CN109289052A - 一氧化氮和顺铂靶向联合可控给药纳米药物体系及制备 - Google Patents

一氧化氮和顺铂靶向联合可控给药纳米药物体系及制备 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一氧化氮和顺铂靶向联合可控给药纳米药物体系，结构如下所示：载体—外源NO供体—金属配合物；其中，所述载体为纳米载体；所述外源NO供体为金属钌亚硝酰NO供体；所述金属配合物为铂配合物。该药物体系具有荧光示踪，可选择性靶向特定癌细胞，可近红外光光控投递一氧化氮和顺铂药物，同时具有光热治疗功能。一氧化氮和顺铂联合给药并协同光热疗法达到高效的抗癌效果。

Description

一氧化氮和顺铂靶向联合可控给药纳米药物体系及制备
技术领域
本发明涉及生物领域及无机纳米药物领域。具体的，本发明提供了一类具有荧光示踪、靶向输送、细胞内近红外光光控投递一氧化氮和顺铂的多功能双金属的纳米复合药物体系及其制备方法。
背景技术
顺式-二氯二氨合铂(II)(顺铂，cisplatin)自从上世纪70年代被发现可以抑制肿瘤细胞生长后,就广泛应用于各种癌症的化学治疗，在化疗药物中占有重要的位置。铂的作用机理：进入体内后，作用于肿瘤细胞DNA，与DNA配位形成加合物，DNA复制受到抑制，从而引起肿瘤细胞凋亡。
顺铂是一种针对多种癌症(包括卵巢癌，乳腺癌，膀胱癌，头颈癌和非小细胞肺癌)的一线化疗药物。然而顺铂对正常组织具有严重的毒副作用，特别是急性肾毒性和慢性神经毒性。同时许多肿瘤具有内在的耐药性和/或可以迅速产生对顺铂治疗的耐药性，导致治疗效果低下。因此，需要不断努力开发新型铂类抗肿瘤药物，旨在提高其抗肿瘤效率，同时最大限度地减少其不良副作用。在众多探索的铂化合物中，八面体配位的铂(IV)化合物被认为是有前途的Pt(II)前体药物，可以克服与顺铂及其类似物相关的许多问题。
在生物医学应用中，外源性一氧化氮(NO)的给药是一种挑战，因为非系统性给药途径相对难以实现。研究人员认为NO在癌症生物学中具有关键功能，一直在制定策略来操纵治疗目的的外源性NO输送。在这个方向，NO供体已被广泛用于模拟一氧化氮合成酶(NOS)对内源性NO的持续生产。通常，低分子量NO供体包括S-亚硝基硫醇(RSNO)，金属亚硝酰配合物，二醇二氮烯鎓(NONOates)等。在NO供体中，据研究报道，二醇二氮烯鎓是生物医学应用中最常用的低分子量NO供体，能有效抑制肿瘤生长。另外，二醇二氮烯鎓-二乙烯三胺一氧化氮加合物(DETA/NO)(浓度范围为250-1000μmol/L)可抑制人白血病细胞系HL-60和树突细胞。然而，也有研究已经报道了其存在潜在的全身性副作用。并且不受控制的NO释放和NO供体快速的分解，限制了低分子量NO供体在体内治疗应用的成功，特别是对于癌症治疗。因此，科学界目前正在寻找具有最大抗增殖作用和最小副作用的“理想”NO供体。
早期，研究最广泛的金属亚硝酰基是铁亚硝酰络合物：Na2[Fe(CN)5NO]，硝普钠(SNP)。然而，由于与光产物(剩余的金属配合物)有关的毒性或辅助配体的丧失，并且缺乏稳定性，使SNP的应用受到一定程度的限制。钌亚硝酰基化合物(Ru-NOs)通常比其他金属亚硝酰基更稳定，可以通过改变钌亚硝酰基化合物的配体和结构，使其更有利于钌亚硝酰基化合物在可见光或近红外光刺激下持续高效的释放NO。
综合以上分析，如何将极不稳定的NO小分子以合适的浓度选择性地投递到特定的细胞或亚细胞器，并将NO与其它化疗药物结合，通过可控联合给药来提升药物的抗癌疗效还有待研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗癌作用的多功能双金属的纳米复合药物体系及其制备方法。
本发明的第一方面，提供了一种纳米复合材料药物体系，所述的药物体系的结构如下所示：
载体—外源NO供体—金属配合物；
其中，
所述载体为纳米载体；
所述外源NO供体为金属钌亚硝酰NO供体；
所述金属配合物为铂配合物。
在另一优选例中，所述纳米复合材料药物体系的粒径为3-100nm，较佳地为5-10nm。
在另一优选例中，外源NO供体与纳米载体的重量比为0.1-0.3：1。
在另一优选例中，外源NO供体与铂金属配合物的重量比为0.5-1：1。
在另一优选例中，所述的载体是表面未氨基化或氨基化的选自下组的纳米载体：氮搀杂石墨烯量子点。
在另一优选例中，所述的载体是表面氨基化的纳米粒子。
在另一优选例中，所述外源NO供体结构为[(tpy′)M1(R1)(NO)](PF6)3，
其中，
tpy′为三齿含氮配体，选自：4'-甲酸-2,2':6',2”-三联吡啶或其衍生物；
R1为二齿含氮配体，选自：3-甲酸-邻苯二胺、3,4-二氨基苯甲酸甲酯或其衍生物；
M1为Ru。
在另一优选例中，tpy′和R1中同时包含一个羧酸基团。
