CN109310119A

CN109310119A - 植物甜蛋白的细胞外分泌方法

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Publication number: CN109310119A
Application number: CN201780020439.2A
Authority: CN
Inventors: A·达基帕提; A·V·巴拉甘加哈
Original assignee: Magellan Life Sciences Pvt Ltd
Current assignee: Magellan Life Sciences Pvt Ltd
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2019-02-05
Also published as: EP3407733A1; EP3407733A4; WO2017130222A9; US11613757B2; ES2904642T3; EP3407733B1; US20190153455A1; DK3407733T3; WO2017130222A1; US20230235340A1

Abstract

本发明公开了一种以提高的产率分泌植物甜蛋白的方法。

Description

植物甜蛋白的细胞外分泌方法

技术领域

本发明涉及提高产率和纯度的从大肠杆菌细胞的植物甜蛋白的细胞外分泌的方法。

背景技术

植物甜蛋白是一种高效能的热稳定甜蛋白，最初是从西非攀爬树Pentadiplandrabrazzeana Baillon的果实中分离出来的(Ming和Hellekant，FEBS Lett.355：106-108,1994)。与2％蔗糖水溶液相比，植物甜蛋白比蔗糖甜2500倍，与10％蔗糖相比，植物甜蛋白比蔗糖甜500倍。由于与其他基于蛋白质的天然甜味剂(例如奇异果甜蛋白(thaumatin)或应乐果甜蛋白(monellin))相比，其与蔗糖相近的味道特征、其水溶性、在高温和低pH下的稳定性，植物甜蛋白可方便地用于烘焙配方和被工业食品制造商使用。植物甜蛋白的这种稳定性及其甜味特征使其成为目前可获得的低卡路里高强度甜味剂(例如三氯蔗糖，阿斯巴甜和甜叶菊)的合适替代品。作为膳食蛋白质，糖尿病患者可以安全食用。当与其他甜味剂(如阿斯巴甜和甜叶菊)混合时，植物甜蛋白减少它们的余味并补充它们的风味。

然而，从其天然来源分离植物甜蛋白是昂贵的，因此在商业上不可行。此外，以生产植物甜蛋白而闻名的Pentadiplandra brazzeana(植物甜蛋白在种子周围的果肉的细胞外空间中被发现)在地理上位于西非地区的喀麦隆和加蓬，全球地从其他地区以商业规模分离植物甜蛋白变得不切实际。

鉴于从P.Brazzeana提取植物甜蛋白的方法产生的许多困难，本领域已经提出了几种合成方法来设计合成植物甜蛋白的机制。

在结构上，植物甜蛋白包含54个氨基酸残基，对应于6.5kDa的分子量，并且已经基于N-末端序列的变异进行了分类。I型植物甜蛋白是由54个氨基酸组成的不稳定形式，其具有谷氨酰胺作为第一个氨基酸。这种不稳定的形式可以转化为II型植物甜蛋白形式或主要形式(Major form)，其中N-末端位置的谷氨酰胺被转化为焦谷氨酸盐。在III型植物甜蛋白或次要形式(Minor form)中，在第一个氨基酸位置不存在谷氨酰胺，因此生成了53个氨基酸的氨基酸序列。(Assadi-Porter等，Arch.Biochem.Biophys.376：252-258,2000)。

除了这些天然存在的形式，研究人员已经开发出了植物甜蛋白的变体和多变体，它们在不同的温度和pH范围内具有优异的物理稳定性，并且通过某些位置的氨基酸的取代来使野生型植物甜蛋白突变而具有优异的味道特征。

美国专利No.8592181中的公开内容涉及具有更高甜度的植物甜蛋白变体和多变体，以及制备所述多变体的方法。为了提高重组可溶性植物甜蛋白的生产水平，由美国181的同一发明人提出的相应的研究论文(Kwang-Hoon Kong等,Bull.Korean Chem.Soc.2010，Vol.31,No.12)已经建立了使用来自欧文氏菌(Erwinia carotovora)CE的果胶裂解酶B的pelB前导序列进行植物甜蛋白表达的新策略。其中公开的植物甜蛋白表达的方法仅导致了蛋白质的周质定位。后发酵、下游加工技术涉及对诱导的BL21Star(DE3)细胞进行离心和渗压震扰(osmotic shock)。周质表达和渗透处理以分离蛋白质的主要缺点是其低表达产率、多个离心步骤和渗透处理过程中缓冲液体积的大量增加，使得分离过程繁琐并导致产量损失。

Fariba Assadi-Porter等人(Protein Expr Purif.2008Apr；58(2)：263-8)已尝试提供在大肠杆菌中植物甜蛋白的有效和快速的蛋白质表达和纯化。然而，其中描述的方法涉及与小泛素样修饰蛋白(Small Ubiquitin-like Modifier protein)(SUMO)融合的植物甜蛋白蛋白质的细胞内表达，然后通过SUMO蛋白酶切割。SUMO蛋白质是小蛋白质家族，其与细胞中的其他蛋白质共价连接和分离以改变其功能。然而，SUMO与植物甜蛋白蛋白质的融合不会改变植物甜蛋白向细胞外区域的定位，从而导致使用昂贵且不方便的下游处理来分离和纯化功能性蛋白质。

在Fariba Assadi-Porter等人的研究文章中，(Arch Biochem Biophys.2000,15；376(2)：252-8)在植物甜蛋白和葡萄球菌核酸酶之间具有单一改变基因的溴化氰裂解位点的与葡萄球菌核酸酶蛋白融合的植物甜蛋白已经被表达。该融合蛋白质在大肠杆菌中的不溶性包涵体中被表达，因此需要随后的用溴化氰裂解以分离功能性植物甜蛋白的大量重折叠。

