CN109293584A

CN109293584A - 靶向神经肽受体pac1-r的小分子别构调节化合物spam及其制备方法和用途

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Publication number: CN109293584A
Application number: CN201811111973.7A
Authority: CN
Inventors: 余榕捷
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangzhou Zhenpi Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109293584B

Abstract

本发明公开了靶向神经肽受体PAC1‑R的小分子别构调节化合物SPAM及其制备方法和用途。其结构式如式（Ⅰ）所示，其中R¹=OH或NH；R²=无或H₂0或HCl；本发明所涉及的小分子化合物能够与神经肽受体PAC1‑R的胞外域结合，不仅单独即可别构激活PAC1‑R受体，而且可增强天然激动剂对PAC1‑R正位激活，初步药理学研究（体外细胞与动物模型）显示小分子化合物具有良好的保护神经细胞，抵抗阿尔兹海默症与帕金森症发生发展、保护视网膜的活性，可进一步研制开发为新型的预防与治疗神经系统退行性疾病与视网膜损伤的小分子药物。

Description

靶向神经肽受体PAC1-R的小分子别构调节化合物SPAM及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及化学与生物化学领域，具体地说，涉及靶向神经肽受体PAC1-R的新型小分子别构调节化合物SPAM及其制备与在预防与治疗神经损伤方面的应用。

背景技术

PAC1-R是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide，PACAP)的特异受体，属于B类G蛋白偶联受体(G proteincoupled receptor，GPCR)，主要分布于中枢与外周神经系统及神经内分泌组织，介导了显著的神经保护、抗炎性反应，促进神经修复和再生的生物学功能，是预防与治疗神经系统疾病与损伤，包括神经退行性疾病和视网膜损伤与病变的重要靶点。

我们已有的研究在国内外首次发现临床上具有显著神经保护和抗炎作用的小分子抗生素强力霉素正是通过识别PAC1-R的N端胞外域的别构调节位点，进而增强天然配体对PAC1-R的激活，从而在预防和治疗机体系统性炎症、神经退行性疾病(包括阿尔兹海默症和帕金森症)和神经损伤(包括视网膜损伤与病变)等方面发挥了显著的非抗生素的临床作用(Yu R,et al.Doxycycline exerted neuroprotective activity by enhancing theactivation of neuropeptide GPCR PAC1.Neuropharmacology.2016；103:1-15.)。

目前，作为现有药物的主要靶点的GPCRs，其小分子别构调节被认为是一种新型的有效调控GPCRs的方案；由于别构调节剂不是直接对接GPCRs的正位位点，若开发为药物，具有显著的特点：a)不直接激活受体，副作用较小；b)对受体选择性高，特异性好；c)别构调节不同于正位激活，时间效应较长、安全性较高；d)化学小分子别构调节剂与多肽别构调节剂相比，由于是化学小分子是刚性对接受体，避免了多肽的柔性对接造成的熵值消耗，所以结合效率高，调节活性显著。

而针对PAC1-R，筛选出高效低毒的小分子别构调节剂将有利于靶向PAC1-R的、预防与治疗神经损伤病变及神经退行性疾病的新型小分子化合物的药用开发与应用。

发明内容

本发明是我们首先应用计算机虚拟筛选技术，针对小分子抗生素强力霉素靶向的、位于PAC1-R的N端胞外域的别构调节位点，开展新型高效的PAC1-R小分子别构调节化合物的虚拟筛选；然后通过实验，在细胞水平和动物水平验证筛选获得的小分子的保护神经细胞、预防帕金森症与阿尔兹海默症的生物学活性，最终筛选得到靶向PAC1-R胞外域别构调节位点的新型高效的小分子调节化合物SPAM。

此外，我们对具有SPAM结构的系列小分子，开展了相关衍生物及其有利于亲水性的水合或盐酸化修饰的衍生物，SPAM1-6的化学制备和进一步的实验鉴定。

靶向神经肽受体PAC1-R的小分子别构调节化合物SPAM，其结构式如式(Ⅰ)所示，其中R¹＝OH或NH；R²＝无或H₂0或HCl(无修饰或水合化修饰或盐酸盐化修饰)；

上述靶向神经肽受体PAC1-R的小分子别构调节化合物SPAM是具有下述结构的化合物；

上述化合物SPAM的制备方法，包括如下步骤：2-氨基苯腈、戊二酸酐和甲苯通过聚合反应获得基础化合物，进一步与氨甲基苯甲酸甲酯或氨甲基苯酰胺进行缩合反应得到。

上述化合物SPAM在制备用于保护神经或促进神经修复的药物中的应用。

上述化合物SPAM在制备用于预防或治疗神经退行性疾病或视网膜损伤药物中的应用。包括阿尔兹海默症、帕金森症或视网膜病变。

SPAM是我们在国内外首次发现的、靶向PAC1-R的N端胞外域的新型小分子别构调节化合物，与现有发现的靶向PAC1-R的别构调节剂相比，本发明所描述的SPAM具有如下有益效果：

