CN109276577B - 一种一氧化氮纳米复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医用材料技术领域，提供一种一氧化氮纳米复合水凝胶，由载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液和凝胶基体混合构成，凝胶基体包括海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油，混合构成的凝胶中含有Eudragit RS PO负载GSNO的纳米粒。本发明还提供一种前述一氧化氮纳米复合水凝胶的制备方法以及在生物医用材料领域中的应用。本发明针对皮肤创伤愈合中的炎症期和增生期两个关键时期，以海藻酸钠为基体相、Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO的纳米粒为分散相，构建一种一氧化氮纳米复合水凝胶，通过在创伤部位释放一氧化氮，分别在创伤修复的炎症期促进新生血管的生成及成纤维细胞的生成，以及在创伤愈合的增生期促进胶原纤维的生成来达到有效促进皮肤创伤愈合的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种一氧化氮纳米复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是哺乳动物中最大的器官，包括整个身体表面和与外部环境接触的部分，它不仅能够作为机体的保护屏障，而且在维持哺乳动物机体的生理稳态中有着至关重要的作用。皮肤完整性损伤使个体容易生理失衡，机体在良好的环境下具有自愈能力，皮肤的创伤愈合过程由各种生物因素调控，主要分为三个阶段：炎症和收缩反应阶段：建立体内的免疫应答，溶解、清除坏死组织和渗出物；肉芽组织修复阶段：结缔组织细胞和血管内皮细胞游动、增值、形成肉芽组织；组织重塑阶段：新生结缔组织基质沉积和新生组织重构。在愈合的各阶段都需要多方面生理机能的参与，如果这些机能出现障碍将直接影响创面的愈合过程，机能严重障碍则会导致伤口恶化。糖尿病足则是一种典型的皮肤溃疡疾病，严重者会导致残疾甚至死亡，将给患者及其家庭带来重大的痛苦。因此对皮肤创伤愈合的探究，能为糖尿病足等其他皮肤创伤疾病提供新的治疗策略，也将是此类患者的一大福音，意义重大。
皮肤创伤愈合过程具体而言，在皮肤创面形成后，内皮暴露，胶原蛋白和组织因子会促使血小板聚集，导致细胞脱粒和趋化因子、生长因子的释放并凝集成块以达到止血的目的。随后，血小板和神经末梢释放组胺、P物质等活性因子，引起中性粒细胞在伤口局部的聚集，清除坏死组织和细菌，为伤口的愈合提供良好的条件。同时生长因子释放以调节成纤维细胞、角质形成细胞、血管内皮细胞的活化和增殖，形成大量的新生毛细血管。成纤维细胞也分泌胶原和细胞外基质共同构成了肉芽组织，取代之前所形成的凝块。随着角质形成细胞的大量增殖，创面逐渐被覆盖，新细胞的生成与细胞凋亡达到平衡，创面进入组织重塑期，最终伤口愈合。在愈合的各阶段都需要多方面生理机能的参与，如果这些机能出现障碍将直接影响创面的愈合过程，机能严重障碍则会导致伤口恶化。在之前创伤愈合的研究机制中，研究较多的是生长因子与创伤愈合的关系，目前已被证实具有促进创伤愈合作用的生长因子有成纤维细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子，血小板源性生长因子，转化生长因子β，表皮生长因子等。也有较多研究表明黏附分子具有促进创伤愈合的作用，如选择素家族、整合素家族、免疫球蛋白超家族等。
近年来将一氧化氮(Nitric Oxide，NO)应用于创伤愈合这一理念受到了极大的关注与重视，NO与NO供体(NO donors)如sydnonimines、diazeniumdiolates、S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)及载有NO的纳米粒子(NO-containing nanoparticles)均被证实可以在不同程度上促进创伤愈合。NO是由一氧化氮合酶(Nitric OxideSynthase，NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)和分子氧为底物，催化L-Arg的2个等价胍基氮之一，生成L-瓜氨酸而释放出来的小分子。作为一种气体信号分子，NO在体内调节创伤愈合的机制较为复杂。NO可以通过激活可溶性鸟苷酸环化酶，升高细胞内环鸟苷酸(cGMP)水平，还能够通过非cGMP依赖性途径影响基因转录，刺激早期反应基因表达或抑制核因子NF-κB激活，调节mRNA转录和蛋白质翻译。此外NO还可以通过与细胞因子相互作用来参与创伤愈合。而在创伤愈合的三个阶段，NO分别有不同的作用:在炎症阶段，NO介导血管舒张和抗血小板作用；在增殖期，NO促进上皮再生和新生血管的形成；在最后的重塑步骤中，NO能够作为胶原蛋白沉积的增强剂。因此，NO用于伤口愈合的有效性和生物相容性疗法已经引起关注。