上述公开内容涉及大肠杆菌中植物甜蛋白的周质或细胞内定位，但是在现有技术中没有尝试当在大肠杆菌中表达时获得细胞外植物甜蛋白分泌，以在工业规模植物甜蛋白生产过程中提高表达产量并使下游处理方便和经济。

存在于周质空间中的蛋白质的细胞外释放通常通过几种策略实现，如使用渗漏菌株用于蛋白质表达、细胞膜透化或释放蛋白质的共表达。但是，应用这些技术会产生过高的成本。

鉴于本领域中已知方法的缺点，本发明人的目的是使由植物甜蛋白蛋白质的低表达产量和下游处理所带来的缺点最小化，为了提高表达产量和简化下游处理技术，提供了从大肠杆菌细胞细胞外分泌植物甜蛋白蛋白质的便利方法。

发明内容

在优选的方面，本发明提供了一种具有改善的产量的用于重组植物甜蛋白的细胞外分泌的方法，包括：

(a)将质粒与核苷酸序列连接以获得重组DNA构建体，该核苷酸序列编码与植物甜蛋白偶联的信号前导序列，并通过转化将所述构建体插入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中；

(b)在葡萄糖的存在下，在培养基中培养步骤(a)携带重组构建体的转化细胞，并用选自IPTG或乳糖的诱导剂诱导蛋白质表达，经过范围从4小时至72小时的时间段，以在培养基中获得植物甜蛋白的分泌物，和(c)诱导4至72小时后将培养基与细胞分离，并从澄清的培养基中纯化植物甜蛋白。

因此，在重组载体中连接的核苷酸序列是这样的，它编码与植物甜蛋白融合的信号前导序列。该信号前导序列选自由以下所组成的组：pelB、ompA、Bla、PhoA、PhoS、MalE、LivK、LivJ、MglB、AraF、AmpC、RbsB、MerP、CpdB、Lpp、LamB、OmpC、PhoE、OmpF、TolC、BtuB和LutA信号序列。

另一方面，本发明提供了一种重组植物甜蛋白的细胞外分泌的方法，其包括(a)将pelB-植物甜蛋白核苷酸序列插入pET载体中，其中所述pelB-植物甜蛋白序列通过使用选自由Seq Id No.3、Seq Id No.4表示的序列的引物扩增；(b)连接pET载体中的pelB-植物甜蛋白以获得重组构建体，并通过转化将所述构建体插入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中；(c)在葡萄糖的存在下在培养基中培养步骤(b)携带重组构建体的转化细胞，并用选自IPTG或乳糖的诱导剂诱导蛋白质表达，(d)在4至72小时诱导之后将培养基与细胞分离并从澄清的培养基中纯化植物甜蛋白。

在另一个方面，在培养基中细胞外地表达的植物甜蛋白选自由以下所组成的组：天然存在的野生型功能性III型植物甜蛋白，包含从天冬氨酸到丙氨酸D28A的III型植物甜蛋白的第28位的取代的变体或III型的多变体。

在一个方面，本发明提供了一种提高产率的植物甜蛋白的细胞外分泌的方法，其中植物甜蛋白的产率范围为0.5g/l至5g/l。本方法在发酵罐规模或在实验室阶段在摇瓶系统中进行。

附图详细说明

图1描绘了载体构建体，其包含lac I启动子，Lac I基因，lac操纵子，T7启动子，T7终止子和pelB-植物甜蛋白编码核苷酸序列。

图2描绘了pelB-植物甜蛋白重组构建体的PCR扩增，其中泳道1显示对应于pelB-植物甜蛋白的扩增产物，泳道2显示100bp DNA梯。

图3描绘了IPTG诱导的植物甜蛋白的全细胞表达，由6.5千道尔顿植物甜蛋白蛋白质描绘。M代表低重量分子量标记物，泳道1：未诱导的全细胞提取物，泳道2：用0.25mM IPTG诱导24小时后的全细胞提取物，泳道3：用0.25mM IPTG诱导48小时后的全细胞提取物，泳道4：用0.25mM IPTG诱导72小时后的全细胞提取物，泳道5：用0.50mM IPTG诱导24小时后的全细胞提取物，泳道6：用0.50mM IPTG诱导48小时后的全细胞提取物，泳道图7：用0.50mMIPTG诱导72小时后的全细胞提取物。

图4描绘了在LB培养基中IPTG诱导的植物甜蛋白的细胞外分泌。M：低重量分子量标记物。泳道1：未诱导细胞的无细胞上清液，泳道2：用0.25mM IPTG诱导24小时后的无细胞上清液，泳道3：用0.25mM IPTG诱导48小时后的无细胞上清液，泳道4：用0.25mM IPTG诱导72小时后的无细胞上清液，泳道5：用0.50mM IPTG诱导24小时后的无细胞上清液，泳道6：用0.50mM IPTG诱导48小时后的无细胞上清液，和泳道7：用0.50mM IPTG诱导72小时后的无细胞上清液；

图5描绘了在LB培养基中乳糖诱导的植物甜蛋白的细胞外分泌，M代表低重量分子量标记物，泳道1：未诱导细胞的无细胞上清液，泳道2：用2.5mM乳糖诱导48小时后的无细胞上清液，泳道3：用2.5mM乳糖诱导72小时后的无细胞上清液，泳道4：用5.0mM乳糖诱导48小时后的无细胞上清液，和泳道5：用5.0mM乳糖诱导72小时后的无细胞上清液；

图6描绘了在TB培养基中乳糖诱导的植物甜蛋白的细胞外分泌，M代表低重量分子量标记物，泳道1：未诱导细胞的无细胞上清液，泳道2：用5.0mM乳糖诱导2小时后的无细胞上清液，泳道3：用5.0mM乳糖诱导18小时后的无细胞上清液，泳道4：用5.0mM乳糖诱导24小时后的无细胞上清液，和泳道5：用5.0mM乳糖诱导36小时后的无细胞上清液，泳道6：用5.0mM乳糖诱导48小时后的无细胞上清液；

