CN109321513A - 一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法，是以毛囊干细胞和毛囊真皮成纤维细胞为组织工程皮肤的种子细胞，并把细胞凝胶混合液滴加在人羊膜支架上，人羊膜支架能有效的阻止胶原凝胶的收缩，且移植时人羊膜和生物体组织有很好的相容性，在移植初期人羊膜支架可以吸取生物一些体营养成分，为毛囊干细胞和毛囊真皮成纤维细胞提供营养，促进毛发生成。本发明以关中奶山羊为实验动物制作急性全层皮肤缺损模型，将构建的组织工程皮肤进行自体移植。移植2个月后，创面恢复良好，并有毛发长出，移植5个月后，创面恢复良好，毛发生长情况良好，移植9月后，创面基本恢复。

Description

一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法
技术领域
本发明涉及一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法，属于生物医学工程用组织工程方法构建人工器官技术领域。
背景技术
几十年来，皮肤组织工程的发展已取得了长足进步，组织工程化皮肤为抢救深度，大面积烧伤病人的生命，提高糖尿病人、老年静脉曲张病人的难愈创面的治愈率做出了重要贡献。但由于组织工程皮肤自身的缺点，这种组织工程皮肤只能是一种临时性皮肤替代物。随着人类社会的进步，伤病员，特别是大面积深度烧伤病人，已不再满足于目前临床上常用的治疗手段所能提供的治疗效果，他们希望修复后的创面不但在外观形态及功能上要与正常皮肤相近，而且还期望修复后的皮肤要有各种皮肤附属器如毛发、皮脂腺、汗腺等，甚至希望皮肤修复后能完好如初，没有任何瘢痕(盛志勇,付小兵.深入开展组织由解剖修复到功能性修复的应用基础研究.中华外科杂志.2002,40(1):7—8.)。因此构建具有真正生理功能的组织工程皮肤，实现“完美皮肤愈合”(Perfect skin regeneration)，已成为皮肤组织工程研究领域的挑战性课题。
当前织工程皮肤存在许多必须克服的缺点，与患者实现“完美修复”的理想相差仍远：(1)目前的组织工程皮肤只具有正常皮肤类似的结构，而不具备生理皮肤的生里功能，主要表现为皮肤附属器(毛囊、汗腺、皮脂腺)的缺乏，严重影响患者生活质量，也限制了其临床应用范围。如Apligraft虽然美国FDA批准应用于临床，但Apligraft只能用于小面积皮肤创面的修复，如皮肤松解大疤症，静脉性溃疡、糖尿病足溃疡的治疗，而不能用于大面积深度烧伤的治疗。组织工程皮肤缺乏附属器，不仅限制其应用范围，而且影响其美容效果，降低患者的生活信心，有的患者甚至难以容入社会生活。因此，如何解决组织工程化皮肤缺少附属器的问题，是今后皮肤组织工程研究的一个方向(Supp DM and BoyceST.Engineered skin substitutes:practices and potentials.Clinics indermatology,2005,23,403-412)。(2)组织工程皮肤的韧性及机械性能同天然皮肤还有较大的差距，弹性差，柔韧性低，表皮易脱落。(3)限制人工复合皮肤难以应用于大面积烧伤治疗的另一个重要因素是人工皮肤血供不足，表皮上皮容易脱落坏死(Auger FA,Berthod F,Moulin V.et al.Tissue-engineered skin substitutes from in vitro constructs toin vivo applications.Biotechnol.Apppl.Biochem.2004 39,263-275)。(4)目前，通过商业化渠道可获得的组织工程复合皮肤，Apligraft的种子细胞来源于新生儿包皮，属同种异体细胞，仍不能避免移植后免疫排斥反应与疾病传播的发生，尤其在艾滋病。在各种性病扩散日见严重的时代背景下，患者对含有异体细胞的人工皮肤的安全性尤见忧虑。
研究者发现毛囊隆突部存在的细胞在不仅维持毛囊自身的周期性生长，而且还参于表皮、皮脂腺的形成。而且有假说认为表皮、毛囊、汗腺起源于一个共同的干细胞群，并将三者同一为表皮-毛-皮脂腺单位。Taylor等认为位于毛囊隆突部的干细胞向上参与表皮和皮脂腺的形成，向下参与毛囊的形成。Fuch等通过转基因鼠分离毛囊干细胞并接种到裸鼠上长出毛发。而且毛囊取材方便，对患者造成的损伤小，以患者自身的毛囊提取细胞还可以减少免疫排斥反应。但目前尚未有以毛囊干细胞和毛囊真皮成纤维细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法，移植后可实现受损皮肤功能性重建，克服传统组织工程皮肤的缺陷。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法，以毛囊干细胞、毛囊真皮成纤维细胞为种子细胞构建具有生理功能的组织工程皮肤。
具体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将牛I型胶原蛋白溶液、DMEM培养基和毛囊真皮成纤维细胞混合均匀，制成细胞凝胶，滴加在人羊膜支架上；
(2)细胞凝胶凝固后，在条件培养液中培养，然后在细胞凝胶表面接种毛囊干细胞，体外培养，直至生成具有生理功能的组织工程皮肤。