在另一优选例中，所述金属配合物结构为：
[M2(NH3)2Cl2(OH)2]，
其中，
M2为Pt。
在另一优选例中，所述金属配合物为：cis-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]。
在另一优选例中，所述的金属配合物通过共价键与外源NO供体相连接。
在另一优选例中，所述的载体通过共价键与所述外源NO供体相连接。
在另一优选例中，所述载体上还连接有靶向导向基团。
在另一优选例中，所述的靶向导向基团为叶酸。
在另一优选例中，所述载体通过共价键与所述靶向导向基团相连接。
在另一优选例中，所述靶向导向基团和所述外源NO供体的摩尔比为(1±0.5)：(10±5)。
在另一优选例中，所述靶向导向基团和所述外源NO供体的摩尔比为(1±0.2):(8±1)。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的纳米复合材料药物体系的制备方法，所述方法包括步骤：
(i)提供金属配合物、外源NO供体和载体；
(ii)将所述金属配合物与外源NO供体配位形成复合分子，将该复合分子负载于所述载体，从而形成如第一方面所述的药物体系。
在另一优选例中，本发明的纳米复合材料药物体系的制备方法，所述方法包括步骤：
(i)提供金属配合物、外源NO供体和载体；
(ii)将所述外源NO供体与所述载体进行酰胺化反应，然后再将所述金属配合物通过配位键连接到所述外源NO供体上，从而形成如第一方面所述的药物体系。
在另一优选例中，所述步骤i)还包括提供靶向导向基团，所述步骤ii)中，将靶向导向基团和复合分子负载于所述载体，从而形成如第一方面所述的药物体系。
在另一优选例中，所述步骤ii)中，先将所述的外源NO供体与表面氨基化的载体进行酰胺化反应，然后再将所述的铂配合物通过羧酸基链接到金属亚硝酰基团上，从而制得所述的纳米复合材料药物体系。
在另一优选例中，所述步骤ii)中，先将所述的外源NO供体，所述的靶向导向基团与所述表面氨基化载体纳米粒子进行酰胺化反应，然后再将所述的铂配合物通过羧酸基链接到金属亚硝酰基团上，从而制得所述的纳米复合材料药物体系。
在另一优选例中，所述步骤ii)中，将所述纳米粒子载体先与靶向导向基团反应，然后再与外源NO供体反应，形成所述纳米复合材料药物体系。
在另一优选例中，所述靶向导向基团和所述外源NO供体的摩尔比为(1±0.5)：(10±5)。
在另一优选例中，所述靶向导向基团和所述外源NO供体的摩尔比为(1±0.2):(8±1)。
在另一优选例中，所述的步骤ii)在偶联剂存在下进行。
在另一优选例中，所述的偶联剂选自下组：EDC/NHS，其中EDC为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺。
在另一优选例中，所述步骤i)中，所述外源NO供体通过以下步骤提供：
(a1)提供M1(tpy′)Cl3，其中，M1为Ru；tpy′为三齿含氮配体，选自：4'-甲酸-2,2':6',2”-三联吡啶或其衍生物；
(a2)在惰性气氛中，用所述的M1(tpy′)Cl3与R1以及NH4PF6反应，形成[(tpy′)M1(R1)Cl](PF6)3；其中，R1为二齿含氮配体，选自：3-甲酸-邻苯二胺、3,4-二氨基苯甲酸甲酯或其衍生物；(a3)所述的[(tpy′)M1(R1)Cl](PF6)3与亚硝酸盐反应，得到[(tpy′)M1(R1)NO2](PF6)；
(a4)将[(tpy′)M1(R1)NO2](PF6)与酸和NH4PF6反应，得到所述的外源NO供体。
在另一优选例中，所述步骤i)中，所述金属配合物通过以下步骤提供：
(b1)提供K2M2Cl4，其中，M2为Pt；
(b2)在避光环境下，用K2M2Cl4与KI及氨水加热反应，形成cis-[M2I2(NH3)2]；
(b3)在避光环境下，将cis-[M2(NH3)2I2]与AgNO3及KCl反应，形成cis-[M2(NH3)2Cl2]；
(b4)在避光环境下，将cis-[M2(NH3)2Cl2]与H2O2加热反应，形成[M2(NH3)2Cl2(OH)2]。
在另一优选例中，步骤(a3)中，[(tpy′)M1(R1)Cl](PF6)3与亚硝酸盐在溶剂中反应，所述溶剂选自：乙醇、水、DMF。
在另一优选例中，所述的酸选自下组：HNO3、H2SO4、HPF6或盐酸。
在另一优选例中，步骤(a2)在惰性气体(如氮气，氩气)环境中进行。
在另一优选例中，步骤(a4)在0℃～室温(如25℃)下进行。
在另一优选例中，所述载体为表面氨基化的纳米粒子载体，通过以下步骤制备：
将乙二胺与纳米粒子反应，得到表面氨基化的纳米粒子载体。
在另一优选例中，纳米粒子载体分散在蒸馏水中，在EDC/NHS活化下，加入乙二胺制得，其中，其中EDC为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，包括：如第一方面所述的纳米复合材料药物体系，和药学上可接受的载体。
