CN109284814A - 基于dna纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系及方法 - Google Patents

基于dna纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系及其构建方法。组装的DNA纳米三脚架中，一条中心链通过三条边链部分杂交形成中心三角形，三条边链的剩余部分延伸形成单链DNA腿作为信号接收链，中心链负载荧光基团ROX。信号接收链在未与信号输入链杂交时吸附于氧化石墨烯表面，信号接收链在与信号输入链杂交变成双链后从氧化石墨烯表面解吸附。本发明通过组合输入不同信号输入链调节DNA纳米三脚架与氧化石墨烯的亲和性，从而调控负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯相互作用，产生不同荧光信号，实现分子逻辑运算体系构建，建立模型成功筛选了10以内自然数中合数，即：将多个目标物按照其属性从复杂体系中筛选出来。

Description

基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分 子逻辑运算体系及方法
技术领域
本发明属于分子计算机技术领域，具体涉及一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系及其构建方法。
背景技术
在现代电子计算机中，电子逻辑门是集成电路的基本组件。分子逻辑门与电子逻辑门具有相似性，通过合适的设计，布尔逻辑运算规则同样可应用于分子反应体系，实现输入信号到输出信号的转换。分子逻辑门可将化学、生物以及物理的输入刺激转变成一定的输出信号，因此，分子逻辑门是构建分子计算机的基础。构建分子逻辑运算体系，利用化学或者生化反应模拟电子电路系统进行逻辑运算，在分子水平上实现信息处理，是计算机科学、化学以及生物学相结合而发展起来的新兴研究领域。在当前技术水平，利用分子逻辑运算体系构建纳米尺度的智能分子器件，在化学、生物传感，生命科学研究以及医学诊断、治疗等领域具有很大的应用前景。
近些年来，人们利用DNA纳米技术开发出了大量结构可控、位置可寻址的DNA自组装纳米结构。DNA与天然或合成分子的相互作用可控、可设计，因此，纳米结构在三维排布功能基团，作为模具铸造具有任意指定三维结构的无机纳米材料，封装和释放药物、蛋白质和纳米材料，以及对封装的客体分子赋予新的性质等方面都展现出极大的潜能。最近，一些研究报道结构紧凑的自组装DNA纳米结构易于被细胞摄取，而且，相比于简单的DNA单链和双链，DNA纳米结构在生物体系中更稳定，例如，具有一定的抗酶解能力。这些独特性质为使用DNA纳米结构作为载体，将多种功能元件按照一定比例载入细胞，并在胞内协同执行它们的功能提供了基础。因此，把DNA纳米结构引入DNA逻辑电路将会为设计在体内能分析多种量测信号并做出适当响应的智能体系提供一般性的平台，例如DNA纳米载体，能按照需要以一种刺激响应型的方式执行靶向输送任务并智能控制装载物的释放。因此，将DNA纳米结构用于分子逻辑电路的构建引起了广泛研究兴趣。
现有的DNA逻辑门体系，大多数是基于简单的DNA纳米结构，如DNA双链、发夹结构、DNA交叉结构等构建的。这样的设计方法简单易行，但功能元件缺乏通用性，只能完成简单的逻辑运算，且使得逻辑器件结构分散，电路冗杂，增加了构建逻辑门的成本。采用集成设计策略，利用自组装DNA纳米结构可将多个功能元件组装于一体，可增强其信息处理能力，极大地简化分子逻辑运算体系的设计和运行。
发明内容
本发明的目的是，利用DNA纳米技术将多个DNA探针组装集成，并结合氧化石墨烯构建一个多功能的平台用于分子逻辑运算体系的构建。
为解决其技术问题，本发明采用的技术方案是利用DNA纳米技术将三个DNA探针组装集成在一个DNA纳米三脚架(DNA nanotripod)中，联合调节三个DNA探针与氧化石墨烯的亲和性，从而调控其负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用，如图1所示，实现分子逻辑运算体系的构建。具体包括：
一、一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系：
包括氧化石墨烯、DNA纳米三脚架(DNA nanotripod)和多个单链DNA序列，DNA纳米三脚架包括一条中心链与三条边链，一条中心链通过三条边链其中的一部分杂交形成中心三角形，三条边链的剩余部分分别从中心三角形三个顶点延伸出来形成单链DNA腿，利用DNA末端修饰使中心链负载荧光基团ROX，以纳米三脚架的单链DNA腿作为信号接收链，识别多个作为信号输入链的单链DNA序列，多个单链DNA序列作为信号输入链分别与三个信号接收链互补杂交；信号接收链在未与信号输入链杂交时吸附于氧化石墨烯表面，信号接收链在与信号输入链杂交变成双链后从氧化石墨烯表面解吸附。