图7描绘了在TB培养基中乳糖诱导的pelB-植物甜蛋白(A28D)的细胞外分泌，M代表低重量分子量标记物，泳道1：未诱导细胞的无细胞上清液，泳道2：用5.0mM乳糖诱导4小时后的无细胞上清液，泳道3：用5.0mM乳糖诱导18小时后的无细胞上清液，泳道4：用5.0mM乳糖诱导24小时后的无细胞上清液，和泳道5：用5.0mM乳糖诱导36小时后的无细胞上清液，泳道6：用5.0mM乳糖诱导48小时后的无细胞上清液。成熟的植物甜蛋白(A28D)的位置用箭头表示。

图8描绘了在TB培养基中乳糖诱导的ompA-植物甜蛋白(A28D)的细胞外分泌，M：低重量分子量标记物，泳道1：未诱导细胞的无细胞上清液，泳道2：用5.0mM乳糖诱导4小时后的无细胞上清液，泳道3：用5.0mM乳糖诱导18小时后的无细胞上清液，泳道4：用5.0mM乳糖诱导24小时后的无细胞上清液，和泳道5：用5.0mM乳糖诱导36小时后的无细胞上清液，泳道6：用5.0mM乳糖诱导48小时后的无细胞上清液。

图9描绘了在发酵罐中乳糖诱导的pelB-植物甜蛋白(A28D)的细胞外分泌，M表示低重量分子量标记物，泳道1：未诱导细胞的无细胞上清液，泳道2：用5.0mM乳糖诱导2小时后的无细胞上清液，泳道3：用5.0mM乳糖诱导12小时后的无细胞上清液，泳道4：用5.0mM乳糖诱导18小时后的无细胞上清液，和泳道5：用5.0mM乳糖诱导24小时后的无细胞上清液。成熟的植物甜蛋白(A28D)的位置用箭头表示。

图10描绘了在发酵罐中表达后从细胞培养上清液中纯化植物甜蛋白(A28D)。泳道1：硫酸铵沉淀后的澄清样品；泳道2：最终纯化的样品。

图11描绘了通过本方法合成的分泌的植物甜蛋白的热稳定性，其在高温下进行处理。M描绘了低重量分子量标记物。泳道1：来自72小时乳糖诱导的培养物的无细胞上清液的未处理对照样品。泳道2：与泳道1相同，不同之处在于将无细胞上清液在80℃加热60分钟，在17,500g离心并分析可溶的上清液。用箭头表示在泳道1和2中植物甜蛋白的存在。

具体实施方式

现在将结合某些优选和任选的实施方案详细描述本发明，从而可以更充分地理解和领会本发明的各个方面。

在优选的实施方案中，本发明提供了一种具有提高的产量的用于重组植物甜蛋白的细胞外分泌的方法，包括：

(a)在重组载体中连接核苷酸序列以获得重组DNA构建体，该核苷酸序列编码与植物甜蛋白偶联的信号前导序列，并通过转化将所述构建体插入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中；

(b)在葡萄糖的存在下，在培养基中培养步骤(a)携带重组构建体的转化细胞，并用选自IPTG或乳糖的诱导剂诱导蛋白质表达，经过范围从4小时至72小时的时间段，以在培养基中获得植物甜蛋白的分泌物，和

(c)将培养基与细胞分离，并从澄清的培养基中纯化植物甜蛋白。

因此，编码与植物甜蛋白偶联的信号前导序列的核苷酸序列用引物扩增。将信号序列-植物甜蛋白扩增的基因连接到表达载体中，以获得重组载体构建体，其在BL21(DE3)大肠杆菌细胞中转化。携带重组构建体的转化的大肠杆菌细胞在葡萄糖的存在下在培养基中培养，并用选自IPTG或乳糖的诱导剂诱导蛋白质表达4小时至72小时，以获得植物甜蛋白的细胞外分泌物。诱导后将细胞与培养基分离，并将也称为细胞外部分的培养基在高达90℃的温度下加热，得到纯度>90％且产量增加的植物甜蛋白。作为加热的结果，存在于无细胞上清液中的大多数内源性大肠杆菌蛋白质沉淀，在溶液中留下>90％纯度的植物甜蛋白。

在实施方案中，与植物甜蛋白偶联的信号前导序列选自由以下所组成的组：pelB、ompA、BLA、PhoA、PhoS、MalE、LivK、LivJ、MglB、AraF、AmpC、RbsB、MerP、CpdB、Lpp、LamB、OmpC、PhoE、OmpF、TolC、BtuB和LutA信号序列。

在另一个实施方案中，本发明通过在培养基中加入25mM至5mM的乳糖，提供了在大肠杆菌细胞中信号前导-植物甜蛋白表达的诱导。

在又另一个实施方案中，本发明通过在培养基中加入0.25mM至0.5mM的IPTG，提供了在大肠杆菌细胞中信号前导-植物甜蛋白表达的诱导。

因此，图4中描绘了在不同浓度的IPTG(即0.25mM和0.5mM)，以范围从24小时至72小时的持续时间的植物甜蛋白的细胞外分泌。在图5和图6中描绘了在不同浓度的乳糖(即2.5mM和5mM)，以范围从2小时至72小时的持续时间的植物甜蛋白的细胞外分泌。在培养基中添加诱导剂后，细胞的生长在25℃至37℃之间的温度范围内进行并使细胞经受振荡条件。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有改善的产量的用于重组植物甜蛋白的细胞外合成的方法，包括：