(1)SPAM比强力霉素更高效地结合PAC1-R的N端胞外域，其结合的半有效浓度(EC50)是强力霉素的约1/3-1/2；

(2)SPAM不具有强力霉素的强抗生素活性，因此体内应用副作用较小；

(3)SPAM比强力霉素更有效地促进PAC1-R受体激活，从而发挥较强力霉素更显著的神经保护作用。

因此，SPAM将成为靶向PAC1-R的、预防与治疗神经退行性疾病(包括阿尔兹海默症和帕金森症)及视网膜损伤与病变的新型小分子化合药物。

附图说明

图1；PAC1-R的N端别构调节位点中对接口袋的确定；A.Doxycycline对接PAC1-EC1的构象；B.对接的分子作用模式。

图2；SPAM1对接PAC1-R的N端别构调节位点细节；A.SPAM1对接PAC1-EC1的构象；B.对接的分子作用模式。

图3；等温滴定量热法检测SPAM1与PAC1-EC1的结合；A.SPAM1；B.Doxycycline。

图4；SPAM1抗生素活性的测定；上面，SPAM1；下面，Doxycycline。

图5；MTT法测定SPAM1在帕金森症细胞模型中的神经保护作用；*,P<0.01,10-100uM SPAM1vs.MPP⁺。

图6；流式细胞技术测定SPAM1在阿尔兹海默症细胞模型中的神经保护作用；A.正常对照组；B.东莨菪碱Scop造模组；C.SPAM1+东莨菪碱Scop组。

图7.SPAM1在视网膜天冬氨酸损伤模型中的神经保护作用；*,P<0.01,10-100uMSPAM1vs.NMDA。

图8；MTT法测定SPAM1-6在帕金森症细胞模型中的神经保护作用；显示为有化合物存在时的细胞残留活性与无化合物时的细胞残留活性的比值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1SPAM 1-6的制备步骤如下：

●SPAM1的合成路线：

SPAM1的合成操作步骤：将2-氨基苯腈(II)(3g，25.4mmol)，戊二酸酐(III)(3.48g，30.4mmol)溶于甲苯中(15mL)。反应在90℃，氮气氛围下反应4小时。所得固体过滤并用水洗得化合物IV。

将化合物IV(10mmol)，K₂CO₃(20mmol)和UHP(urea hydrogen peroxide)(30mmol)溶于丙酮/H₂O(1/1)(100mL).反应在80℃下反应22小时。然后再将K₂CO₃(20mmol)和UHP(30mmol)加入反应体系，反应在80℃下加热过夜。反应冷却后加入6M HCl.调节pH至4-6.所得固体过滤并用甲醇和二氯甲烷洗涤得化合物V。将化合物V(1mmol)，对氨甲基苯甲酸甲酯(VI)(1.2mmol)，HATU(2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)(1.2mmol)和三乙胺(2.4mmol)溶于二氯甲烷中(5mL)。反应在室温下搅拌过夜，固体残余物过滤得化合物VII。将化合物VII(1mmol)溶于10mL四氢呋喃中，然后加入10％LiOH(5mL)溶液，室温搅拌反应直至原料VII消失。然后用烯盐酸调节pH至7-8，过滤固体物并用水洗得化合物SPAM1。

●SPAM2的合成路线：

SPAM2的合成操作步骤：将化合物V(1mmol)，对氨甲基苯酰胺(VIII)(1.2mmol)，HATU(2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)(1.2mmol)和三乙胺(2.4mmol)溶于二氯甲烷中(5mL)。反应在室温下搅拌过夜，固体残余物过滤得化合物SPAM2。

●SPAM3的合成路线：

SPAM3的合成操作步骤：在装由1毫升THF/H₂O(1/1)的试管中加入化合物SPAM1(20毫克),充分震荡使其溶解，然后用封口膜包裹试管口，并用细针头扎几个小孔待溶剂慢慢挥发培养化合物SPAM3的晶体。

●SPAM4的合成路线：

SPAM4的合成操作步骤：在装由1毫升THF/H₂O(1/1)的试管中加入化合物SPAM2(20毫克),充分震荡使其溶解，然后用封口膜包裹试管口，并用细针头扎几个小孔待溶剂慢慢挥发培养化合物SPAM4的晶体。