“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的纳米复合材料药物体系以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
本发明的第四方面，提供第一方面所述的纳米复合材料药物体系的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述药物为靶向抗癌药物，结合了铂类药物以及金属亚硝酰NO供体，起到协同抗癌的效果。
在另一优选例中，所述的药物用于抗肿瘤治疗。
在另一优选例中，所述纳米复合材料药物体系体系能够靶向特定肿瘤细胞并可用近红外光光控投递NO和顺铂药物，进行NO和顺铂联合给药，同时协同光热疗法实现多模式肿瘤治疗。
在本发明的第五方面，提供了一种纳米体系联合给药的方法，用近红外光照射本发明第一方面所述的纳米复合材料药物体系，从而使所述纳米复合材料药物体系释放出NO和铂类药物。
在本发明的第六方面，提供了一种纳米药物体系对肿瘤的多模式治疗方法，用近红外光照射本发明第一方面所述的纳米复合材料药物体系，可产生明显的光热效果，从而实现对肿瘤的化疗和光热治疗的多模式疗法。
在另一优选例中，所述的近红外光的波长为808nm。
在另一优选例中，所述的方法是非治疗性和非诊断性的。
在另一优选例中，所述的释放是在体外，对溶液中纳米复合材料药物体系进行光照，从而释放NO，同时产生光热效果。
在另一优选例中，照射方式为脉冲照射或持续照射。
在另一优选例中，照射的光强为100-2000毫瓦/平方厘米。
在本发明的第七方面，提供了一种非治疗性的将纳米复合材料药物体系靶向输送给细胞的方法，包括步骤：
将本发明第一方面所述的纳米复合材料药物体系与所述细胞一起孵育，
其中，
所述细胞的表面携带与所述靶向导向基团相匹配的表面受体或表面蛋白，从而使得所述纳米复合材料药物体系被靶向输送至所述细胞。
在另一优选例中，所述靶向细胞为叶酸受体过度表达的HeLa细胞。
在另一优选例中，靶向细胞为叶酸受体弱表达的MCF-7细胞。
在另一优选例中，靶向细胞为正常的人脐静脉内皮细胞HUVEC。
在另一优选例中，所述的孵育条件为37±2℃(较佳地37℃)，24±1小时。
在另一优选例中，所述的纳米复合材料药物体系的浓度为5-500微克/毫升。
在另一优选例中，所述方法还包括用NO探针检测NO的释放情况。
在另一优选例中，NO探针为DAF-FM DA。
在另一优选例中，靶向细胞与纳米复合材料药物体系和NO探针一起孵育4-24小时，然后再用近红外光照射0.5-30分钟。
在本发明的第八方面，提供了一种共同输送NO和铂类药物的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的纳米复合材料药物体系。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物。
在另一优选例中，所述的方法还包括利用肿瘤酸性还原性微环境还原四价铂前药从而释放顺铂药物，同时用近红外光进行照射可光控释放NO。
本发明公开的多功能双金属纳米抗癌药物体系，以金属钌亚硝酰化合物作为外源的一氧化氮供体，铂配合物作为铂前药，叶酸等为靶向导向基团，铂配合物通过共价键与金属钌亚硝酰化合物相连，以氮搀杂石墨烯量子点等作为载体。
本发明的双金属纳米药物体系具有荧光示踪，选择性靶向特定癌细胞，可近红外光光控投递一氧化氮和顺铂药物，同时具有光热治疗功能。一氧化氮和顺铂联合给药并协同光热疗法达到高效的抗癌效果。该体系有良好的生物兼容性及稳定性，本发明在有关肿瘤的联合给药多模式治疗等领域具有潜在应用前景和商业价值。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
图1为一氧化氮和铂共负载复合纳米药物体系结构示意图，显示了该体系以纳米粒子为载体，载体上链接有金属亚硝酰NO供体和铂配合物，载体上同时连接有靶向导向基团。
图2为优选纳米体系{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}的透射电镜图及粒径分布，显示其粒径为5-8纳米。
图3显示了优选纳米体系{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}在盐溶液中的NO释放、铂释放以及光热效果，其中，
A为近红外光持续照射时，纳米体系的NO释放效果。浓度：1.5毫克/毫升；光强：200-400毫瓦/平方厘米，λ＝808nm。通过高于300毫瓦/平方厘米持续近红外光照射1.5mg/mL的样品可获得微摩尔/升的高浓度一氧化氮溶液，不同浓度的NO溶液可通过光照强度或纳米体系浓度进行调节；
