CN109265537A - 一种分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，是通过配制至少3种质量浓度为5％‑95％的离子液体，并按照离子液体极性从小到大或者从大到小的顺序，将微纤维胶原的原料依次分步放入上述顺序的离子液体中进行离子液体处理，再经过后处理即得微纤维胶原。本发明制备方法条件温和，在不超过胶原变性温度下通过对离子液体极性的调控，从而在胶原未变性的条件下，得到保持了生物活性的微纤维胶原；并且该制备方法产率可达80％，离子液体可回收重复使用，其制备所得微纤维胶原具有短纤维含量高、纯度高、生物相容性好、无毒性的特点，可直接作为生物医学材料应用于生物医学领域。
Description
技术领域
本发明属于生物材料制备技术领域，涉及一种分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法。
背景技术
胶原是一种水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架，广泛存在于脊椎动物的结缔组织(包括软组织、皮肤、肌腱、骨和软骨)中，对生物体正常生理功能的调节起着举足轻重的作用。同时，胶原作为天然高分子材料，具有其他合成材料无法比拟的生物相容性、可生物降解性及生物活性，能够促进细胞生长、促进血小板凝结，且免疫原性相对较低。溶液态胶原的变性温度为38～40℃，哺乳动物皮胶原变性温度随材料的来源略有差异，一般为60～65℃。从哺乳动物真皮中提取的胶原特有的微孔结构使得胶原材料具有很好的渗透性，有利于生物因子的生长扩散。但为了维持其生物活性，动物真皮组织中的胶原在提取过程中不能超过其热变性温度，因此只有在低温下保持了其三股螺旋结构的胶原才能广泛应用于生物医学领域。
在低于胶原变性温度下所制备的微纤维胶原也是一种天然胶原蛋白，完全保留了胶原的生物活性和微纤维的微观基本形态，但纤维的长度远低于原胶原纤维，因此它广泛应用于软骨组织工程支架材料、止血材料、骨骼修复等生物医学领域，是内源性凝血机制中的重要作用成分。微纤维胶原的临床应用已有数十年的历史，可通过腔镜用于腔隙内止血(Fujimoto Y,Kobayashi T,Komori M,et al.Modified hemostatic technique usingmicrofibrillar collagen hemostat in endoscopic endonasal transsphenoidalsurgery:technical note.Neurol Med Chir(Tokyo).2014；54(8):617-621.)，可缝合固定用于血管性出血的止血，可长期留存于体内(Struk D,Rankin RN,Karlik SJ.Stabilitystudies on chemoembolization mixtures.Dialysis studies of doxorubicin andlipiodol with Avitene,Gelfoam,and Angiostat.Invest Radiol.1993；28(11):1024-1027.)。大量的临床应用研究报道证明微纤维胶原具有良好的生物安全性(Magro-ErnicaN,Magro-Filho O,Rangel-Garcia I.Histologic study of use of microfibrillarcollagen hemostat in rat dental sockets.Braz Dent J.2003；14(1):12-15.；SirlakM,Eryilmaz S,Yazicioglu L,et al.Comparative study of microfibrillar collagenhemostat(Colgel)and oxidized cellulose(Surgicel)in high transfusion-riskcardiac surgery.J Thorac Cardiovasc Surg.2003；126(3):666-670；Watanabe G,Misaki T,Kotoh K.Microfibrillar collagen(Avitene)and antibiotic-containingfibrin-glue after median sternotomy.J Card Surg.1997；12(2):110-111；RobicsekF.Microfibrillar collagen hemostat in cardiac surgery.J Thorac CardiovascSurg.2004；127(4):1228.)。微纤维胶原同时也是一种良好的组织工程支架候选材料，因其具有高孔隙率的疏松结构和良好的生物相容性，容许软骨细胞贴附生长，并且能够引导软骨细胞分泌细胞外基质——形成软骨组织。组织学研究发现，在构建的人工软骨标本中，微纤维胶原支架材料被新生的软骨基质包裹支架和新生软骨之间无缝隙结合，已经成为了软骨基质的一部分(周丽斌，徐冰心，等.《应用微纤维胶原支架构建组织工程软骨》，中国组织工程研究，2017，21(22)：3483-3487)。