本发明通过将不同序列的单链DNA作为信号输入链进行组合输入，以DNA纳米三脚架作为支架，调控DNA纳米三脚架和氧化石墨烯的相互作用，进而在纳米尺度上调控DNA纳米三脚架负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用，构建分子逻辑运算体系。
所述的中心链、单链DNA腿和信号输入链均为单链DNA。三个单链DNA腿和中心链之间、单链DNA腿和信号输入链之间均通过碱基互补配对杂交结合。所述的中心链的5′端连接有荧光基团ROX。
所述的DNA纳米三脚架的中心链的碱基序列为SEQ ID NO.1，三个信号接收链的碱基序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，
所述的DNA纳米三脚架组装结构如下：
具体实施中多个信号输入链的碱基序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7；通过设定多个信号输入链I1、I2、I3的不同组合输入，根据归一化荧光值和阈值判断组建majority逻辑门。
所述多个信号输入链中的I1、I2两个进行改造，在其两端均延长，即分别在5′端和3′端增加了10和14个碱基，形成两条改造的信号输入链(分别记为XOR I1和XOR I2)，多个信号输入链中的另一个不变；使得所述的多个信号输入链为两条改造信号输入链XOR I1、XOR I2，碱基序列分别为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9；通过预先输入I3，然后设定两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2的不同组合输入并利用I3，根据归一化荧光值和阈值判断组建两输入XOR逻辑门。
所述的多个信号输入链为信号输入链I1、信号输入链I3、改造信号输入链XOR I1和改造信号输入链XOR I2，碱基序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9；通过设定信号输入链I1、信号输入链I3、改造信号输入链XOR I1和改造信号输入链XOR I2的不同组合输入，根据归一化荧光值和阈值判断组建逻辑运算体系筛选10以内自然数中的合数。
所述的DNA纳米三脚架在复杂生物基质中具有一定的抗干扰能力，基于此，在含有10万细胞/毫升HeLa细胞裂解液的反应体系中执行majority逻辑门运算。
所述的分子逻辑门的运行在100μL反应体系中进行，DNA纳米三脚架使用终浓度为40nM，氧化石墨烯使用终浓度为20.0ug/mL，信号输入链使用终浓度为200nM。
二、一种基于DNA纳米三脚架调控荧光小分子与氧化石墨烯的相互作用构建分子逻辑运算体系的方法：
先利用DNA末端修饰在中心链C的5′末端接上荧光基团ROX形成修饰中心链C-5′-ROX，再利用DNA纳米技术组装一个DNA纳米三脚架(DNA nanotripod)；以纳米三脚架的单链DNA腿作为信号接收链，识别多个作为信号输入链的单链DNA序列，多个单链DNA序列作为信号输入链分别与三个信号接收链互补杂交；
当DNA纳米三脚架的信号接收链未接收到信号输入链时，即未与信号输入链杂交时为单链时为单链，会吸附于氧化石墨烯表面；当DNA纳米三脚架的信号接收链连接与信号输入链杂交后，即接收到信号输入链并形成双链，从氧化石墨烯表面解吸附；通过单个信号输入链的是否加入控制DNA纳米三脚架上所对应的单个信号接收链和氧化石墨烯表面吸附或者解吸附；
当不同信号输入链以不同组合输入时，使DNA纳米三脚架的三个信号接收链在氧化石墨烯的表面的状态不同，从而调控DNA纳米三脚架上所负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用不同，产生不同的荧光信号，实现了多种分子逻辑门构建。
所述的DNA纳米三脚架采用以下方式组装制备：取1×TAE–Mg2+缓冲溶液作为反应缓冲溶液，缓冲溶液pH为8.0，包含40mM的Tris，20mM的acetic acid，2mM的EDTA和12.5mM的Mg(CH3COO)2；将修饰中心链C-5′-ROX和三个信号接收链L1、L2、L3加入到反应缓冲溶液中，按1:1:1:1的摩尔比在PCR管中混匀，使用PCR仪退火杂交按照以下退火过程处理：95℃/5min，65℃/30min，50℃/30min，37℃/30min，22℃/30min，4℃/30min。
退火后获得DNA纳米三脚架贮存液，浓度为200nM，4℃避光保存备用。