a)将pET载体与核苷酸序列连接以获得重组DNA构建体，该核苷酸序列编码与植物甜蛋白偶联的pelB信号前导序列，并通过转化将所述构建体插入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中；

b)在葡萄糖的存在下，在培养基中培养步骤(a)携带重组构建体的转化细胞，并用选自IPTG或乳糖的诱导剂诱导蛋白质表达，经过范围从2小时至72小时的时间段，和

c)诱导后4至72小时后将培养基与细胞分离，并从澄清的培养基中纯化植物甜蛋白。

因此，与pelB信号前导序列偶联的重组植物甜蛋白的细胞外合成方法包括(a)将pelB-植物甜蛋白编码序列插入载体中，其中通过使用选自由Seq Id No.3和Seq Id No.4表示的序列的引物扩增所述编码序列；(b)在pET载体中连接pelB-植物甜蛋白编码序列以获得重组构建体，并通过转化将所述构建体插入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中；(c)在葡萄糖的存在下，在培养基中培养步骤(b)携带重组构建体的转化细胞，并用选自IPTG或乳糖的诱导剂诱导蛋白质表达，(d)诱导后将培养基与细胞分离，并从澄清的培养基纯化植物甜蛋白。

因此，在本发明的图1中描述了用于携带pelB-植物甜蛋白核苷酸序列的pET重组载体。

与植物甜蛋白偶联的pelB信号前导序列的分子量为8.5kD。然而，在切割信号肽后，成熟植物甜蛋白的分子量为6.3kD。对应于成熟植物甜蛋白表达的主要条带在图4中用箭头表示。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种具有改善的产量的用于重组植物甜蛋白的细胞外分泌的方法，包括：

a)将pET载体与核苷酸序列连接以获得重组DNA构建体，该核苷酸序列编码与植物甜蛋白偶联的ompA信号前导序列，并通过转化将所述构建体插入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中；

c)诱导后将培养基与细胞分离，并从澄清的培养基中纯化植物甜蛋白。

因此，与ompA信号前导序列偶联的重组植物甜蛋白的细胞外合成方法包括(a)将ompA植物甜蛋白核苷酸编码序列插入载体中，其中通过使用选自由Seq Id No.4和Seq IdNo.9表示的序列的引物扩增所述编码序列；(b)连接pET载体中的ompA-植物甜蛋白编码序列以获得重组构建体，并通过转化将所述构建体插入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中；(c)在葡萄糖的存在下，在培养基中培养步骤(b)携带重组构建体的转化细胞，并用选自IPTG或乳糖的诱导剂诱导蛋白质表达，以在培养基中获得植物甜蛋白的分泌物，和

(d)诱导后4-72小时后将培养基与细胞分离，并从澄清的培养基中纯化植物甜蛋白。

在又另一个优选的实施方案中，本发明提供的在培养基中表达的植物甜蛋白选自野生型功能性III型植物甜蛋白、从天冬氨酸到丙氨酸D28A的III型植物甜蛋白的第28位上包含取代的III型形式的变体或多变体。

因此，本发明提供了由Seq Id No.8表示的野生型功能性III型植物甜蛋白的细胞外生产，其由Seq Id No.7编码。通过后转译过程切割代表pelB信号序列的Seq Id No.8的后合成氨基酸1至22，以产生成熟的野生型功能性III型植物甜蛋白蛋白质。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了提高的产率的植物甜蛋白的细胞外合成的方法，其中植物甜蛋白的产率在0.5g/l至5g/l之间。

因此，用于植物甜蛋白的细胞外合成的本方法在1升或10升规模的发酵罐中进行。

发现合成的植物甜蛋白在4℃至90℃的温度范围内是稳定的。

包括优选实施方案的以下实施例将用于说明本发明的实践，应理解，所示的细节是作为实例并且是为了说明性地讨论本发明的优选实施方案。

实施例

表达宿主的来源：大肠杆菌BL21(DE3)细胞是从印度加尔各答的BioBharati LifeSciences商购获得的。

表达载体的来源：pET-28a载体是从Novagen商购获得的。

实施例1：密码子优化和基因合成：

从登记源P56552(Ming D等，FEBS Lett.355：106-108(1994))中检索植物甜蛋白的III型形式的氨基酸序列。将该氨基酸序列反转译为对大肠杆菌进行密码子优化的核苷酸序列。密码子优化的基因还包括天冬氨酸28至丙氨酸突变。先前显示该变体与野生型III型植物甜蛋白相比表现出更好的甜味特征(Assadi-Porter FM等，JL.；Arch BiochemBiophys.2000Apr 15；376(2)：259-65)。

密码子优化的基因在N-末端与编码pelB前导序列的序列融合，并在C-末端与三个串联终止密码子融合。

将pelB-植物甜蛋白的最终密码子优化的核苷酸序列显示在SeqID 1中以及相应的氨基酸转译显示在SeqID 2中。

通过Genscript(新泽西州，USA)合成pelB-植物甜蛋白基因，并将其克隆到pUC57克隆载体中以产生质粒最终PELBRAZ。

实施例2：pET-pelB-植物甜蛋白的构建

在下表1中提供PCR反应设置：

表1

表2

在1.6％(w/v)琼脂糖凝胶上分析PCR扩增反应。从凝胶上切下对应于pelB-植物甜蛋白的大约250bp PCR扩增产物(图2)，并使用市售试剂盒纯化。将纯化的产物用NdeI和BamHI在37℃消化4小时，并使用PCR旋转柱试剂盒纯化。将其与预先用NdeI和BamHI消化并且凝胶纯化的pET-28a载体连接。将连接混合物转化到DH5α感受态细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上铺板并在37℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50ug/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基(broth)中，并在轨道振动筛中在37℃和210rpm下生长16小时。从培养物中分离质粒DNA并通过DNA测序分析。鉴定含有所期望的pelB-植物甜蛋白插入物的质粒克隆并标记为pET-pelB-植物甜蛋白，以及用于蛋白质表达研究。