因此，随着生物医学领域的飞速发展，对微纤维胶原产量需求呈现不断增加的趋势，同时对微纤维胶原的质量要求也呈增高趋势，但现如今微纤维胶原的制备方法多存在纯度低、产率低、短纤维(纤维长度≤1mm)含量少等不足问题。
专利“一种利用离子液体混合溶剂制备胶原微纤维的方法”(申请号201310521634.7)公开了一种基于咪唑型离子液体/二甲基亚砜体系制备胶原微纤维的方法。其具体技术内容是以新鲜动物皮或脱铬后皮革废料为原料，以咪唑型离子液体/二甲基亚砜混合物为处理剂，在90～130℃下处理后得到悬浮液，经高速离心得到沉淀物，将制得的沉淀物清洗并冷冻干燥，即可获得胶原微纤维。该专利技术存在以下不足之处：
一、其制备微纤维胶原过程中的温度为90～130℃，远远超过了胶原的变性温度，丧失了生物活性，不能应用于生物医学领域；
二、其采用离子液体/二甲基亚砜体系制备微纤维胶原，二甲基亚砜具有一定的毒性且难以完全去除，因此所制备的微纤维胶原无法应用于生物医学材料；
三、制备所得微纤维胶原未经灭菌处理，具有一定的生物毒性；
四、其制备所得微纤维胶原中的短纤维(纤维长度≤1mm)含量不足，不符合生物医学材料标准，且产率不高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，该制备方法条件温和，在不超过胶原变性温度下通过对离子液体极性的调控，从而在胶原未变性的条件下，得到保持了生物活性的微纤维胶原；并且该制备方法产率可达80％，离子液体可回收重复使用，其制备所得微纤维胶原具有短纤维含量高、纯度高、生物相容性好、无毒性的特点，可直接作为生物医学材料应用于生物医学领域。
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
一种分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其制备步骤如下：
a.原料预处理：选择离体的哺乳动物真皮，并进行脱脂、脱毛处理，作为微纤维胶原的原料；
b.离子液体备料：选择配制至少3种质量浓度为5％-95％的离子液体，且所配制的任一离子液体的质量浓度与其它离子液体的质量浓度差绝对值不小于15％，其中离子液体选择纯品极性在ET(30)＝50-54kcal/mol范围内且熔点低于0℃的离子液体种类；
c.分步离子液体处理：按照离子液体极性从小到大或者从大到小的顺序，将微纤维胶原的原料依次分步放入上述顺序的离子液体中进行离子液体处理，其中每步离子液体处理分别为将微纤维胶原的原料或上一步离子液体处理所得中间产物浸没入该步所使用的离子液体中，于温度4-15℃下搅拌作用8-16h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤，作为下一步离子液体处理所使用的中间产物；最后一步离子液体处理为将上一步离子液体处理所得中间产物浸没入最后一步所使用的离子液体中，于温度4-15℃下搅拌作用8-16h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤后备用；
d.后处理：将分步离子液体处理所得进行包括冷冻干燥、灭菌的后处理，即得微纤维胶原。
其中，所述离体的哺乳动物真皮，优选为牛皮、猪皮、羊皮中的任一种。
其中，为了提高微纤维胶原的提取率，优选地，所述原料预处理还包括在脱脂、脱毛处理后进行过氧化氢处理。所述预处理中的脱脂、脱毛、过氧化氢处理，为参照现有的哺乳动物真皮预处理技术(赵帅，巩旭，等.《猪皮的不同脱脂方法对胶原提起率的影响》，中国皮革，2007，36(9)：33-36；高晓丽，刘毅，等.《黄牛皮低温酶脱毛的研究》，皮革科学与工程，2011，21(3)：47-51；付强，《天然胶原提高提取率的皮预处理方法的研究》，中国皮革，2006，35(1)：28-35)。
其中，所述离子液体选择包括1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液、1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液、1-辛基-3甲基咪唑氯盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐溶液、1-丙基-3-甲基咪唑双亚胺盐溶液和1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液中的一种或几种。