所述的DNA纳米三脚架中，三个信号接收链L1、L2、L3将修饰中心链C-5′-ROX折成一个等边三角形，使修饰中心链C-5′-ROX的中心链C3′端和5′端在信号接收链L2的中间处会合，并且在磷酸骨架上形成一个缺口；
所述的DNA纳米三脚架中，三个信号接收链L1、L2、L3的一侧部分分别和修饰中心链C-5′-ROX的等边三角形的三条边互补配对杂交，三个信号接收链L1、L2、L3连接到中心链后，中心链的三条边为三段等长的DNA双链，长度约为2个螺旋重复单位(21个碱基对(bp)，中心链的三个角上均设置不与三个信号接收链L1、L2、L3杂交的T碱基作为铰链，使中心链三条边的三段DNA双链两两形成60°的折角；三个信号接收链L1、L2、L3的另一侧部分分别和多个信号输入链I1、I2、I3互补配对杂交。
所述的DNA纳米三脚架具体组建结构如下：
所述的DNA纳米三脚架和三个信号输入链I1、I2、I3杂交后具体结构如下：
本发明所设计的DNA序列如下：
本发明的DNA纳米三脚架(DNA nanotripod)和多个单链DNA序列的特殊构建，能通过组合输入信号输入链联合调控荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用，同时实现多种分子逻辑运算，进而实现分子逻辑运算体系的构建。
构建的分子逻辑门包括三输入majority逻辑门、两输入XOR逻辑门、10以内自然数中合数的筛选分子逻辑运算体系以及细胞裂解液中运行的三输入majority逻辑门；
1、通过设定多个信号输入链I1、I2、I3的不同组合输入，根据归一化荧光值和阈值判断组建majority逻辑门。
2、通过设定两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2的不同组合输入，根据归一化荧光值和阈值判断组建两输入XOR逻辑门：
两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2的中间部分能分别和信号接收链L1、L2未和中心链连接的另一侧部分互补配对杂交，两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2的两端部分能互补配对杂交，在两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2同时存在的情况下两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2之间能相比各自与信号接收链连接更优先地相互杂交，形成除中间部分外两端完全互补的双链DNA，而使得改造信号输入链XOR I1、XOR I2无法杂交到信号接收链上。
3、通过设定信号输入链I1、信号输入链I3、改造信号输入链XOR I1和改造信号输入链XOR I2的不同组合输入，根据归一化荧光值和阈值判断组建10以内自然数中合数筛选分子逻辑运算体系。
建立分子逻辑运算体系用于10以内自然数中合数的筛选时，将0至9这10个十进制数编码成二进制数使用的是格雷码(Binary Gray Code)。
4、细胞裂解液中运行三输入majority逻辑门时，反应体系中含有10万细胞/毫升HeLa细胞裂解液。
三输入majority逻辑门的运行。在EP管中加入20μL DNA nanotripod贮存液、50μLH2O和10μL氧化石墨烯水溶液，混匀，并于常温下孵育10min。将各信号输入链I1、I2和I3，分别单独加入或者两两组合加入或者三者全部加入，然后用水将反应样品体积补齐至100μL，使体系中DNA nanotripod终浓度为40nM，各信号输入链终浓度为200nM。将样品混匀，并于37℃孵育30min。之后，取95μL样品转移至比色皿中常温下测量样品荧光。荧光测量使用QuantaMasterTM荧光分光光度计(Canada)，激发波长和发射波长分别设置为588nm和603nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度分别设置为5nm和5nm。取20μL DNA nanotripod贮存液，用水稀释至100μL并测量其荧光，取均值，并将均值归为1.0，然后以此为标准，将各样品的荧光值做归一化处理。输入DNA链的加入与否分别定义为“1”和“0”，归一化的荧光值0.60定为阈值，荧光值小于0.60时定义逻辑输出为“0”，荧光值大于0.60时定义逻辑输出为“1”。
在此基础上，通过简单改造I1链和I2链的碱基序列，并利用I3，构建两输入的XOR逻辑门，进一步，通过组合使用majority逻辑门和XOR逻辑门的信号输入链构建了分子逻辑运算体系，建立模型筛选10以内自然数中合数，即：将多个目标物按照其属性从复杂体系中筛选出来。两输入XOR逻辑门、分子逻辑运算体系以及细胞裂解液中三输入majority逻辑门的运行使用其对应的信号输入链，操作方法及数据处理方式与majority逻辑门相同。