在此前的报道中已有提及，NO可以通过复杂的尚不明确的机制参与调控创面愈合并加速皮肤创伤愈合，但NO为气体分子，在临床上直接用于创伤愈合较为困难，因此选用NO供体释放NO来解决这一问题。本发明的发明人经过研究发现，GSNO作为一种内源性NO供体，其具有良好的生物相容性，并能有效促进皮肤创伤愈合，但是由于GSNO的半衰期短，化学性质较不稳定，而如何对其进行保护，提高其稳定性以满足储存和临床应用需要，达到制备出促进皮肤创伤愈合的合适递药系统，成为亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术中由于GSNO的半衰期短，化学性质较不稳定，如何对其进行保护，提高其稳定性以满足储存和临床应用需要，达到制备出促进皮肤创伤愈合的合适递递药系统的技术问题，本发明提供一种一氧化氮纳米复合水凝胶，其以海藻酸钠为凝胶基质，使用丙烯酸树脂Eudragit RS PO作为载药材料来包封GSNO，达到对GSNO稳定保护的作用，制备出促进皮肤创伤愈合的GSNO纳米复合水凝胶递药系统，探索其对创伤愈合的促进意义。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一种一氧化氮纳米复合水凝胶，由载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液和凝胶基体混合构成，所述凝胶基体包括海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油，所述混合构成的凝胶中含有Eudragit RS PO负载GSNO的纳米粒。
进一步，所述载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液、海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油的质量比为(40～70)：(10～20)：(10～15)：(5～10)。
与现有技术相比，本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶，能够保持创面部位的湿润程度，将创面与空气隔绝，可以抵抗细菌感染，并且具有良好的生物相容性；同时，本发明提供的复合水凝胶中含有载GSNO的纳米粒，因而能持续释放一氧化氮，促进创伤部位血管新生，促进成纤维细胞和胶原纤维的生成，从而达到促进伤口愈合的目的。
本发明还提供一种一氧化氮纳米复合水凝胶制备方法，包括以下步骤：
S1、Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO纳米悬浮液的制备：
S11、分别称量重量为100～500mg的Eudragit RS PO和重量为5～10mg的GSNO，将Eudragit RS PO溶解于体积为5～10ml的丙酮中，GSNO溶解于体积为0.5～2ml的含F68的水溶液中；
S12、将步骤S11中GSNO的水溶液缓慢滴加至Eudragit RS PO的丙酮溶液中，得到Eudragit RS PO-GSNO的混合溶液；
S13、将步骤S12中的混合溶液用注射器滴加至体积为20～40ml的含F68的水溶液中，边滴加边在磁力搅拌器上搅拌，滴加完后继续搅拌；
S14、在步骤S13搅拌结束后使用旋转蒸发仪在避光空旋的条件下旋转蒸发去除混合溶液中的全部丙酮，丙酮全部去除后得到白色乳光的纳米悬浮液；
S15、使用超滤离心法去掉步骤S14中纳米悬浮液的游离药物，将得到的体积为5～20ml纳米悬浮液加入超滤离心管中，在高速离心机中进行离心，截留在超滤离心管中的即为所得纳米粒；
S16、将步骤S15中所得的纳米粒用体积为1～2ml超纯水重悬，得到载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液；
S2、一氧化氮纳米复合水凝胶的制备：
搅拌条件下，在步骤S16中所得的纳米悬浮液中加入海藻酸钠，混合均匀后再加入氯化钙溶液和甘油，再混合均匀即可得到一氧化氮纳米复合水凝胶；其中，所述纳米悬浮液、海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油的质量比为(40～70)：(10～20)：(10～15)：(5～10)。
进一步，所述步骤S11和步骤S13含F68的水溶液中，所述F68的质量百分比浓度为0.1～0.5％。
进一步，所述步骤S13中注射器的针头孔径为18G～27G，所述注射器滴加的速度为1～1.5ml/min。
进一步，所述步骤S13中磁力搅拌器的搅拌速度为1000～2500rpm，滴加完后继续搅拌的时间为25～45min。
进一步，所述步骤S15中超滤离心管的截留分子量为3000D～10000D。
进一步，所述步骤S15中在高速离心机中进行离心的离心力为3000～5000g，离心时间为30～60min，离心温度为4℃。
进一步，所述步骤S2中，海藻酸钠的质量百分比浓度为1～3％，氯化钙溶液的质量百分比浓度为0.3～0.5％，甘油的质量百分比浓度为80～100％。