实施例3：pET-pelB-植物甜蛋白(A28D)的构建

为了产生野生型III型植物甜蛋白，将pelB-植物甜蛋白的氨基酸残基50号从丙氨酸突变为天冬氨酸，并称为pelB-植物甜蛋白(A28D)。

第一次PCR反应如下设置：最终PELBRAZ质粒、引物PelBLun-FNcoNde(Seq IdNo.3)、引物BRAZ-A28DRSOE(Seq ld No.5)、Pfu-X反应缓冲液、dNTP混合物、Pfu-X聚合酶以及无菌水用于使最终的PCR反应溶液体积为50μL。表3中提供了所述组分的具体浓度。

Seq Id No.3：

5’-GCGCGCCCATGGCATATGAAATACCTGCTGCCGACCGC-3’

Seq Id No.5：

5’-CACCGCTACGCGCATGTTTATCCAGTTTACAGTCGTAGTTACATTG GTTCGC-3’

表3：用于第一反应的PCR溶液

组分	浓度
		最终PELBRAZ质粒	50ng
PelBLun-FNcoNde(Seq Id No.3)	10皮摩尔
		Braz-A28DRSOE(Seq Id No.5)	10皮摩尔
Pfu-X反应缓冲液	5μL
		dNTP混合物	1μM
Pfu-X聚合酶	0.5μL(1单位)
		无菌水	使最终体积达到50μL

表4：反应条件

在1.6％(w/v)琼脂糖凝胶上分析PCR扩增反应。从凝胶上切下约170bp PCR扩增产物，并使用市售的凝胶提取试剂盒纯化。将纯化的片段标记为片段1。

第二PCR反应如下设置：最终PELBRAZ质粒、引物BRAZ-A28DFSOE(Seq Id No.6)、引物Braz-Rbam(Seq Id No.4)、Pfu-X反应缓冲液、dNTP混合物、Pfu-X聚合酶以及无菌水用于使第二反应溶液最终的体积为50μL。

Seq Id No.6：5’-GATAAACATGCGCGTAGCGGTG-3’

Seq Id No.4：

5’-GCGCGCGGATCCTCATTATTAATATTCACAGTAGTCACAGATACATTGCAG-3’

表5：用于第二反应的PCR溶液

组分	浓度
		最终PELBRAZ质粒	50ng
BRAZ-A28DFSOE(Seq Id No.6)	10皮摩尔
		Braz-Rbam(Seq Id No.4)	10皮摩尔
Pfu-X反应缓冲液	5μL
		dNTP混合物	1μM
Pfu-X聚合酶	0.5μL(1单位)
		无菌水	使最终体积达到50μL

通过使用表4中指定的反应条件和PCR参数进行PCR扩增。在1.6％(w/v)琼脂糖凝胶上分析PCR扩增反应。从琼脂糖凝胶上切下80个碱基对的PCR扩增产物，使用市售的凝胶提取试剂盒纯化。将最终纯化的片段标记为片段2。

第三PCR反应包括通过重叠延伸PCR反应进行剪接，所述反应设置包括片段1、片段2、引物PelBL un-FNcoNde(Seq Id No.3)、引物Braz-Rbam(Seq Id No.4)、Pfu-X反应缓冲液、dNTP混合物、Pfu-X聚合酶以及无菌水用于使最终体积达到50μL。

表6：用于第三反应的PCR溶液

组分	浓度
		片段1	5μL
片段2	5μL
		引物PelBL un-FNcoNde(Seq Id No.3)	10皮摩尔
引物Braz-Rbam(Seq Id No.4)	10皮摩尔
		Pfu-X反应缓冲液	5μL
dNTP混合物	1μM
		Pfu-X聚合酶	0.5μL(1单位)
无菌水	使最终体积达到50μL

通过使用表4中指定的反应条件和PCR参数进行PCR扩增。

在1.6％(w/v)琼脂糖凝胶上分析PCR扩增反应。从凝胶上切下对应于pelB-植物甜蛋白(A28D)的大约250bp PCR扩增产物，并使用市售试剂盒纯化。将纯化的产物用NdeI和BamHI在37℃消化4小时，并使用PCR旋转柱试剂盒纯化。将其与预先用NdeI和BamHI消化的pET-28a载体连接并凝胶纯化。将连接混合物转化到DH5α感受态细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上铺板并在37℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50μg/mL卡那霉素的5mLLB液体培养基中并在轨道振动筛中在37℃和210rpm下生长16小时。从培养物中分离质粒DNA并通过DNA测序进行分析。鉴定含有所期望的pelB-植物甜蛋白(A28D)插入物的质粒克隆并标记为pET-pelB-植物甜蛋白(A28D)并用于蛋白质表达研究。

pelB-植物甜蛋白(A28D)的最终核苷酸序列显示在Seq Id No.7中以及Seq IdNo.8中的相应的氨基酸转译。

实施例4：pET-ompA-植物甜蛋白(A28D)的构建

使用以下引物PCR扩增ompA-植物甜蛋白(A28D)核苷酸序列：PCR反应如下设置：pET-pelB-植物甜蛋白(A28D)质粒、引物ompANde、引物Braz-Rbam、Pfu-X反应缓冲液、dNTP混合物、Pfu-X聚合酶，以及无菌水使最终体积达到50μL。

ompANde(Seq Id No.9)：

5’GCGCGCCCATGGCAATGAAAAAAACGGCAATTGCGATAGCGGTTGCGCTAGCTGGTTTTGCCACGGTGGCGCAGGCTGACAAATGTAAAAAGG-3’