作为优选，DNA纳米三脚架使用终浓度为40nM。
作为优选，各信号输入链使用终浓度为200nM。
作为优选，氧化石墨烯使用终浓度为20.0ug/mL。
本发明的技术效果是：
利用DNA纳米技术将三个DNA探针组装成了一个DNA纳米三脚架，通过联合调节三脚架三条DNA腿与氧化石墨烯的亲和性，在纳米尺度上调控其负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用，从而构建了一个三输入的majority逻辑门。
随着信号接收通道的增多，一个逻辑门能接收和处理更多的信息，因此三输入的majority逻辑门可以作为一个多功能的基本模块构建其他两输入逻辑门。通过简单改造I1和I2的序列，并利用I3，构建了一个两输入的XOR逻辑门。
进一步，充分利用该计算模块并组合使用majority逻辑门和XOR逻辑门的信号输入链，建立了一个分子逻辑运算体系，用于筛选10以内自然数中的合数。
自组装DNA纳米三脚架在复杂生物基质中具有一定的抗干扰能力，在含有10万细胞/毫升HeLa细胞裂解液的反应体系中成功执行了majority逻辑门运算。
附图说明
图1为本发明DNA纳米三脚架在纳米尺度上调控其负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用原理图。
图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳验证DNA纳米三脚架的组装及其三个单链信号接收通道对信号输入链的识别。
图3为以I1、I2和I3为输入信号的三输入majority逻辑门。
图4为以XOR I1和XOR I2为输入信号的两输入XOR逻辑门。
图5为以DNA纳米三脚架和氧化石墨烯作为分子计算平台构建的分子逻辑运算体系。
图6为以I1、I2和I3为输入信号在细胞裂解液中运行的三输入majority逻辑门。
图7为10以内自然数中的合数分子逻辑门的逻辑框图。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明的实施例如下：
以下各个实施例中的DNA纳米三脚架采用以下方式组装制备：在含有1×TAE–Mg2+缓冲溶液(40mM Tris，pH 8.0，20mM acetic acid，2mM EDTA，12.5mM Mg(CH3COO)2)的反应体系中，将修饰中心链C-5′-ROX与L1、L2以及L3按1:1:1:1的摩尔比在PCR管中混匀，然后使用PCR仪退火杂交，组装纳米三脚架，具体退火过程为95℃/5min，65℃/30min，50℃/30min，37℃/30min，22℃/30min，4℃/30min。利用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳确认DNA纳米三脚架的组装，并验证其三条单链DNA腿作为信号接收通道识别信号输入链的能力，结果如图2所示。组装好的DNA纳米三脚架贮存液浓度为200nM，4℃避光保存备用。
实施例的DNA纳米三脚架的中心链C的碱基序列为SEQ ID NO.1，三个信号接收链L1、L2、L3的碱基序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。
实施例1
利用DNA纳米三脚架调控其负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用，构建majority逻辑门。
取8支EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7和8，向其中加入20μL浓度为200nM的DNAnanotripod贮存液、50μL H2O和10μL预先超声分散好的浓度为200.0ug/mL的氧化石墨烯水溶液，混匀，并于常温下孵育10min。
然后，不加信号输入链或者将信号输入链I1、I2和I3分别单独加入或者两两组合加入或者全部加入，三脚架的单链腿作为信号接收通道，接收到对应的信号输入链并与之杂交形成双链，从氧化石墨烯表面解吸附下来，使DNA纳三脚架在氧化石墨烯表面的状态不同，从而调控其负载的荧光基团与氧化石墨烯的相互作用，给出不同的荧光信号。具体处理如下。
