以1.0M盐酸配制为10.0mM溶液)，60℃孵育1h。
4)HPLC检测：衍生化后的样品10000rpm离心5min后，上清液以0.22μm膜过滤，然后取20μL滤液进行HPLC测定，方法同1)中。根据测定结果，利用工作曲线计算底物丙酮酸和/或D-GAP的消耗量，进而获得DXS的催化活性(比活力)。
3、DXS稳态动力学参数参数测定：
1)Km 丙酮酸测定：DXS催化的反应体系为：将20.0mM的D-GAP、0.025-2.0mM的丙酮酸，2.0mM的Mg2+、0.5mM的ThPP，2.0μg的DXS酶加入到200μL的50mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，37℃孵育5.0min。反应完成后，衍生化及HPLC测定过程均与1中相同。所得数据以GraphPad Prism处理以计算丙酮酸的米氏常数Km；
2)Km D-GAP测定：DXS催化的反应体系为：将20.0mM的丙酮酸、0.03-3.0mM的D-GAP，2.0mM的Mg2+、0.5mM的ThPP，2.0μg的DXS酶加入到200μL的50mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，37℃孵育5.0min。反应完成后，衍生化及HPLC测定过程均与1中相同。所得数据以GraphPad Prism处理以计算D-GAP的米氏常数Km；
实施例二：以4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)为衍生化试剂
1、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)与丙酮酸及D-GAP的衍生物的LC-MS鉴定：
丙酮酸水溶液(1.0mM)或D-GAP水溶液(1.0mM)50μL中分别加入等体积的NPDA储备液(10.0mM，1.0M盐酸溶水液)，混合均匀后45℃下孵育20min。衍生化后的样品10000rpm离心5min后，上清液分别以0.22μm膜过滤，然后各取20μL滤液进行LC-MS测定，测定结果见图4。
2、DXS催化活性测定：
1)工作曲线：不同浓度的丙酮酸溶液(1.0μM-1.0mM)50μL中分别加入等体积的NPDA储备液(10.0mM，1.0M盐酸溶水液)，混合均匀后45℃下孵育20min。衍生化后的样品10000rpm离心5min后，上清液分别以0.22μm膜过滤，然后各取20μL滤液进行HPLC测定。HPLC所使用的仪器为Waters 1525HPLC仪，色谱柱为4.6x 250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为20μL；流速为0.7mL/min；检测波长为280nm；柱温为25℃；流动相为乙腈/水，梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min,80％流动相B；23min,40％流动相B。根据测定结果，以峰面积对丙酮酸浓度作图，制备工作曲线。D-GAP的工作曲线按照完全相同的步骤测定。
2)DXS催化的反应：将2.0mM的D-GAP、2.0mM的丙酮酸，2.0mM的Mg2+、0.5mM的ThPP，25μg的DXS酶加入到150μL的50mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，37℃孵育0.5h。
3)衍生化反应：DXS催化的反应结束后，取反应混合物50μL，加入衍生化试剂NPDA的储备液50μL(NPDA储备液以1.0M盐酸配制为10.0mM溶液)，45℃孵育20min。
4)HPLC检测：衍生化后的样品10000rpm离心5min后，上清液以0.22μm膜过滤，然后取20μL滤液进行HPLC测定，HPLC方法同1)中。根据测定结果，利用工作曲线计算底物丙酮酸或G-GAP的消耗量，进而获得DXS的催化活性(比活力)。
3、DXS稳态动力学参数参数测定：
1)Km 丙酮酸测定：DXS催化的反应体系为：将20.0mM的D-GAP、0.025-2.0mM的丙酮酸，2.0mM的Mg2+、0.5mM的ThPP，2.0μg的DXS酶加入到200μL的50mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，37℃孵育5.0min。反应完成后，衍生化及HPLC测定过程均与1中相同。所得数据以GraphPad Prism处理以计算丙酮酸的米氏常数Km；
2)Km D-GAP测定：DXS催化的反应体系为：将20.0mM的丙酮酸、0.03-3.0mM的D-GAP，2.0mM的Mg2+、0.5mM的ThPP，2.0μg的DXS酶加入到200μL的50mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，37℃孵育5.0min。反应完成后，衍生化及HPLC测定过程均与1中相同。所得数据以GraphPad Prism处理以计算D-GAP的米氏常数Km；