Braz-Rbam(Seq Id No.4)：

5’GCGCGCGGATCCTCATTATTAATATTCACAGTAGTCACAGATACATTGCAG-3’

PCR反应如下设置：pET-pelB-植物甜蛋白(A28D)质粒、引物ompANde、引物Braz-Rbam、Pfu-X反应缓冲液、dNTP混合物、Pfu-X聚合酶，以及无菌水使最终体积达到50μL。

表5：PCR溶液

通过使用表2中指定的反应条件和PCR参数进行PCR扩增。

在1.6％(w/v)琼脂糖凝胶上分析PCR扩增反应。从凝胶上切下对应于ompA-植物甜蛋白(A28D)的约250bp PCR扩增产物，并使用市售的凝胶提取试剂盒纯化。将纯化的产物用NdeI和BamHI在37℃消化4小时，并使用PCR旋转柱试剂盒纯化。将其与预先用NdeI和BamHI消化的pET-28a载体连接并凝胶纯化。将连接混合物转化到DH5α感受态细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上铺板，并在37℃下培养过夜。从平板挑取单菌落到含有50ug/mL卡那霉素的5mL LB中并在轨道振动筛中在37℃和210rpm下生长16小时。从培养物中分离质粒DNA并进行DNA测序。鉴定含有所期望的ompA-BRAZ插入物的质粒克隆并标记为pET-ompA-植物甜蛋白(A28D)并用于蛋白质表达研究。

ompA-植物甜蛋白的最终核苷酸序列显示在Seq Id No.10中，以及相应的蛋白质表达在Seq Id No.11中。

实施例5：蛋白质表达

(i)在LB培养基中利用IPTG的pelB-植物甜蛋白的表达

将pET-pelB-植物甜蛋白质粒转化到BL21(DE3)细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上铺板并在30℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50μg/mL卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的5mL LB中，并在30℃和180rpm下生长16小时。将培养物稀释至两个250mL三角瓶(baffled flask)中，三角瓶中包含补充有50μg/mL卡那霉素、0.1％葡萄糖的25mL LB，并在30℃和210rpm下继续生长。当培养物的光密度(OD600)达到0.4时，通过加入IPTG至最终浓度为0.25mM和0.5mM来诱导蛋白质表达，并在30℃和210rpm下继续生长。在诱导24、48和72小时后通过旋转向下(spinning down)100μL培养物并小心地将上清液与细胞沉淀分离来收获样品。将细胞沉淀保存在-20℃，以及在4℃通过SDS-PAG E进一步分析上清液(见图3和4)。

(ii)在LB培养基中利用乳糖的pelB-植物甜蛋白的表达：

将pET-pelB-植物甜蛋白质粒转化到BL21(DE3)细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上铺板，并在30℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50μg/mL卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的5mL LB中，并在30℃和180rpm下生长16小时。将培养物稀释至两个250mL三角瓶中，三角瓶包含补充有50ug/mL卡那霉素的25mL LB，并在30℃和210rpm下继续生长。当培养物的光密度(OD600)达到0.4时，通过添加乳糖至最终浓度为2.5mM和5mM来诱导蛋白质表达，并且在30℃和210rpm下继续生长。在诱导24、48和72小时后，通过旋转向下100μL培养物并小心地将上清液与细胞沉淀分离来收获样品。将细胞沉淀保存在-20℃，以及在4℃通过SDS-PAGE进一步分析上清液(参见图5)。

(iii)在TB培养基中利用乳糖的pelB-植物甜蛋白的表达：

将pET-pelB-植物甜蛋白质粒转化到BL21(DE3)细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上铺板，并在30℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50ug/mL卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的5mL LB中，并在30℃和180rpm下生长16小时。将培养物稀释至三角瓶中，三角瓶包含补充有50μg/mL卡那霉素、0.1％(w/v)葡萄糖的25mL TB，并在30℃和210rpm下继续生长。当培养物的光密度(OD600)达到9.0时，通过添加乳糖至最终浓度为5mM来诱导蛋白质表达，并且在30℃和210rpm下继续生长。在诱导4、18、24、48和72小时后，通过旋转向下100μL培养物并小心地将上清液与细胞沉淀分离来收获样品。将细胞沉淀保存在-20℃，以及在4℃通过SDS-PAGE进一步分析上清液(参见图6)。

(iv)在TB培养基中利用乳糖的pelB-植物甜蛋白(A28D)的表达：

将pET-pelB-植物甜蛋白(A28D)质粒转化到BL21(DE3)细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上铺板，并在30℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50ug/mL卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的5mL LB中，并在30℃和180rpm下生长16小时。将培养物稀释至三角瓶中，三角瓶包含补充有50μg/mL卡那霉素、0.1％(w/v)葡萄糖的25mL TB，并在30℃和210rpm下继续生长。当培养物的光密度(OD600)达到9.0时，通过加入乳糖至最终浓度为5mM来诱导蛋白质表达，并且在30℃和210rpm下继续生长。在诱导4、18、24、48和72小时后通过旋转向下100μL培养物并小心地将上清液与细胞沉淀分离来收获样品。将细胞沉淀保存在-20℃，在4℃通过SDS-PAGE进一步分析上清液(参见图7)。

(v)在TB培养基中用乳糖的ompA-植物甜蛋白(A28D)的表达：

将pET-ompA-植物甜蛋白(A28D)质粒转化到BL21(DE3)细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上铺板，并在30℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50μg/mL卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的5mL LB中，并在30℃和180rpm下生长16小时。将培养物稀释至三角瓶中，三角瓶包含补充有50μg/mL卡那霉素、0.1％(w/v)葡萄糖的25mL TB，并在30℃和210rpm下继续生长。当培养物的光密度(OD600)达到9.0时，通过加入乳糖至最终浓度为5mM来诱导蛋白质表达，并且在30℃和210rpm下继续生长。在诱导4、18、24、48和72小时后通过旋转向下100μL培养物并小心地将上清液与细胞沉淀分离来收获样品。将细胞沉淀保存在-20℃，在4℃通过SDS-PAGE进一步分析上清液(参见图8)。