向1号管中加入20μL H2O，混匀；向2号管中加入4μL浓度为5μM的I1链和16μL H2O，混匀；向3号管中加入4μL浓度为5μM的I2链和16μL H2O，混匀；向4号管中加入4μL浓度为5μM的I3链和16μL H2O，混匀；向5号管中加入4μL浓度为5μM的I1链、4μL浓度为5μM的I2链和12μL H2O，混匀；向6号管中加入4μL浓度为5μM的I1链、4μL浓度为5μM的I3链和12μL H2O，混匀；向7号管中加入4μL浓度为5μM的I2链、4μL浓度为5μM的I3链和12μL H2O，混匀；向8号管中加入4μL浓度为5μM的I1链、4μL浓度为5μM的I2链、4μL浓度为5μM的I3链和8μL H2O，混匀。
将各样品管置于生化培养箱，37℃孵育30min。
取95μL样品转移至比色皿中常温下测量样品荧光。
每个样品平行做3次。
各样品的测定结果表明，将I1、I2和I3分别单独加入，两两组合加入以及全部加入后，样品荧光恢复程度不同，总体趋势是越多的信号通道接收到输入信息，荧光恢复越多。未接收到信号输入链时，荧光被淬灭至原始荧光强度的10％以下，而三个信号通道接收到信号输入链后，荧光恢复至原始荧光强度的90％以上。
将各样品的测定结果进行归一化处理并作图，结果如图3(a)所示，1号、2号、3号和4号管的归一化荧光值均低于0.6，输出为“0”；5号、6号、7号和8号管的归一化荧光值均高于0.6，输出为“1”。逻辑运算的真值表如图3(b)所示，该真值表符合三输入majority逻辑门。结果表明，按照本发明的方法，成功构建了majority逻辑门，图3(c)是该三输入majority逻辑门的电路图。
本实施实例中，多个信号输入链I1、I2、I3的碱基序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7，即I1的序列为GGTTCTGAATGCTGAC；I2的序列为CCAATCCTTCGAGATG；I3的序列为ATCGCTAGTGAGGGTA。
实施例2
两输入XOR逻辑门的构建
取4支EP管，分别编号为1、2、3和4，向其中加入20μL浓度为200nM的DNAnanotripod贮存液、4μL浓度为5μM的I3链、46μL H2O和10μL预先超声分散好的浓度为200.0ug/mL的氧化石墨烯水溶液，混匀，并于常温下孵育10min，并做以下处理。
向1号管中加入20μL H2O，混匀；向2号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I1链和16μLH2O，混匀；向3号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I2链和16μL H2O，混匀；向4号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I1链、4μL浓度为5μM的XOR I2链和12μL H2O，混匀。
将各样品管置于生化培养箱，37℃孵育30min。
取95μL样品转移至比色皿中常温下测量样品荧光。
每个样品平行做3次。
将各样品的测定结果进行归一化处理并作图，结果如图4所示，1号管、4号管的归一化荧光值低于0.6，输出为“0”；2号管、3号管的归一化荧光值均高于0.6，输出为“1”。结果表明，按照本发明的方法，成功构建了两输入XOR逻辑门。
本实施实例中，两条改造信号输入链XOR I1和XOR I2的碱基序列分别为SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9，即XOR I1的序列为ATGTCACGTCGGTTCTGAATGCTGACTTGGTGAGTCGTAC；XORI2的序列为GTACGACTCACCAATCCTTCGAGATGAACCGACGTGACAT。
实施例3
筛选10以内自然数中合数的分子逻辑运算体系的构建
首先，按照格雷码的编码规则将每个十进制数被转换成一个四位二进制数(G4G3G2G1)。然后，将构建简单逻辑门时用到的输入单链I1、I3、XOR I2和XOR I1分别分配给G4、G3、G2和G1。G4、G3、G2和G1为0时表示无输入，为1时表示有输入。
取10支EP管，分别编号为0、1、2、3、4、5、6、7、8和9，向其中加入20μL浓度为200nM的DNA nanotripod贮存液、50μL H2O和10μL预先超声分散好的浓度为200.0ug/mL的氧化石墨烯水溶液，混匀，并于常温下孵育10min，并做以下处理。