B为优选纳米体系在不同条件下的缓冲溶液中的Pt释放效果，优选纳米体系在酸性还原环境中Pt的释放可达到90％以上，而在pH 7.4非还原环境中能稳定存在；
C为优选纳米体系在不同浓度下的光热效果，光强：1瓦/平方厘米，λ＝808nm，光照时间：12分钟，在一定光强下溶液温度随纳米体系浓度增大而升高，1000μg/mL的溶液光照12分钟后溶液温度提升近20度，而对照空白水溶液温度变化不明显(0.6度)。
图4显示了优选纳米体系{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}的细胞毒性，其中，
A为叶酸受体过度表达的HeLa细胞与不同浓度(0～150μg/mL)纳米体系共孵育，在黑暗下和在808nm近红外光下照射10分钟的条件下，然后分别进行细胞毒性测试结果；
B为在叶酸受体过度表达的HeLa细胞和叶酸受体低表达的MCF-7细胞以及正常人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞中分别测试{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}在近红外光照射下细胞的毒性。
图5显示了{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米体系的靶向细胞输送结果图。
其中，
A为叶酸受体过度表达的HeLa细胞与纳米体系(35.0微克/毫升)于37℃孵育4小时后的激光共聚焦图；
B为叶酸受体弱表达的MCF-7细胞与纳米体系(35.0微克/毫升)于37℃孵育4小时后的激光共聚焦图；
C为正常的人脐静脉内皮细胞HUVEC与{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}(35.0微克/毫升)于37℃孵育4小时后的激光共聚焦图。
图6显示了{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系细胞内的NO释放结果图，其中，
A为叶酸受体过度表达的HeLa细胞与纳米体系(35μg/mL)和NO探针DAF-FM DA(5μM)一起培育后的激光共聚焦图(无光照)；
B为叶酸受体过度表达的HeLa细胞与纳米体系(35μg/mL)和NO探针DAF-FM DA(5μM)一起培育后，再用近红外光照射2分钟后的激光共聚焦图(光强：600毫瓦/平方厘米，λ＝808nm)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次制得了一种新型的铂与钌亚硝酰结合的双金属的复合纳米药物体系，该体系可以靶向性地输送到特定肿瘤细胞中，在癌细胞的酸性以及还原性条件下释放出Pt药物，并且能光控释放出治疗量的NO。所述体系包括载体以及与所述载体相链接(如共价连接)的金属亚硝酰NO供体、铂配合物和靶向导向基团。本发明的体系不仅可在近红外光照射下能够迅速释放NO分子，通过调节光照时间和光照强度在很大的范围内调节释放NO浓度(nM～μM)。同时，在近红外光照射下该体系能产生明显的光热效果。此外，本发明的纳米复合药物体系还具有靶向性、良好的生物兼容性和稳定性等优点。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明药物体系”、“本发明体系”、“靶向性光控释放NO纳米复合药物体系”、“靶向性光控释放NO纳米复合药物”和“靶向性光控释放NO纳米复合药物组合物”可互换使用，均指以纳米粒子为载体，载体上连接有金属亚硝酰NO供体和铂配合物，任选地载体上同时连接有靶向导向基团的组合物。
纳米粒子载体
适用于本发明的纳米粒子载体没有特别限制，可以是本领域常用的各种纳米粒子载体。代表性的例子包括但并不限于：石墨烯量子点、二氧化钛纳米粒子、碳量子点、上转换纳米粒子、磁性纳米粒子、或其组合。
典型地，纳米粒子载体的粒径为3-100nm，较佳地为5-50nm。
在另一优选例中，粒径为5-10nm。
一类优选的纳米粒子载体为表面氨基化的载体。
金属亚硝酰NO供体
适用于本发明的外源NO供体是金属亚硝酰化合物。
典型地，外源NO供体为金属钌亚硝酰化合物或金属锰亚硝酰化合物。
在本发明中，外源NO供体与纳米粒子载体的重量比为0.1-03：1。
在另一优选例中，所述外源NO供体结构为[(tpy′)M1(R1)(NO)](PF6)3，其中，tpy′为三齿含氮配体，选自：4'-甲酸-2,2':6',2”-三联吡啶或其衍生物；R1为二齿含氮配体，选自：3-甲酸-邻苯二胺、3,4-二氨基苯甲酸甲酯或其衍生物，M1为Ru。
铂配合物
适用于本发明的铂类抗癌药物并没有特别限制，可以是本领域常用的各种铂类抗癌药物。
代表性的例子包括但并不限于：四价铂(IV)配合物。