(vi)通过补料分批培养在发酵罐中pelB-植物甜蛋白(A28D)的表达

通过补料分批培养在5升发酵罐中进行基于发酵罐的pelB-植物甜蛋白(A28D)的表达。将pET-pelB-植物甜蛋白(A28D)质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上铺板，并在30℃培育过夜。从平板挑取单菌落到含有50μg/mL卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的5mL LB中，并在30℃和180rpm下生长16小时。将1.5mL过夜培养物的等分试样稀释至三角瓶中，三角瓶包含补充有50μg/mL卡那霉素、0.1％(w/v)葡萄糖的150mL LB，并在30℃和210rpm下继续生长12小时。用100ml该培养物接种发酵罐中的4.2L无菌TB培养基，并补充0.1％(w/v)葡萄糖和50μg/mL卡那霉素。在发酵过程中，将温度和pH分别保持在30℃和7.0。通过使用空气或纯氧将溶解氧水平保持在30-40％，并将速度保持在600rpm。在光密度(OD600)达到10后，加入最终浓度为5mM的乳糖以诱导pelB-植物甜蛋白(A28D)的表达。在诱导4、12、18和24小时后，通过旋转向下5mL培养物并小心地分离上清液与细胞沉淀来收获培养物样品。将细胞沉淀保存在-20℃，在4℃通过SDS-PAGE进一步分析上清液(参见图9)。

(vii)植物甜蛋白(A28D)的纯化

将来自发酵罐的培养物在5000g下旋转，将澄清的无细胞上清液转移到清洁的容器中。向其中，在温和搅拌下缓慢加入粉末状1.2kg硫酸铵。将混合物在室温下温和搅拌培育1小时，然后在5000g下旋转30分钟。弃去旋转后得到的上清液，将含有沉淀的植物甜蛋白和其他蛋白质的沉淀物溶解在200mL去离子水中。将该溶液加热至90℃保持1小时，然后以5000g旋转30分钟。小心地倒出上清液并转移到清洁的容器中，发现植物甜蛋白(A28D)构成该上清液中总蛋白质的主要部分。将上清液以3000g通过10kDa MW截止离心浓缩器(cut-off centrifugal concentrator)。大多数植物甜蛋白通过过滤膜并被收集在流过部分中，而剩余的较高分子量的蛋白质不通过膜并且作为保留部分保留在浓缩器中。将流过部分转移到2kDa MW截止离心浓缩器，并通过反复浓缩和用去离子水稀释将缓冲液交换到水中。这一直持续到浓缩器中保留部分的颜色为无色并且流过部分没有任何咸味。在此期间，发现植物甜蛋白被膜完全保留在保留部分中，而低分子量分子穿过进入流过部分(参见图10)。

将含有植物甜蛋白的保留部分收获到清洁容器中，并在4℃下保存用于进一步分析。样品的蛋白质定量给出的最终产量为每升培养物4.4克植物甜蛋白。通过SDS-PAGE分析，图10的泳道2中的植物甜蛋白的纯度大于95％。

(viii)植物甜蛋白的感官分析

将一部分纯化的植物甜蛋白(A28D)冻干，并在去离子水中重新溶解为1.0mg/mL。由此，制备具有以下浓度的植物甜蛋白(A28D)溶液：0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0μg/mL。使用1％(w/v)蔗糖溶液(人类可感觉到的最低蔗糖浓度)作为参考。品尝组由正常健康和正常味觉的15名女性和15名男性组成。将200微升样品施加于舌头的前部区域。每次测试后，用自来水冲洗口腔。品尝者从较低浓度样品取样至较高浓度。每个品尝者都选择了第一个可以感觉到甜味的样品。基于重量，相对于蔗糖报告了甜度效能。发现纯化的植物甜蛋白(A28D)比蔗糖甜1660倍(基于重量)。

表6：纯化的植物甜蛋白的感官分析

(ix)SDS-PAGE分析

通过SDS-PAGE在15％Tris-甘氨酸凝胶上分析蛋白质表达。为了分析在细胞培养基中的蛋白质，将17μL的无细胞上清液(对应于0.07％的总培养物体积)与17μL的2X还原性样品缓冲液混合，在PCR仪中加热5分钟，短暂旋转并且装入凝胶中。将凝胶在125V的恒定电压下运行，直至染料前端离开凝胶。将凝胶在Milli-Q水中洗涤1小时，并用考马斯染色剂染色。为了分析全细胞中的蛋白质，将冷冻的细胞沉淀物解冻，重悬于50μL的Milli-Q水中。将17μL重悬的细胞与17μL的2X还原性样品缓冲液混合，在PCR仪中加热5分钟，短暂旋转并装入凝胶中。将凝胶在125V的恒定电压下运行直至染料前端离开它。将凝胶在Milli-Q水中洗涤1小时并用考马斯染色剂染色。

(x)热稳定性和蛋白质估计

将来自(i)的无细胞上清液在水浴中加热至90℃保持1小时，并在17,500g旋转30分钟。通过SDS-PAGE分析上清液。使用BCA测定试剂盒进行蛋白质定量。作为加热的结果，存在于无细胞上清液中的大多数内源大肠杆菌蛋白质沉淀，在溶液中留下>90％纯度的植物甜蛋白。来自加热和旋转的样品的上清液的蛋白质估计证明植物甜蛋白的产量为0.56g/L(图11)。