向0号管中加入20μL H2O，混匀；向1号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I1链和16μLH2O，混匀；向2号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I1链、4μL浓度为5μM的XOR I2链和12μL H2O，混匀；向3号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I2链和16μL H2O，混匀；向4号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I2链、4μL浓度为5μM的I3链和12μL H2O，混匀；向5号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I1链、4μL浓度为5μM的XOR I2链、4μL浓度为5μM的I3链和8μL H2O，混匀；向6号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I1链、4μL浓度为5μM的I3链和12μL H2O，混匀；向7号管中加入4μL浓度为5μM的I3链和16μL H2O，混匀；向8号管中加入4μL浓度为5μM的I3链、4μL浓度为5μM的I1链和12μL H2O，混匀；向9号管中加入4μL浓度为5μM的XOR I1链、4μL浓度为5μM的I3链、4μL浓度为5μM的I1链和8μL H2O，混匀。
将各样品管置于生化培养箱，37℃孵育30min。
取95μL样品转移至比色皿中常温下测量样品荧光。
每个样品平行做3次。
将各样品的测定结果进行归一化处理并作图，结果如图5所示，0号管、1号管、2号管、3号管、5号管和7号管的归一化荧光值均低于0.6，输出为“0”；4号管、6号管、8号管和9号管的归一化荧光值高于0.6，输出为“1”。结果表明，按照本发明的方法，构建的逻辑运算体系可以成功地筛选出10以内自然数中的合数。逻辑原理如图7所示。
实施例4
细胞裂解液中majority逻辑门的构建
取8支EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7和8，向其中加入20μL浓度为200nM的DNAnanotripod贮存液、40μL H2O、10μL浓度为100万细胞/mL的细胞裂解液和10μL预先超声分散好的浓度为200.0ug/mL的氧化石墨烯水溶液，混匀，并于常温下孵育10min，然后做以下处理。
向1号管中加入20μL H2O，混匀；向2号管中加入4μL浓度为5μM的I3链和16μL H2O，混匀；向3号管中加入4μL浓度为5μM的I2链和16μL H2O，混匀；向4号管中加入4μL浓度为5μM的I2链、4μL浓度为5μM的I3链和12μL H2O，混匀；向5号管中加入4μL浓度为5μM的I1链和16μL H2O，混匀；向6号管中加入4μL浓度为5μM的I1链、4μL浓度为5μM的I3链和12μL H2O，混匀；向7号管中加入4μL浓度为5μM的I1链、4μL浓度为5μM的I2链和12μL H2O，混匀；向8号管中加入4μL浓度为5μM的I1链、4μL浓度为5μM的I2链、4μL浓度为5μM的I3链和8μL H2O，混匀。
将各样品管置于生化培养箱，37℃孵育30min。
取95μL样品转移至比色皿中常温下测量样品荧光。
每个样品平行做3次。
将各样品的测定结果进行归一化处理并作图，结果如图6所示，1号、2号、3号和5号管的归一化荧光值均低于0.6，输出为“0”；4号、6号、7号和8号管的归一化荧光值均高于0.6，输出为“1”。结果表明，按照本发明的方法，在细胞裂解液中成功运行了majority逻辑门。
本实施实例中I1、I2和I3的序列同实施例1。
本发明中涉及到的基因序列如下：
SEQ ID NO.1：中心链C的碱基序列
来源：人工合成
AGGCACCATCGTGGAGTGTCACGGTGCATGGCTTGCGACTGCTACGGACGCTCTCTAGGTCTTGCC
SEQ ID NO.2：信号接收链L1的碱基序列
来源：人工合成
AGCCATGCACCGTGACACTCCTGTCAGCATTCAGAACC
SEQ ID NO.3：信号接收链L2的碱基序列
来源：人工合成
CGATGGTGCCTGGCAAGACCTTCATCTCGAAGGATTGG
SEQ ID NO.4：信号接收链L3的碱基序列
来源：人工合成
GAGAGCGTCCGTAGCAGTCGCTTACCCTCACTAGCGAT
SEQ ID NO.5：信号输入链I1的碱基序列
来源：人工合成
GGTTCTGAATGCTGAC
SEQ ID NO.6：信号输入链I2的碱基序列
来源：人工合成
CCAATCCTTCGAGATG
SEQ ID NO.7：信号输入链I3的碱基序列
来源：人工合成
ATCGCTAGTGAGGGTA
SEQ ID NO.8：改造信号输入链XOR I1的碱基序列
来源：人工合成
ATGTCACGTCGGTTCTGAATGCTGACTTGGTGAGTCGTAC
SEQ ID NO.9：改造信号输入链XOR I2的碱基序列
来源：人工合成