在另一优选例中，所述金属配合物结构为[M2(NH3)2Cl2(OH)2]，其中，M2为Pt。
靶向导向基团
适用于本发明的靶向导向基团没有特别限制，可以是本领域常用的各种靶向导向基团。代表性的例子包括但并不限于：叶酸分子、半乳糖分子、生物素、或其组合。
在本发明中，所述靶向导向基团和所述外源NO供体的摩尔比没有特别限制，典型地所述靶向导向基团和所述外源NO供体的摩尔比为(1±0.2)：(8±1.6)。
在另一优选例中，所述靶向导向基团和所述外源NO供体的摩尔比为更佳地为1：8。
纳米复合药物体系
本发明的纳米复合药物体系均指以纳米粒子为载体，载体上连接有金属亚硝酰NO供体，NO供体上连接铂配合物，载体上同时连接有靶向导向基团的复合材料粒子。
一种简化的示意图如图1所示。
本发明的复合材料药物体系可用于向癌细胞输送铂类药物和NO，从而用于癌症的联合治疗。
制备方法
本发明还提供了本发明所述药物体系的制备方法，通常包括以下步骤：
(1)提供金属亚硝酰NO供体、铂配合物、靶向导向基团和载体纳米粒子；
(2)将所述的金属亚硝酰NO供体、所述铂配合物、所述靶向导向基团与所述载体纳米粒子进行共价负载，从而形成所述双金属纳米复合材料药物体系。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述的金属亚硝酰NO供体包括金属亚硝酰化合物(A)[(tpy′)M1(R1)(NO)](PF6)3，tpy′为4'-甲酸-2,2':6',2”-三联吡啶，M1为金属钌(Ru)，R1为3-甲酸-邻苯二胺或其衍生物。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述铂配合物包括金属化合物(B)cis-[M2(NH3)2Cl2(OH)2]，M2为金属铂(Pt)。
在另一优选例中，所述的载体纳米粒子是表面氨基化的纳米粒子。
在另一优选例中，所述的靶向导向基团选自：叶酸分子。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，先将所述的金属亚硝酰化合物和所述的靶向导向基团与所述表面氨基化载体纳米粒子进行酰胺化反应，再将得到的纳米粒子与在强酸作用下脱保护，再与[M2(NH3)2Cl2(OH)2]反应，从而制得所述的双金属纳米复合材料药物体系。
本发明的主要优点包括：
本发明的纳米复合药物体系具有靶向递送药物功能。
本发明的纳米复合药物体系能够选择性的向具有叶酸受体(FR)过度表达的肿瘤细胞中输送药物(如HeLa细胞)，而对正常细胞毒性小。
本发明提供了一种纳米体系联合可控给药的方法。该体系可以靶向性地输送到相应癌细胞中，在癌细胞的酸性还原性条件下释放出Pt药物，并且能光控释放出治疗量的NO，铂类药物和NO的联合给药大幅提升了该体系的抗癌效果。
本发明提供了一种纳米药物体系对肿瘤的多模式治疗方法。用近红外光照射本发明制备的纳米药物体系可产生明显的光热效果，从而实现对肿瘤的化疗和光热治疗的多模式疗法。
本发明的纳米复合药物体系具有良好的生物兼容性和稳定性。
本发明的纳米复合材料药物体系具有蓝色的自发荧光，可以在细胞中示踪药物体系的内吞情况，并且在细胞内释放的NO可以通过NO荧光探针来检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
金属Ru亚硝酰化合物[(tpyCOOH)Ru(MDAB)(NO)](PF6)3的合成
(1)[(tpyCOOH)Ru(MDAB)(Cl)](PF6)的合成
(tpyCOOH为4'-甲酸-2,2':6',2”-三联吡啶；MDAB为3,4-二氨基苯甲酸甲酯)：
向100mL的三口烧瓶中加入Ru(tpyCOOH)Cl3(150mg,0.31mmol)、MDAB、(55mg,0.33mmol)、LiCl(5mg,2.0mmol)和Et3N 0.4mL，抽真空和通氮气分别三次，加入40mL的EtOH/H2O(3:1,v/v),在N2氛中回流8小时，趁热抽滤，得到的深红色滤液浓缩到几毫升，待冷却到室温后，加入过量的饱和NH4PF6溶液，将此混合物放置在5℃的冰箱中过夜。过滤出红棕色沉淀，用H2O和Et2O分别洗涤三次，真空干燥。得到目标产品137mg，产率为61％。
(2)[(tpyCOOH)Ru(MDAB)(NO2)](PF6)的合成：
将[(tpyCOOH)Ru(MDAB)(Cl)](PF6)(100mg,0.14mmol)和过量的AgNO3(238mg,1.4mmol)加入到100mL的圆底烧瓶中，加入30mL CH3CN-H2O(1:1,v/v)，加热回流2小时，溶液颜色由红色逐渐变成紫色，将此混合物冷却到室温，过滤出灰白色的AgCl,向滤液中加入过量的NaNO2(69mg,1mmol)，加热回流6小时，待溶液冷却至室温，将溶液浓缩到几毫升，加入过量的饱和NH4PF6溶液，将此混合物放置在5℃的冰箱中过夜。过滤出红棕色沉淀，用H2O和Et2O分别洗涤三次，真空干燥。得到目标产品77.7mg,产率为75％。