与现有技术相比，本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶制备方法重复性好，可操作性强，该方法以海藻酸钠为凝胶基质，NO供体GSNO为主药，使用丙烯酸树脂EudragitRS PO作为载药材料来包封GSNO，达到对NO供体GSNO稳定保护的作用，制备出促进皮肤创伤愈合的GSNO纳米复合水凝胶递药系统，能够使NO缓慢释放，达到促进创伤愈合的目的。
本发明再提供一种一氧化氮纳米复合水凝胶在生物医用材料领域中的应用。具体可将一氧化氮纳米复合水凝胶涂抹在小鼠背部皮肤的创伤部位，通过在创伤部位释放一氧化氮，分别在创伤修复的炎症期促进新生血管的生成及成纤维细胞的生成，和在创伤愈合的增生期促进胶原纤维的生成来达到有效促进皮肤创伤愈合的目的，具有显著的创伤愈合作用。
附图说明
图1是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶的示意图。
图2是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶的SEM图。
图3是本发明提供的Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO的纳米粒对GSNO的释放动力学曲线图。
图4是本发明提供的Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO纳米粒的粒径分布图。
图5是本发明提供的Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO纳米粒的SEM图。
图6是本发明提供的海藻酸钠水凝胶的SEM图。
图7是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶对不同组小鼠创伤部位愈合作用示意图。
图8是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶对不同组小鼠创伤部位第4天时的HE染色图。
图9是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶对不同组小鼠创伤部位第7天时的HE染色图。
图10是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶对不同组小鼠创伤部位第4天时的Masson染色图。
图11是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶对不同组小鼠创伤部位第7天时的Masson染色图。
图12是本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶对于小鼠创伤部位愈合的过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
请参考图1所示，本发明提供一种一氧化氮纳米复合水凝胶，由载GSNO的EudragitRS PO纳米悬浮液和凝胶基体混合构成，所述凝胶基体包括海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油，即由海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油与载有GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液混合构成凝胶，所述混合构成的凝胶中含有Eudragit RS PO负载GSNO的纳米粒。与现有技术相比，本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶，能够保持创面部位的湿润程度，将创面与空气隔绝，可以抵抗细菌感染，并且具有良好的生物相容性；同时，本发明提供的复合水凝胶中含有载GSNO的纳米粒，因而能持续释放一氧化氮，促进创伤部位血管新生，促进成纤维细胞和胶原纤维的生成，从而达到促进伤口愈合的目的。
作为优选实施例，所述载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液、海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油的质量比为(40～70)：(10～20)：(10～15)：(5～10)，由此可以使一氧化氮纳米复合水凝胶具有良好的成形性与延展性，易于涂布给药，并且该质量比例的甘油的加入能进一步促进GSNO的吸收。本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶的SEM图请参考图2所示，将Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO的纳米粒与一氧化氮纳米复合水凝胶装入截留分子量为14000D的透析袋中，用透析夹夹紧两端，放入装有0.01M PBS(PH＝5)的释放介质中，在恒温摇床中保持温度37℃，转速100rpm进行药物释放，释放介质中的GSNO通过Griess-saville方法在紫外分光光度计540nm下进行检测，得到如图3所示Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO的纳米粒对GSNO的释放动力学曲线，由图3可以看出，GSNO纳米复合水凝胶能有效释放GSNO，并持续缓慢释放达10小时。