GTACGACTCACCAATCCTTCGAGATGAACCGACGTGACAT。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系及方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcaccatc gtggagtgtc acggtgcatg gcttgcgact gctacggacg ctctctaggt 60
cttgcc 66
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agccatgcac cgtgacactc ctgtcagcat tcagaacc 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgatggtgcc tggcaagacc ttcatctcga aggattgg 38
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagagcgtcc gtagcagtcg cttaccctca ctagcgat 38
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttctgaat gctgac 16
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaatccttc gagatg 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcgctagtg agggta 16
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtcacgtc ggttctgaat gctgacttgg tgagtcgtac 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtacgactca ccaatccttc gagatgaacc gacgtgacat 40

Claims (10)

1.一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系，其特征在于：包括氧化石墨烯、DNA纳米三脚架(DNA nanotripod)和多个单链DNA序列，DNA纳米三脚架包括一条中心链与三条边链，一条中心链通过三条边链其中的一部分杂交形成中心三角形，三条边链的剩余部分分别从中心三角形三个顶点延伸出来形成单链DNA腿，利用DNA末端修饰使中心链负载荧光基团ROX，以纳米三脚架的单链DNA腿作为信号接收链，多个单链DNA序列作为信号输入链分别与三个信号接收链互补杂交；信号接收链在未与信号输入链杂交时吸附于氧化石墨烯表面，信号接收链在与信号输入链杂交变成双链后从氧化石墨烯表面解吸附。
2.根据权利要求1所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系，其特征在于：所述的DNA纳米三脚架的中心链的碱基序列为SEQ IDNO.1，三个信号接收链的碱基序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。
3.根据权利要求2所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系，其特征在于：所述的DNA纳米三脚架组装结构如下：
4.根据权利要求1所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系，其特征在于：所述的多个信号输入链为两条改造信号输入链XOR I1、XOR I2，碱基序列分别为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9；通过设定两个改造信号输入链XORI1、XOR I2的不同组合输入并利用I3，组建两输入XOR逻辑门。
5.根据权利要求1所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系，其特征在于：所述的多个信号输入链为信号输入链I1、信号输入链I3、改造信号输入链XOR I1和改造信号输入链XOR I2，碱基序列分别为SEQ ID NO.5、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9；通过设定信号输入链I1、信号输入链I3、改造信号输入链XOR I1和改造信号输入链XOR I2的不同组合输入，组建逻辑运算体系筛选10以内自然数中的合数。