(xi)N-T末端测序

在SDS-PAGE上分离蛋白质并转移到0.22um孔径的PVDF膜上。将膜用考马斯蓝染色直至出现蛋白质条带。将膜转移至Milli-Q水中。用干净的手术刀切下对应于植物甜蛋白的条带，并进行前五个氨基酸的N-末端测序。来自N末端测序的结果与III型植物甜蛋白的预期序列匹配。

序列表

<110> 麦哲伦生命科学公司（MAGELLAN LIFE SCIENCES）

<120> 植物甜蛋白的细胞外分泌方法

<130> P1881335P

<140> PCT/IN2017/050039

<141> 2017-01-27

<150> 201641002922

<151> 2016-01-27

<160> 11

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 234

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Nucleotide sequence encoding pel B and Brazzein

<400> 1

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccgaca aatgtaaaaa ggtgtatgaa aactatccgg tctcaaaatg tcaactggcg 120

aaccaatgta actacgactg taaactggcg aaacatgcgc gtagcggtga atgcttctac 180

gatgaaaaac gcaatctgca atgtatctgt gactactgtg aatattaata atga 234

<210> 2

<211> 75

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of pel B conjugated to Brazzein

<400> 2

10 20 30 40 50 60

MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MADKCKKVYE NYPVSKCQLA NQCNYDCKLA KHARSGECFY

70

DEKRNLQCIC DYCEY

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PelBLun-FNcoNde - primer

<400> 3

gcgcgcccat ggcatatgaa atacctgctg ccgaccgc 38

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Braz-Rbam-primer

<400> 4

gcgcgcggat cctcattatt aatattcaca gtagtcacag atacattgca g 51

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> BRAZ-A28DRSOE-primer

<400> 5

caccgctacg cgcatgttta tccagtttac agtcgtagtt acattggttc gc 52

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> BRAZ-A28DFSOE - primer

<400> 6

gataaacatg cgcgtagcgg tg 22

<210> 7

<211> 234

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> nucleotide Sequence encoding pelB conjugated to Brazzein(A28D)

<400> 7

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccgaca aatgtaaaaa ggtgtatgaa aactatccgg tctcaaaatg tcaactggcg 120

aaccaatgta actacgactg taaactggat aaacatgcgc gtagcggtga atgcttctac 180

gatgaaaaac gcaatctgca atgtatctgt gactactgtg aatattaata atga 234

<210> 8

<211> 75

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino Acid Sequence of pelB-Brazzein(A28D)

<400> 8

10 20 30 40 50 60

MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MADKCKKVYE NYPVSKCQLA NQCNYDCKLD KHARSGECFY

70

DEKRNLQCIC DYCEY

<210> 9

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> ompANde - primer

<400> 9

gcgcgcccat ggcaatgaaa aaaacggcaa ttgcgatagc ggttgcgcta gctggttttg 60

ccacggtggc gcaggctgac aaatgtaaaa agg 93

<210> 10

<211> 231

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> nucleotide Sequence encoding ompA conjugated to Brazzein(A28D)

<400> 10

atgaaaaaaa cggcaattgc gatagcggtt gcgctagctg gttttgccac ggtggcgcag 60

gctgacaaat gtaaaaaggt gtatgaaaac tatccggtct caaaatgtca actggcgaac 120

caatgtaact acgactgtaa actggataaa catgcgcgta gcggtgaatg cttctacgat 180

gaaaaacgca atctgcaatg tatctgtgac tactgtgaat attaataatg a 231

<210> 11

<211> 74

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Amino Acid Sequence of ompA-Brazzein(A28D)

<400> 10

10 20 30 40 50 60

MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ ADKCKKVYEN YPVSKCQLAN QCNYDCKLDK HARSGECFYD

70

EKRNLQCICD YCEY

Claims

1.一种具有提高的产量的植物甜蛋白的细胞外分泌的方法，包括：

(a)将核苷酸序列与表达载体连接以获得DNA构建体，所述核苷酸序列编码与植物甜蛋白偶联的信号前导序列，并通过转化将所述构建体导入BL21(DE3)大肠杆菌细胞；

(b)在葡萄糖的存在下，在培养基中培养步骤(a)携带重组构建体的转化细胞，并用选自IPTG或乳糖的试剂诱导蛋白质表达，经过范围从2小时至72小时的时间段，以在所述培养基中获得植物甜蛋白的分泌物，和

(c)诱导2-72小时后将培养基与细胞分离，并从澄清的培养基纯化植物甜蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物甜蛋白选自由野生型III型植物甜蛋白和III型植物甜蛋白的变体或多变体所组成的组。

3.根据权利要求1所述的方法，其中重组表达载体选自pET载体或具有IPTG诱导型启动子的表达载体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号前导序列选自由pelB、ompA、Bla、PhoA、PhoS、MalE、LivK、LivJ、MglB、AraF、AmpC、RbsB、MerP、CpdB、Lpp、LamB、OmpC、PhoE、OmpF、TolC、BtuB和LutA信号序列所组成的组。

5.根据权利要求1所述的方法，其中将诱导剂以范围从约0.25mM至5mM的浓度加入所述培养基中。

6.根据权利要求1所述的方法，其中细胞的培养在25℃至37℃之间的温度下进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其中植物甜蛋白的产量范围为约0.5g/l至约5g/l。

8.根据权利要求1所述的方法，其中表达宿主选自由BL21(DE3)细胞系和亲本大肠杆菌BL21细胞系的衍生物所组成的组。

9.根据权利要求1所述的方法，其中诱导剂选自由乳糖和乳糖类似物所组成的组。

10.根据权利要求1所述的方法，其中葡萄糖是在诱导前生长培养基的组分。