毛囊真皮成纤维细胞和毛囊干细胞的分离培养方法为：
①取山羊耳部皮肤标本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，75％酒精消毒2次，然后用D-Hank's液冲洗3～5次，每次5min；
②将步骤①的皮肤标本剪成小条，加入2.4U/mL的Dispase分散酶，4℃消化15h后，拔出毛囊，切取毛囊隆突部，置于0.05％的胰酶中37℃消化1.5h，终止反应，1200r/min离心，收集细胞接种于100μg/mL的IV型胶原包被的培养皿中，25min后收集上层未贴附的角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一皿中培养，加条件培养液，每2d换液一次，收集条件培养液，得到毛囊真皮成纤维细胞；贴附皿底的细胞加无血清条件培养液，每3d换液一次，培养毛囊干细胞。
步骤(1)中的具体方法为：将7体积的4.5mg/mL牛I型胶原蛋白溶液和2体积的5×DMEM培养基混匀后，用1M的NaOH调节pH值到7.2，然后加入1体积毛囊真皮成纤维细胞的条件培养液，混合均匀，制成细胞凝胶，其中条件培养液中毛囊真皮成纤维细胞密度为5×106个/mL，然后取3.6mL细胞凝胶滴加在直径3cm的人羊膜支架上。
步骤(2)中的具体方法为：
①待细胞凝胶凝固后，加入条件培养液，置于CO2培养箱中，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4d，每2d换液一次；
②4d后，细胞凝胶表面接种毛囊干细胞，细胞接种密度为1～5×106个/cm2，用含有40～50μg/mL维生素c的无血清条件培养液培养，每3d换液一次；
③培养13d，可见表皮角质化，继续培养21d后，得到组织工程皮肤。
条件培养液为含有20％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。
无血清条件培养液为DMEM/F12+10％条件培养液+5μg/mL胰岛素+20ng/mL EGF+20ng/mL IGF-1；其中条件培养液为含有胎牛20％(v/v)血清的DMEM培养基。
人羊膜支架的制作方法参照发明名称“真皮等同物的构建方法”(申请号：2011104348212)的发明专利。
本发明有益效果：
本发明首次公开一种用皮肤毛囊干细胞和毛囊真皮成纤维细胞构建组织工程皮肤的成功方法，本发明以毛囊干细胞和毛囊真皮成纤维细胞为组织工程皮肤的种子细胞，并把细胞凝胶混合液滴加在人羊膜支架上，人羊膜支架能有效的阻止胶原凝胶的收缩，且移植时人羊膜和生物体组织有很好的相容性，在移植初期人羊膜可以吸取生物一些体营养成分，为毛囊干细胞和毛囊真皮成纤维细胞提供营养，促进毛发生成。
本发明以关中奶山羊为实验动物制作急性全层皮肤缺损模型，将构建的组织工程皮肤进行自体移植。移植2个月后，创面恢复良好，并有毛发长出，移植5个月后，创面恢复良好，毛发生长情况良好，移植9月后，创面基本恢复。
附图说明
图1是关中奶山羊原代毛囊干细胞克隆，×200。
图2是第二代关中奶山羊毛囊干细胞形成全克隆，×100。
图3是第二代关中奶山羊毛囊干细胞免疫组化染色结果，×200。
图4是第二代关中奶山羊毛囊干细胞在人羊膜支架上生长情况，×100。
图5是本发明体外构建的组织工程皮肤。
图6是实验组动物移植人工皮肤5月后创面情况。
图7是实验组动物组织学检测情况。
图8是对照组动物移植人工皮肤5月后创面情况。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
条件培养液为含有20％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。
无血清条件培养液为含有10％(v/v)条件培养液、5μg/mL胰岛素、20ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)、20ng/mL类胰岛素一号增长因子(IGF-1)的DMEM/F12培养基(简写：DMEM/F12+10％条件培养液+5μg/mL胰岛素+20ng/mL EGF+20ng/mL IGF-1)。
实施例1、毛囊真皮成纤维细胞和毛囊干细胞的分离培养为：
①取山羊耳部皮肤标本0.5×0.5cm2，在净化工作台中用柳叶刀刮去皮肤表面赃物，用75％(v/v)酒精消毒2次，然后用D-Hank's液冲洗3～5次，每次5min。
②将步骤①的皮肤标本用眼科剪剪成小条，加入2.4U/mL的Dispase分散酶，4℃消化15h后，用眼科镊拔出毛囊，在体视显微镜下切取毛囊隆突部，置于质量分数0.05％的胰酶中37℃消化1.5h，终止反应，1200r/min离心，收集细胞接种于100μg/mL的IV型胶原包被的培养皿中，25min后收集上层未贴附的角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一培养皿中培养，加条件培养液，每2d换液一次，收集条件培养液，得到毛囊真皮成纤维细胞；贴附皿底的细胞加无血清条件培养液，每3d换液一次，培养毛囊干细胞，10-15d可以观察到形成毛囊干细胞克隆(图1)。分离获得的单个毛囊干细胞可形成全克隆(图2)，证明该类细胞具有干细胞特性，免疫组化染色结果显示该类细胞表达CK-19，说明其具有毛囊干细胞特性(图3)。