6.根据权利要求1所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑运算体系，其特征在于：所述的分子逻辑门的运行在100μL反应体系中进行，DNA纳米三脚架使用终浓度为40nM，氧化石墨烯使用终浓度为20.0ug/mL，信号输入链使用终浓度为200nM。
7.一种基于DNA纳米三脚架调控荧光小分子与氧化石墨烯的相互作用构建分子逻辑门的方法，其特征在于：先利用DNA末端修饰在中心链C的5′末端接上荧光基团ROX形成修饰中心链C-5′-ROX，再组装一个DNA纳米三脚架(DNA nanotripod)；以纳米三脚架的单链DNA腿作为信号接收链，识别多个作为信号输入链的单链DNA序列；
当DNA纳米三脚架的信号接收链未接收到信号输入链时，即未与信号输入链杂交时为单链时为单链，会吸附于氧化石墨烯表面；当DNA纳米三脚架的信号接收链连接与信号输入链杂交后，即接收到信号输入链并形成双链，从氧化石墨烯表面解吸附；通过单个信号输入链的是否加入控制DNA纳米三脚架上所对应的单个信号接收链和氧化石墨烯表面吸附或者解吸附；
当不同信号输入链以不同组合输入时，使DNA纳米三脚架在氧化石墨烯的表面的状态不同，从而调控DNA纳米三脚架上所负载的荧光基团ROX与氧化石墨烯的相互作用，产生不同的荧光信号，实现了多种分子逻辑运算。
8.根据权利要求7所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光分子与氧化石墨烯相作用的分子逻辑门的方法，其特征在于：
所述的DNA纳米三脚架采用以下方式组装制备：取1×TAE–Mg2+缓冲溶液作为反应缓冲溶液，缓冲溶液pH为8.0，包含40mM的Tris，20mM的acetic acid，2mM的EDTA和12.5mM的Mg(CH3COO)2；将修饰中心链C-5′-ROX和三个信号接收链L1、L2、L3加入到反应缓冲溶液中，按1:1:1:1的摩尔比在PCR管中混匀，使用PCR仪退火杂交按照以下退火过程处理：95℃/5min，65℃/30min，50℃/30min，37℃/30min，22℃/30min，4℃/30min。
9.根据权利要求7所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光小分子与氧化石墨烯的相互作用构建分子逻辑门的方法，其特征在于：
所述的DNA纳米三脚架中，三个信号接收链L1、L2、L3将修饰中心链C-5′-ROX折成一个等边三角形，使修饰中心链C-5′-ROX的中心链C3′端和5′端在信号接收链L2的中间处会合，并且在磷酸骨架上形成一个缺口；
所述的DNA纳米三脚架中，三个信号接收链L1、L2、L3的一侧部分分别和修饰中心链C-5′-ROX的等边三角形的三条边互补配对杂交，三个信号接收链L1、L2、L3连接到中心链后，中心链的三条边为三段等长的DNA双链，长度约为2个螺旋重复单位(21个碱基对(bp)，中心链的三个角上均设置不与三个信号接收链L1、L2、L3杂交的T碱基作为铰链，使中心链三条边的三段DNA双链两两形成60°的折角；三个信号接收链L1、L2、L3的另一侧部分分别和多个信号输入链I1、I2、I3互补配对杂交。
10.根据权利要求7所述的一种基于DNA纳米三脚架调控荧光小分子与氧化石墨烯的相互作用构建分子逻辑门的方法，其特征在于：构建的分子逻辑门包括majority逻辑门、两输入XOR逻辑门、10以内自然数中合数筛选分子逻辑运算体系；
1)通过设定两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2的不同组合输入，根据归一化荧光值和阈值判断组建两输入XOR逻辑门：两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2的中间部分能分别和信号接收链L1和信号接收链L2未和中心链连接的另一侧部分互补配对杂交，两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2的两端部分能相互互补配对杂交，在两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2同时存在的情况下两个改造信号输入链XOR I1、XOR I2之间能相比各自与信号接收链连接更优先地相互杂交，形成除中间部分外两端完全互补的双链DNA，而使得改造信号输入链XOR I1、XOR I2无法杂交到信号接收链上；
2)通过设定信号输入链I1、信号输入链I3、改造信号输入链XOR I1和改造信号输入链XOR I2的不同组合输入，根据归一化荧光值和阈值判断组建10以内自然数中合数筛选分子逻辑运算体系。
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