(3)[(tpyCOOH)Ru(MDAB)(NO)](PF6)3的合成：
在273K温度下，将[(tpyCOOH)Ru(MDAB)(NO2)](PF6)(100mg,0.14mmol)加入到25mL的圆底烧瓶中，然后逐滴滴加2mL HNO3(2mol·L-1)于上述固体中，形成糊状的固体，搅拌30分钟后，加入过量的饱和NH4PF6溶液，将此混合物放置在5℃的冰箱中过夜。过滤出红棕色沉淀，用H2O和Et2O分别洗涤三次，真空干燥。
得到目标产品55.7mg，产率为55％。
实施例2
纳米粒子复合药物体系{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}的合成
(1)N-GQDs@NH2(表面氨基化的N-GQDs纳米粒子)的制备
称取柠檬酸(40mg)，用40mL蒸馏水溶解后，加入氨水(8mL)，将溶液至于马弗炉内200℃反应3h。冷却至室温后，调pH为8,得到浅黄色溶液，用截留分子量为1000的透析袋于水中透析4h，溶液旋蒸，得到N-GQDs固体。将N-GQDs溶于2.0mL蒸馏水中，加入EDC/NHS，活化1h，加入无水乙二胺1mL，室温下搅拌24h。用截留分子量为1000的透析袋将溶液至于水中透析24h，透析袋内溶液冷冻干燥得到产物N-GQDs@NH2。
(2)纳米粒子复合材料药物体系{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}的制备
将[(tpyCOOH)Ru(DABA)(NO)](PF6)3(100mg,0.14mmol)和FA(叶酸)(5.0mg,0.01mmol)溶于5mL的DMF中，加入EDC/NHS活化30分钟，之后，加入50.0mg N-GQDs@NH2，反应24小时。用截留分子量为1000的透析袋将溶液至于水中透析6h，透析袋内溶液冷冻干燥得到产物{N-GQDs@Ru-NO@FA}。
取{N-GQDs@Ru-NO@FA}(100mg)加入HCl(3M,10mL),65℃过夜反应，用截留分子量为1000的透析袋将溶液至于水中透析6h，透析袋内溶液冷冻干燥得到产物{N-GQDs@Ru-NO-COOH@FA}。
取{N-GQDs@Ru-NO-COOH@FA}(100mg),加入[Pt(NH3)2Cl2(OH)2](50mg)溶于2mL的DMF中,再加入15mL超纯水，70℃过夜反应，用截留分子量为1000的透析袋将溶液至于水中透析6h，透析袋内溶液冷冻干燥得到最终产物{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}。
本实施例的{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系的透射电镜图及粒径分布如图2所示，显示其粒径为5-8纳米。
实施例3
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系在溶液中持续光照释放NO
将纳米药物体系悬浮在石英比色皿中的水溶液中，使用磁力搅拌棒温和搅拌。通过用808nm近红外激光照射引发NO释放。使用NO敏感电极测量释放的NO量。
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}的浓度：1.5mg/mL水溶液
光强：200，300，400毫瓦/平方厘米，λ＝808nm。
结果
通过高于300毫瓦/平方厘米持续近红外光照射1.5mg/mL的样品可获得微摩尔/升的高浓度一氧化氮溶液(图3中A所示)。不同浓度的NO溶液可通过光照强度或纳米体系浓度进行调节。
实施例4
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系在溶液中释放Pt药物
称取0.5mg纳米药物体系分散在10mL培养基中，装入1000Da的透析袋中，在200mL的培养基中透析一定时间。按一定的时间间隔取出1mL透析介质，并通过ICP-AES测量以计算铂的释放量。
溶液条件：分别在pH 7.4的0.1M磷酸缓冲液、pH 5.4的0.1M磷酸缓冲液、p H 7.4的0.1M磷酸缓冲液+10mM谷胱甘肽和pH 5.4的0.1M磷酸缓冲液+10mM谷胱甘肽条件下测试Pt的释放。
结果(图3中B所示)
纳米体系在酸性还原环境中Pt的释放可达到90％以上。而在pH 7.4非还原环境中能稳定存在。
实施例5
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系的光热性能
纳米体系的水溶液浓度：0，200μg/mL,400μg/mL,600μg/mL,800μg/mL,1000μg/mL.