为了更好地说明本发明制备步骤，进一步地去除哺乳动物真皮中的非胶原成分，并更好地与离子液体作用，增加产物中短纤维比例，所述原料预处理包括以下步骤：
按重量份数计，将1000份离体的哺乳动物真皮加入到5000-6000份异丙醇中，震荡处理10-12h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500-1600份水和0.2-0.3份DTM198酶混合，用弱碱调pH至9.0-9.5，搅拌处理30-40min，静置，每静置1小时需搅拌1-2min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000-3500份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4-5h。
通常地，所述微纤维胶原的原料与离子液体各自的添加量在能够满足将微纤维胶原的原料完全浸没至离子液体内的情况下不进行限制，但为了更好的说明本发明，通常为根据微纤维胶原的原料添加量选择合适的作用容器，然后以重量比至少为1：10的方式添加微纤维胶原的原料和离子液体。
通常地，为了更好使得微纤维胶原的原料进行离子液体处理，所述微纤维胶原的原料在加入离子液体前，是经过清净、以及处理为通径不大于10mm的块状。
进一步地，当按照离子液体极性从大到小的顺序进行分步离子液体处理时，为了便于微纤维胶原更为均匀的疏散，所述分步离子液体处理中，随每步离子液体处理，还包括同时将每一步离子液体处理所得中间产物逐步处理减小体积，在进行最后一步离子液体处理前将上一步离子液体处理所得中间产物处理为通径2-3mm的块状。
值得说明的是，所述离子液体备料，经申请人研究发现，虽然选择的离子液体纯品的极性在ET(30)＝50-54kcal/mol范围内，但在实际制备过程中，相同质量浓度下不同种类的离子液体其作用效果具有一定的差异。因此，申请人根据实验经验总结出，所采用的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液和1-辛基-3甲基咪唑氯盐溶液为强极性的离子液体；1-丙基-3-甲基咪唑双亚胺盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液和1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液为中极性的离子液体；1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液和1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐溶液为弱极性的离子液体。通常情况下，当选择配制极性较大的离子液体时，优选强极性的离子液体，从而能够减少离子液体的用量。
优选地，为了得到短纤维含量为75.3-76.5％的微纤维胶原，所述离子液体备料为分别配制下述离子液体：质量浓度为70％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液，质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液，质量浓度为30％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液。
所述分步离子液体处理，为将微纤维胶原的原料先浸没入质量浓度为70％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用15-16h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤；将洗涤所得浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用12-13h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤；然后将洗涤所得浸没入质量浓度为30％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用9-10h，离心取沉淀并洗涤后备用。
其中，所述离心取沉淀并洗涤，为转速8000-15000rpm离心至上清液澄清为止，去上清液取沉淀，并用去离子水洗涤4-6次。
进一步地，所述离心取沉淀并洗涤，还包括在洗涤过程中伴随超声波处理。
进一步地，所述超声波处理为采用功率为10-30w的超声波设备，并每超声波处理6-10min，就停止超声波处理4-7min，重复3-5次。
其中，为了方便保存及运输和性能性能测试，通常后处理选择冷冻干燥，得到蓬松状的微纤维胶原。