●SPAM5的合成路线：

SPAM5的合成操作步骤：将化合物SPAM1(20mg)溶于1毫升乙醚中，然后用滴管将溶液逐滴加入搅拌的含由HCl气体的乙醚溶液中，随后有大量白色固体产生，过滤，低温干燥即得化合物SPAM5。

●SPAM6的合成路线：

SPAM6的合成操作步骤：将化合物SPAM2(20mg)溶于1毫升乙醚中，然后用滴管将溶液逐滴加入搅拌的含由HCl气体的乙醚溶液中，随后有大量白色固体产生，过滤，低温干燥即得化合物SPAM6。

实施例2：PAC1-R的N端别构调节位点中对接口袋的确定

首先采用商业软件Schordinger-Glide进行小分子抗生素强力霉素(Doxycycline，Dox)与PAC1-R的N端胞外域建模蛋白进行对接，蛋白的处理采用Glide流程中的加氢->去水->蛋白结构优化，小分子的处理采用Ligprep的Epik模式进行。格点文件由Doxycycline为中心选取，并选择其周围15埃距离内的残基作为对接口袋。对接共获取到3个对接构象，其中排名最高的分子其对接打分为：-6.090，其对接构象如图1A，对接的分子作用模式如图1B。Doxycycline与蛋白相互作用的重要残基包括ASP111、ILE61、ASP116、PHE27及PHE115；并且与ASP116形成了氢键作用，同时与ASP111形成了氢键作用，还与ILE61、PHE27和PHE115等存在疏水相互作用。

实施例3：SPAM1靶向PAC1-R的N端别构调节位点的虚拟筛选

虚拟筛选采用陶素化学提供的虚拟筛选小分子库(个数200多万)，使用我方自建的流程移除了其中包含PAINS结构的分子，最终进行对接计算的分子个数为180多万(PAINS指一系列化学结构的母核，含有这些母核的分子将可能对各类实验Assay产生作用，但不是真正的结合作用，容易造成实验结果的假阳性)。然后我们使用薛定谔中的LigPrep模块(Epik模式)对小分子进行预处理和构象生成，并得到最终的可进行对接的小分子文件。使用Schordinger-Glide软件，我们首先使用SP精度(普通精度)对180多万个小分子进行虚拟筛选，并按照筛选结果挑选到打分在前2000名的小分子。然后对这2000个小分子再使用XP精度(超高精度对接)筛选出其中排名在前1000名的小分子，并对排名前30的小分子进行构象的结合模式分析。其中SPAM1是得分排名第一的小分子，其与PAC1-R的N端胞外域的对接打分为：-8.178，其对接构象如图2A，其与建模蛋白的结合模式分析如图2B。

实施例4：SPAM1结合PAC1-R的N端胞外域的实验室验证

采用等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry,ITC)检测SPAM与PAC1-R的N端胞外域蛋白(简称PAC1-EC1)的结合常数(Ka)和有效半结合浓度(EC50)。具体操作是采用美国MicroCal公司生产的ITC200仪器，小分子化合物均以200uM浓度溶解在含5％DMSO的Tris-HCl缓冲液中，滴定280uL同样溶解在含5％DMSO的Tris-HCl缓冲液中的、浓度为30uM的PAC1-EC1蛋白；滴定参数为：注射次数19次、反应温度25℃、参比功率5uCal/s、搅拌速度750rpm、单次滴定体积2ul、滴定持续的时间4s/ul、滴定间隔时间100s。同时以不含小分子化合物的溶媒滴定作为实验背景对照对数据进行背景扣除。使用ITC200自带软件origin7.0处理数据，用非线性回归确定结合曲线并计算各结合参数。结合曲线如图3所示。结果显示SPAM1结合PAC1-EC1的EC50为0.38±0.11uM)约是Dox的EC50(0.97±0.33uM)的1/3-1/2，显示SPAM1比Dox更有效结合PAC1-EC1。

实施例5：SPAM1无显著抗生素活性

采用抑菌圈实验，具体操作为，大肠杆菌菌液和45℃琼脂混合后倒固体培养平板，小分子SPAM1溶解于15％DMSO，制备成100uM，1mM和10mM三个浓度，各取50uL湿润直径60mm的圆形滤纸，至于含有菌液的培养基上，37℃培养24h结果如图4显示，100uM-10mM的SPAM1没有显著的抑菌圈，而相同浓度的Dox则具有显著抑菌圈，表明SPAM1不具有显著的抗生素活性，其临床应用的副作用将较Dox小。