光强：1瓦/平方厘米，λ＝808nm。光照时间：12分钟(图3中C所示)。
结果
在一定光强下溶液温度随纳米体系浓度增大而升高，1000μg/mL的溶液光照12分钟后溶液温度提升近20度。而对照空白水溶液温度只提升了0.6度。
实施例6
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系在细胞中的毒性测试
将HeLa细胞接种在96孔板上，密度为每孔5×104个细胞，并在潮湿的5％CO2气氛中孵育24小时。除去细胞培养基并用PBS洗涤。接下来，加入不同浓度的纳米药物体系(0,10,20,50,100和150μg/mL)，并在37℃和湿润的5％CO2下进一步孵育24小时。将MTT(100μL，500μg/mL)溶液加入每个孔中。在37℃孵育4小时后，除去细胞培养液，加入150μLDMSO。然后，使用酶标仪(Multiskan MK3，USA)在490nm处测量吸光度。根据加药组与空白组吸光度值的比例计算细胞存活率。
用不同浓度的纳米体系孵育细胞24小时后，对于光照组施加光照射(808nm，600mW/cm2,10分钟)，并将细胞再孵育1小时。随后的步骤与上述相同。毒性测试如图4中A所示。
结果：
在黑暗条件下，纳米体系在叶酸受体过度表达的HeLa细胞中也有毒性，说明铂(IV)前药在酸性还原性的癌细胞环境中被还原为铂(II)从而表现出抗癌活性。
当用808nm近红外光照射时释放出NO，毒性增加，说明近红外照下优选纳米体系所释放出的NO使得毒性增加，结果表明通过铂与NO的协同作用，大大增加了优选纳米体系的细胞毒性。
实施例7
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系在不同细胞中的毒性测试
将HeLa细胞,MCF-7细胞及正常人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞，分别接种在96孔板上，密度为每孔5×104个细胞，并在潮湿的5％CO2气氛中孵育24小时。除去细胞培养基并用PBS洗涤。接下来，加入不同浓度的纳米药物体系(0,10,20,50,100和150μg/mL)，并在37℃和湿润的5％CO2下进一步孵育24小时后，施加光照射(808nm，600mW/cm2,10分钟)，并将细胞再孵育1小时。将MTT(100μL，500μg/mL)溶液加入每个孔中。在37℃孵育4小时后，除去细胞培养液，加入150μLDMSO。然后，使用酶标仪(Multiskan MK3，USA)在490nm处测量吸光度。根据加药组与空白组吸光度值的比例计算细胞存活率。
在叶酸受体过度表达的HeLa癌细胞和叶酸受体低度表达的MCF-7癌细胞以及正常人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞中分别测试{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}在近红外光照射下细胞的毒性图4中B所示。
结果
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}在HeLa细胞中的毒性远远高于MCF-7细胞和HUVEC细胞，说明{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}能特定地靶向叶酸过表达的细胞，对正常细胞的损伤非常小。
实施例8
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系的靶向细胞输送
将HeLa细胞接种在共聚焦培养皿(直径35mm)上，密度为104个细胞，在37℃，5％CO2下孵育24小时。接下来，加入纳米药物体系(35μg/mL)继续孵育细胞4小时。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并通过共聚焦荧光显微镜分析。
结果
在HeLa细胞中可观察到明显的蓝色荧光，该结果表明大量{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米体系已进入细胞，大部分分布在细胞质中(图5中A所示)。
实施例9
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系的靶向细胞输送
将MCF-7细胞接种在共聚焦培养皿(直径35mm)上，密度为104个细胞，在37℃，5％CO2下孵育24小时。接下来，加入纳米药物体系(35μg/mL)继续孵育细胞4小时。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并通过共聚焦荧光显微镜分析。
结果
在MCF-7细胞中只观察到微弱的蓝色荧光，该结果表明纳米体系{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}进入MCF-7细胞的量较少(图5中B所示)。
实施例10
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系的靶向细胞输送
将HUVEC细胞接种在共聚焦培养皿(直径35mm)上，密度为104个细胞，在37℃，5％CO2下孵育24小时。接下来，加入纳米药物体系(35μg/mL)继续孵育细胞4小时。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并通过共聚焦荧光显微镜分析。
结果
在HUVEC细胞中只观察到非常微弱的蓝色荧光，该结果表明纳米体系{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}进入HUVEC细胞的量非常少(图5中C所示)。
实施例11
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系的靶向细胞内NO投递