实施例2、组织工程皮肤的构建
①将7体积的4.5mg/mL牛I型胶原蛋白溶液和2体积的5×DMEM培养基混匀后，用1M的NaOH调节pH值到7.2，然后加入1体积毛囊真皮成纤维细胞的条件培养液，混合均匀，制成细胞凝胶，其中条件培养液中毛囊真皮成纤维细胞密度为5×106个/mL，然后取3.6mL细胞凝胶滴加在直径3cm的人羊膜支架上。
②待细胞凝胶凝固后，加入2mL条件培养液，置于CO2培养箱中，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4d，每2d换液一次。
③4d后，细胞凝胶表面接种毛囊干细胞，细胞接种密度为5×106个/cm2，用含有50μg/mL维生素c的无血清条件培养液培养，每3d换液一次。毛囊干细胞在人羊膜支架上正常增殖分化(图4)。
④培养13d，可见表皮角质化，继续培养21d后，得到组织工程皮肤(图5)，即可用于移植。
实施例3、组织工程皮肤的构建
实施例3的构建方法与实施例2基本相同，不同之处在于：步骤③中毛囊干细胞的细胞接种密度为1×106个/cm2，无血清条件培养液中维生素c浓度为40μg/mL。
实施例4、移植与检测
以本发明构建的组织工程皮肤为实验样品，以由单个原代ESCs克隆扩增3-4代所获的干细胞为种子细胞，构建的人工皮肤为对照样品，验证本发明构建的组织工程皮肤的性能。以关中奶山羊为实验动物制作急性全层皮肤缺损模型，将实验组和对照组构建的皮肤自体移植于急性皮肤创伤(3.5cm2，全层皮肤切除)。移植2个月后，实验组创面恢复良好，并有毛发长出，移植5个月后，创面恢复良好，毛发生长情况良好(图6)，组织学检测也证明实验组皮肤有毛囊形成(图7)，毛囊细胞表达CK14阳性，移植9月后，创面基本恢复。对照组移植5个月，创伤形成疤痕，无毛发生长(图8)，且抗紫外线照射能力弱。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法，其特征在于，以毛囊干细胞、毛囊真皮成纤维细胞为种子细胞构建具有生理功能的组织工程皮肤。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将牛I型胶原蛋白溶液、DMEM培养基和毛囊真皮成纤维细胞混合均匀，制成细胞凝胶，滴加在人羊膜支架上；
(2)细胞凝胶凝固后，在条件培养液中培养，然后在细胞凝胶表面接种毛囊干细胞，体外培养，直至生成具有生理功能的组织工程皮肤。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，毛囊真皮成纤维细胞和毛囊干细胞的分离培养方法为：
①取山羊耳部皮肤标本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，用75％酒精消毒2次，然后用D-Hank's液冲洗3～5次，每次5min；
②将步骤①的皮肤标本剪成小条，加入2.4U/mL的Dispase分散酶，4℃消化15h后，拔出毛囊，切取毛囊隆突部，置于0.05％的胰酶中37℃消化1.5h，终止反应，1200r/min离心，收集细胞接种于100μg/mL的IV型胶原包被的培养皿中，25min后收集上层未贴附的角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一皿中培养，加条件培养液，每2d换液一次，收集条件培养液，得到毛囊真皮成纤维细胞；贴附皿底的细胞加无血清条件培养液，每3d换液一次，培养毛囊干细胞。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中的具体方法为：将7体积的4.5mg/mL牛I型胶原蛋白溶液和2体积的5×DMEM培养基混匀后，用1M的NaOH调节pH值到7.2，然后加入1体积毛囊真皮成纤维细胞的条件培养液，混合均匀，制成细胞凝胶，其中条件培养液中毛囊真皮成纤维细胞密度为5×106个/mL，然后取3.6mL细胞凝胶滴加在直径3cm的人羊膜支架上。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中的具体方法为：
①待细胞凝胶凝固后，加入条件培养液，置于CO2培养箱中，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4d，每2d换液一次；
②4d后，细胞凝胶表面接种毛囊干细胞，细胞接种密度为1～5×106个/cm2，用含有40～50μg/mL维生素c的无血清条件培养液培养，每3d换液一次；
③培养13d，可见表皮角质化，继续培养21d后，得到组织工程皮肤。
6.根据权利要求2-5任一项所述的构建方法，其特征在于，条件培养液为含有20％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，无血清条件培养液为DMEM/F12+10％条件培养液+5μg/mL胰岛素+20ng/mL EGF+20ng/mL IGF-1；其中条件培养液为含有胎牛20％(v/v)血清的DMEM培养基。
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