实施例6：SPAM1在帕金森症细胞模型中的神经保护作用

采用在小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro2a上制备的1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子(1-methyl-4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPP⁺)诱导的帕金森症细胞模型，具体操作为，培养Neuro2a细胞至融合率为80％以上，分别加入0.1uM-100uM的SPAM1，孵育2h后，加入8mM MPP⁺培养24h，MTT法测定细胞残留活性，以没有加SPAM1和MPP⁺的细胞为对照。结果如图5所示，10uM和100uM的SPAM1显示有显著的保护神经细胞抵抗损伤的抗凋亡活性(*,P<0.01,10-100uM SPAM1vs.MPP⁺)，具有抗帕金森症的潜力。

实施例7：SPAM1在阿尔兹海默症细胞模型中的神经保护作用

采用在小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro2a上制备的东莨菪碱(Scopolamine，Scop)诱导的阿尔兹海默症细胞模型，具体操作为，培养Neuro2a细胞至融合率为80％以上，分别加入10uM的SPAM1，孵育2h后，加入3Mm Scop培养24h，使用70％的乙醇固定细胞，按AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒(KEYGEN)染色后用流式细胞仪BD FACSAriaTM进行细胞活性测定，结果如图6所示，Scop造成活细胞百分比从90.2％将至72.9％，死亡细胞从3.12％升至10.9％，加入SPAM1后，细胞活性增加为84％，死亡细胞降为8.96％；显示SPAM1能够有效抑制Scop造成的神经细胞凋亡，具有抗阿尔兹海默症的潜力。

实施例8：SPAM1在视网膜损伤模型中的神经保护作用

采用N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)制备的SD大鼠视网膜损伤模型，具体操作为：10％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，术前10min复发托吡卡胺滴眼散大瞳孔，盐酸奥布卡因滴眼液麻醉角膜，在手术显微镜下经角膜缘后2mm用微量进样器垂直进针1mm向玻璃体腔内注入2μLNMDA溶液(50mM)，同时注入梯度浓度(1-100uM)的SPAM1,以注入等体积生理盐水的作为对照，正常对照组注术4μL生理盐水行假手术，术后用抗生素滴眼液、眼膏预防感染。术后第7天，过量戊巴比妥钠腹腔注射处死大鼠，取出眼球后立刻浸入冰冷的PBS中，角膜两端开口后放入4％多聚甲醛中，固定过夜。眼杯组织石蜡包埋后4μm切片，每组(n＝3)至少制作6张穿过视盘的视网膜切片，HE染色，光学显微镜下拍照观察，统计经过视神经(3点至9点方向)的视网膜切片的节细胞层(ganglion cell layer,GCL)层RGC细胞数。结果如图7所示，10-100uM的SPAM1能有效抑制NMDA造成的RGC细胞数据的减少(*,P<0.01,10-100uM SPAM1vs.NMDA)，说明SPAM1具有潜在的保护视网膜抵抗损伤的临床功效。

实施例9：SPAM1-6抗神经细胞损伤的活性测定

采用在小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro2a上制备的1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子(1-methyl-4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPP⁺)诱导的帕金森症细胞模型，具体操作为，培养Neuro2a细胞至融合率为80％以上，分别加入100uM的SPAM1-6，孵育2h后，加入8mM MPP⁺培养24h，MTT法测定细胞残留活性，计算有化合物存在时的细胞残留活性与无化合物时的细胞残留活性的比值。测定结果如图8所示，有SPAM1-6存在时测得的细胞残留活性与无化合物时细胞残留活性的比值均显著>1，显示SPAM1-6均具有显著的神经保护作用。

Claims

1.靶向神经肽受体PAC1-R的小分子别构调节化合物SPAM，其结构式如式(Ⅰ)所示，其中R¹＝OH或NH；R²＝无或H₂0或HCl；

2.如权利要求1所述的靶向神经肽受体PAC1-R的小分子别构调节化合物SPAM，其特征是具有下述结构的化合物；

3.权利要求1所述的化合物SPAM的制备方法，其特征是包括如下步骤：2-氨基苯腈、戊二酸酐和甲苯通过聚合反应获得基础化合物，进一步与氨甲基苯甲酸甲酯或氨甲基苯酰胺进行缩合反应得到。

4.权利要求1所述的化合物SPAM在制备用于保护神经或促进神经修复的药物中的应用。

5.权利要求1所述的化合物SPAM在制备用于预防或治疗神经退行性疾病或视网膜损伤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病或视网膜损伤为阿尔兹海默症、帕金森症或视网膜病变。