将HeLa细胞接种在共聚焦培养皿(直径35mm)上，密度为104个细胞，在37℃，5％CO2下孵育24小时。接下来，加入{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}(35μg/mL)继续孵育细胞4小时。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，加入4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟荧光素二乙酸酯(DAF-FM-DA，5.0μM)，再孵育30分钟。接下来，用PBS洗涤细胞两次，通过共聚焦荧光显微镜分析。使用波长为405或488nm的激光进行激发，并且在420至490nm或500至550nm的波长范围内记录。
结果
在没有光照射条件下，只观察到NO探针在细胞内显示探针自身微弱绿色荧光(图6中A所示)。
实施例12
{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}纳米药物体系的靶向细胞内NO投递
将HeLa细胞接种在共聚焦培养皿(直径35mm)上，密度为104个细胞，在37℃，5％CO2下孵育24小时。接下来，加入{N-GQDs@Ru-NO-Pt@FA}(35μg/mL)继续孵育细胞4小时。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，加入4-氨基-5-甲氨基-2',7'-二氟荧光素二乙酸酯(DAF-FM-DA，5.0μM)，再孵育30分钟。接下来，用PBS洗涤细胞两次，并且施加光照射(808nm，600mW/cm2,2min)，通过共聚焦荧光显微镜分析。使用波长为405或488nm的激光进行激发，并且在420至490nm或500至550nm的波长范围内记录。
结果
在808nm近红外光照射条件下，观察到NO探针在细胞内显示非常强的绿色荧光(图6中B所示)，该结果表明通过控制光的照射可实现靶向细胞内的一氧化氮释放。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种纳米复合材料药物体系，其特征在于，所述的药物体系的结构如下所示：
载体—外源NO供体—金属配合物；
其中，
所述载体为纳米载体；
所述外源NO供体为金属钌亚硝酰NO供体；
所述金属配合物为铂配合物。
2.如权利要求1所述的药物体系，其特征在于，所述的载体是表面未氨基化或氨基化的选自下组的纳米载体：氮搀杂石墨烯量子点。
3.如权利要求1所述的药物体系，其特征在于，所述外源NO供体结构为[(tpy′)M1(R1)(NO)](PF6)3，其中，tpy′为三齿含氮配体，选自：4'-甲酸-2,2':6',2”-三联吡啶或其衍生物；R1为二齿含氮配体，选自：3-甲酸-邻苯二胺、3,4-二氨基苯甲酸甲酯或其衍生物，M1为Ru。
4.如权利要求1所述的药物体系，其特征在于，所述金属配合物结构为[M2(NH3)2Cl2(OH)2]，其中，M2为Pt。
5.如权利要求1所述的药物体系，所述载体上还连接有靶向导向基团，所述的靶向导向基团为叶酸。
6.一种如权利要求1所述的纳米复合材料药物体系的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)提供金属配合物、外源NO供体和载体；
(ii)将所述金属配合物与外源NO供体配位形成复合分子，将该复合分子负载于所述载体，从而形成如权利要求1所述的药物体系；或者
将所述外源NO供体与所述载体进行酰胺化反应，然后再将所述金属配合物通过配位键连接到所述外源NO供体上，从而形成如权利要求1所述的药物体系。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤i)具有以下一个或两个特征：
(1)所述外源NO供体通过以下步骤提供：
(a1)提供M1(tpy′)Cl3，其中，M1为Ru；tpy′为三齿含氮配体，选自：4'-甲酸-2,2':6',2”-三联吡啶或其衍生物；
(a2)在惰性气氛中，用所述的M1(tpy′)Cl3与R1以及NH4PF6反应，形成[(tpy′)M1(R1)Cl](PF6)3；其中，R1为二齿含氮配体，选自：3-甲酸-邻苯二胺、3,4-二氨基苯甲酸甲酯或其衍生物；(a3)所述的[(tpy′)M1(R1)Cl](PF6)3与亚硝酸盐反应，得到[(tpy′)M1(R1)NO2](PF6)；
(a4)将[(tpy′)M1(R1)NO2](PF6)与酸和NH4PF6反应，得到所述的外源NO供体；
(2)所述金属配合物通过以下步骤提供：
(b1)提供K2M2Cl4，其中，M2为Pt；
(b2)在避光环境下，用K2M2Cl4与KI及氨水加热反应，形成cis-[M2I2(NH3)2]；
(b3)在避光环境下，将cis-[M2(NH3)2I2]与AgNO3及KCl反应，形成cis-[M2(NH3)2Cl2]；
(b4)在避光环境下，将cis-[M2(NH3)2Cl2]与H2O2加热反应，形成[M2(NH3)2Cl2(OH)2]。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述载体为表面氨基化的纳米粒子载体，通过以下步骤制备：
将乙二胺与纳米粒子反应，得到表面氨基化的纳米粒子载体。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括：如权利要求1-5任一所述的纳米复合材料药物体系，和药学上可接受的载体。
10.如权利要求1-5任一所述的纳米复合材料药物体系的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
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CN109289052B (zh) 2022-02-08

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