本发明还提供一种一氧化氮纳米复合水凝胶制备方法，包括以下步骤：
S1、Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO纳米悬浮液的制备：
S11、分别称量重量为100～500mg的Eudragit RS PO和重量为5～10mg的GSNO，将Eudragit RS PO溶解于体积为5～10ml的丙酮中，GSNO溶解于体积为0.5～2ml的含F68的水溶液中；
S12、将步骤S11中GSNO的水溶液缓慢滴加至Eudragit RS PO的丙酮溶液中，得到Eudragit RS PO-GSNO的混合溶液；
S13、将步骤S12中的混合溶液用注射器滴加至体积为20～40ml的含F68的水溶液中，边滴加边在磁力搅拌器上搅拌，滴加完后继续搅拌；
S14、在步骤S13搅拌结束后使用旋转蒸发仪在避光空旋的条件下旋转蒸发去除混合溶液中的全部丙酮，丙酮全部去除后得到白色乳光的纳米悬浮液；
S15、使用超滤离心法去掉步骤S14中纳米悬浮液的游离药物，将得到的体积为5～20ml纳米悬浮液加入超滤离心管中，在高速离心机中进行离心，截留在超滤离心管中的即为所得纳米粒；其中，用布鲁克海文粒度仪检测纳米粒的粒径分布请参考图4所示，纳米粒的SEM图请参考图5所示，由图4和图5可以看出，纳米粒分布均匀，粒径约60纳米，并能高效包载GSNO(包封率约为64％)；纳米粒的表征请参见下表1：
由上表1可以看出，纳米粒的粒径约为60纳米，包封率约为64％。
S16、将步骤S15中所得的纳米粒用体积为1～2ml超纯水重悬，得到载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液；
S2、一氧化氮纳米复合水凝胶的制备：
搅拌条件下，在步骤S16中所得的纳米悬浮液中加入海藻酸钠，混合均匀后再加入氯化钙溶液和甘油，再混合均匀即可得到一氧化氮纳米复合水凝胶；其中，所述纳米悬浮液、海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油的质量比为(40～70)：(10～20)：(10～15)：(5～10)，海藻酸钠水凝胶的SEM图请参考图6所示。
作为具体实施例，所述步骤S11和步骤S13含F68的水溶液中，所述F68的质量百分比浓度为0.1～0.5％，由此可以很好地稳定GSNO，有利于GSNO的包载。
作为具体实施例，所述步骤S13中注射器的针头孔径为18G～27G，所述注射器滴加的速度为1～1.5ml/min，由此可以促进溶剂置换的发生，有利于纳米乳的形成。
作为具体实施例，所述步骤S13中磁力搅拌器的搅拌速度为1000～2500rpm，滴加完后继续搅拌的时间为25～45min，由此可以促进所形成的纳米乳呈均一分布。
作为具体实施例，所述步骤S14中旋转蒸发仪的转速为30～80rpm，由此可以避免纳米乳的聚结，有利于在挥发溶剂的同时保持纳米乳的稳定性。
作为具体实施例，所述步骤S15中超滤离心管的截留分子量为3000D～10000D，由此可以将未被包载的GSNO除去，并最大限度地截留GSNO纳米。
作为具体实施例，所述步骤S15中在高速离心机中进行离心的离心力为3000～5000g，离心时间为30～60min，离心温度为4℃，由此可以在保障GSNO的稳定性的前提下将GSNO纳米粒离心收集。
作为具体实施例，所述步骤S2中，海藻酸钠的质量百分比浓度为1～3％，氯化钙溶液的质量百分比浓度为0.3～0.5％，甘油的质量百分比浓度为80～100％，由此可以让最终的凝胶保持良好的形态，并且甘油的加入能促进皮肤对GSNO的吸收。
与现有技术相比，本发明提供的一氧化氮纳米复合水凝胶制备方法重复性好，可操作性强，该方法以海藻酸钠为凝胶基质，NO供体GSNO为主药，使用丙烯酸树脂EudragitRS PO作为载药材料来包封GSNO，达到对NO供体GSNO稳定保护的作用，制备出促进皮肤创伤愈合的GSNO纳米复合水凝胶递药系统，能够使NO缓慢释放，达到促进创伤愈合的目的。
本发明再提供一种一氧化氮纳米复合水凝胶在生物医用材料领域中的应用。具体可将一氧化氮纳米复合水凝胶涂抹在小鼠背部皮肤的创伤部位，通过在创伤部位释放一氧化氮，分别在创伤修复的炎症期促进新生血管的生成及成纤维细胞的生成，和在创伤愈合的增生期促进胶原纤维的生成来达到有效促进皮肤创伤愈合的目的，具有显著的创伤愈合作用。
为了更好地理解本发明的一氧化氮纳米复合水凝胶在生物医用材料领域中的应用，以下将结合体内动物实验来验证一氧化氮纳米复合水凝胶是否具有促进创伤愈合的作用，实验具体包括以下步骤：