以两种不同衍生化试剂测定的DXS催化活性及稳态动力学参数见表1。
表1以DAN及NPDA分别为衍生化试剂测定的DXS催化活性及稳态动力学参数
a一个单位定义为DXS酶在1分钟内可转化1微摩尔底物丙酮酸或D-GAP。
由于1,2-邻氨基苯(OPDA)及其类似物4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)和2,3-二氨基萘(DAN)的结构中均含有1,2-二氨基苯结构片段且它们与丙酮酸、D-GAP均具有类似的反应活性(丙酮酸在酸性条件下可生成喹喔啉衍生物，D-GAP在同样的条件下可生成磷酸化的喹喔啉衍生物)。因此参考DAN、NPDA这两个实施例的应用结果可以预期，上述1,2-邻氨基苯及其类似物中的任意一种作为衍生化试剂以柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性均可以取得令人满意的结果。

Claims (8)

1.1,2-邻氨基苯(OPDA)及其类似物作为衍生化试剂以柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述类似物包括4-氯-1,2-二氨基苯(CPDA)、4-硝基-1,2-二氨基苯(NPDA)和2,3-二氨基萘(DAN)。
3.一种利用权利要求1中所述的衍生化试剂以柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)催化活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DXS催化反应的反应体系：
将D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)、丙酮酸、硫胺素焦磷酸(ThPP)、二价金属离子及DXS酶加入到缓冲液中，进行孵育；
(2)丙酮酸及D-GAP的衍生化：
步骤(1)催化反应结束后，反应体系中加入所述衍生化试剂，孵育，进行衍生化反应；
(3)反相HPLC检测：
将步骤(2)中得到的样品，经过离心后取上清液，过0.22μM膜，然后进行HPLC检测；
(4)根据HPLC检测结果计算丙酮酸、D-GAP的消耗量，进而得出DXS催化活性及稳态动力学参数。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)的反应体系为：以反应总体积50-200μL计，底物D-GAP及丙酮酸的浓度均为1.0-5.0mM；二价金属阳离子为Mg2+、Mn2+、Co2+或Zn2+，浓度为2.0-10.0mM；ThPP浓度为0.5-2.0mM，酶为微生物源或植物源DXS，用量为0.2-1.0mg/ml；所用缓冲液为40-200mM的Tris-HCl或PBS或柠檬酸或MOPS缓冲液，pH 6.0-8.5；孵育温度为25-40℃，孵育时间为0.5-2h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述衍生化试剂的储备液是以1.0-3.0M盐酸配制为10.0-20.0mM溶液。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作如下：将步骤(1)获得的反应液中加入衍生化试剂50-200μL，孵育温度为40-80℃，孵育时间为0.2-2h。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)的检测体系中，HPLC所使用的仪器为Agilent Technologies 1200HPLC仪或Waters 1525HPLC仪，色谱柱为4.6x250mm C-18低碳反相色谱柱，检测器为二极管阵列检测器；进样量为10-50μL；流速为0.5-2.0mL/min；检测波长为240-400nm；柱温为20-40℃；流动相为甲醇/水、乙腈/水或四氢呋喃/水，采用梯度洗脱模式，洗脱时间为10-30min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
甲醇/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：甲醇；梯度为0min，40％流动相B；17min，80％流动相B；18min，40％流动相B；20min，40％流动相B；
乙腈/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度为0min，40％流动相B；20min,80％流动相B；23min,40％流动相B；
四氢呋喃/水梯度洗脱条件为：流动相A：水，流动相B：四氢呋喃；梯度为0min，35％流动相B；15min，60％流动相B；18min，35％流动相B；20min，35％流动相B。
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