第一、称重分组，将体重为20至30g，周龄在6至8周的昆明小鼠48只，随机分为4组，分别为对照组、GSNO的PBS溶液组、空白纳米复合凝胶组和一氧化氮纳米复合凝胶组。
第二、脱毛，使用0.5％戊巴比妥钠给小鼠腹腔注射进行麻醉，再使用脱毛膏给小鼠背部脱去毛发，面积大约为3×3cm，脱去毛发后用超纯水和75％酒精给脱去毛发的皮肤清洗消毒。
第三、使用皮肤活检打孔器在小鼠背部裸露的皮肤上以脊椎为中心，靠近颈部的位置左右各打一个直径为5mm的圆形的孔，再使用眼科剪和眼科镊去掉圆形的全层皮肤，即得到造模成功的皮肤创伤模型；将造模成功的小鼠放置于室温25℃的环境中单笼饲养，给与充足的食物和水。
第四、拍照记录，以手术当天为第0天，从0天到10天，每天拍照记录创面，给创面清理伤口，换药；同时在第4天和第7天时，每组各处死3只，取创面的皮肤组织，做进一步组织学HE与Masson观察。
从图7至图12所示的小鼠体内实验结果可知，本申请提供的一氧化氮纳米复合水凝胶可通过在小鼠皮肤创伤部位保持湿润，并且持续释放一氧化氮供体GSNO，在创伤炎症期促进新生血管生成，成纤维细胞生成，同时在增殖期促进胶原纤维的生成，从而达到促进创伤愈合的目的。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种一氧化氮纳米复合水凝胶，其特征在于，由载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液和凝胶基体混合构成，所述凝胶基体包括海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油，所述混合构成的凝胶中含有Eudragit RS PO负载GSNO的纳米粒，所述载GSNO的Eudragit RS PO纳米悬浮液、海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油的质量比为(40～70)：(10～20)：(10～15)：(5～10)；其中，所述一氧化氮纳米复合水凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1、Eudragit RS PO负载一氧化氮供体GSNO纳米悬浮液的制备：
S11、分别称量重量为100～500mg的Eudragit RS PO和重量为5～10mg的GSNO，将Eudragit RS PO溶解于体积为5～10ml的丙酮中，GSNO溶解于体积为0.5～2ml的含F68的水溶液中；
S12、将步骤S11中GSNO的水溶液缓慢滴加至Eudragit RS PO的丙酮溶液中，得到Eudragit RS PO-GSNO的混合溶液；
S13、将步骤S12中的混合溶液用注射器滴加至体积为20～40ml的含F68的水溶液中，边滴加边在磁力搅拌器上搅拌，滴加完后继续搅拌；
S14、在步骤S13搅拌结束后使用旋转蒸发仪在避光空旋的条件下旋转蒸发去除混合溶液中的全部丙酮，丙酮全部去除后得到白色乳光的纳米悬浮液；
S15、使用超滤离心法去掉步骤S14中纳米悬浮液的游离药物，将得到的体积为5～20ml纳米悬浮液加入超滤离心管中，在高速离心机中进行离心，截留在超滤离心管中的即为所得纳米粒，所述纳米粒分布均匀且包封率为63.38±6.13％；
S16、将步骤S15中所得的纳米粒用体积为1～2ml超纯水重悬，得到载GSNO的EudragitRS PO纳米悬浮液；
S2、一氧化氮纳米复合水凝胶的制备：
搅拌条件下，在步骤S16中所得的纳米悬浮液中加入海藻酸钠，混合均匀后再加入氯化钙溶液和甘油，再混合均匀即可得到一氧化氮纳米复合水凝胶；其中，所述纳米悬浮液、海藻酸钠、氯化钙溶液和甘油的质量比为(40～70)：(10～20)：(10～15)：(5～10)。
2.根据权利要求1所述的一氧化氮纳米复合水凝胶，其特征在于，所述步骤S11和步骤S13含F68的水溶液中，所述F68的质量百分比浓度为0.1～0.5％。
3.根据权利要求1所述的一氧化氮纳米复合水凝胶，其特征在于，所述步骤S13中注射器的针头孔径为18G～27G，所述注射器滴加的速度为1～1.5ml/min。
4.根据权利要求1所述的一氧化氮纳米复合水凝胶，其特征在于，所述步骤S13中磁力搅拌器的搅拌速度为1000～2500rpm，滴加完后继续搅拌的时间为25～45min。
5.根据权利要求1所述的一氧化氮纳米复合水凝胶，其特征在于，所述步骤S15中超滤离心管的截留分子量为3000D～10000D。
6.根据权利要求1所述的一氧化氮纳米复合水凝胶，其特征在于，所述步骤S15中在高速离心机中进行离心的离心力为3000～5000g，离心时间为30～60min，离心温度为4℃。
7.根据权利要求1所述的一氧化氮纳米复合水凝胶，其特征在于，所述步骤S2中，海藻酸钠的质量百分比浓度为1～3％，氯化钙溶液的质量百分比浓度为0.3～0.5％，甘油的质量百分比浓度为80～100％。
8.一种根据权利要求1所述一氧化氮纳米复合水凝胶在制备治疗皮肤创伤材料领域中的应用。
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