其中，所述后处理中的灭菌为25kGy辐照灭菌。
其中，所述过滤出固体产物并洗涤，还包括将滤液回收，然后旋蒸除去蒸馏水后作为离子液体重复使用。
其中，所述分步离子液体处理还包括将任一步离子液体处理所得加入去垢剂处理，优选为按重量份数计，将1份离子液体处理所得与200-300份去垢剂混合，并于温度4-15℃下静置处理2-4h，静置时间到达后，用去离子水洗涤并离心取沉淀。利用去垢剂进行处理以达到有效去除杂蛋白及降低免疫原性的目的。通常，去垢剂主要选用对蛋白质变性作用较小的中性去垢剂，即非离子表面活性剂，有聚乙二醇类：如PEG200；多元醇类表面活性剂：如山梨醇、司盘类和吐温类；优选地，所述去垢剂为吐温80。
本发明主要是利用了离子液体具有极性的特点，离子液体中的阴阳离子对首先解离为自由的阳离子和阴离子，然后这些游离的阴离子与胶原肽键中—NH—上的H配合，而阳离子与胶原的肽键C＝O结合；同时由于静电力的作用，带有相反电荷的阳离子和阴离子分别与胶原侧链离子化的COO-与NH3+相互吸引键合，破坏了COO-与NH3+间原有的电价键。阳离子和阴离子与胶原分子间新形成的氢键与离子键打断了胶原分子间的氢键和离子键。因此，离子液体的极性越强，对胶原纤维的作用越强，从而所得胶原纤维长度越短。
同时，不同的离子液体因其阴阳离子的不同，具有不同的极性，对胶原纤维的作用程度不同，离子液体极性越强，对胶原纤维的作用越强；同种离子液体以不同浓度溶于水中时，对胶原纤维的作用也是不同的，胶原纤维在离子液体中的作用程度和离子液体的浓度呈现正比关系；作用时间也对胶原纤维的制备也有一定影响。
但经本发明申请人研究发现，胶原纤维与离子液体之间作用程度需要维持在一定范围内，作用程度过高容易过度破坏胶原的三股螺旋结构导致胶原蛋白丧失生物活性，从而不适宜作为生物医学材料，因此离子液体的极性和浓度不宜过大，作用时间不宜过长。
而将微纤维胶原作为生物医学材料，除了要求微纤维胶原具有生物活性，热变性温度不低于57℃，还对微纤维胶原中不同长度纤维含量具有高要求。通常认为短纤维(纤维长度≤1mm)含量在50％以上，长纤维(纤维长度2-5mm)含量在5％～10％之间时，该微纤维胶原具有较佳的生物医学功能。同时，短纤维(纤维长度≤1mm)与长纤维(纤维长度2-5mm)的含量通常呈现反比关系。
而短纤维含量低于50％时，长纤维(纤维长度2-5mm)易发生聚集，从而影响到包括止血和粘合性能等生物医学功能。但同时，短纤维含量也不能过高，当短纤维的含量超过85％时，该微纤维胶原的粘合性能会大幅下降。此外，通常规定作为生物医学材料的微纤维胶原的比表面积应大于10m2/g。产品需满足上述所有要求才能作为生物医学材料。
本发明通过在4-15℃低温下调节离子液体种类、分步作用时离子液体的浓度和作用时间，并根据所选择真皮原料不同，控制所得微纤维胶原中短纤维含量，在未变性的基础上对微纤维胶原的制备起到精准调控的作用，以满足多样化的应用需求。同时，优选采用离子液体从大到小的梯度极性，并结合逐步减小原料体积的方式，从而最大程度避免微纤维胶原丧失生物活性，并降低离子液体的使用量，降低工业化成本。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明在4-15℃低温条件下制备，所得微纤维胶原保留了未变性胶原特有的三股螺旋结构，热变性温度不低于57℃，保证了胶原蛋白的生物活性。且经灭菌处理，安全性高，重金属含量≤10mg/kg，可广泛应用于生物医学领域。
2、本发明采用分步梯度极性的离子液体处理制备微纤维胶原，通过调整离子液体种类、浓度和作用时间，使得制备所得微纤维胶原中的短纤维(纤维长度≤1mm)含量能够精确选择控制在50-80％范围内任一数值，偏差在2％以内，且长纤维(纤维长度2-5mm)含量在5-10％之间，从而满足多样化生物医学材料的需求。此外，所得微纤维胶原的比表面积大于12m2/g，完全满足生物医学材料标准。
3、本发明制备方法条件温和，在低温下采用不破坏胶原微纤维结构的适当极性离子液体进行作用，短纤维产率可达80％，且不额外引入毒性及重金属源，保障了产品的安全性。
4、本发明中所使用的离子液可以回收并重复利用。
说明书附图
图1为本发明实施例1所制得微纤维胶原的原子力显微镜照片图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。值得指出的是，给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明保护范围。
注意的是，下述实施例及对比例所制得的微纤维胶原，其纤维长度和比例、比表面积及热变性温度是通过以下设备并采用现有技术测定得到。
使用鲍尔纤维筛分仪测定微纤维胶原的纤维长度和比例。
使用比表面积测定仪测定微纤维胶原的比表面积。
使用差示扫描量热仪测定微纤维胶原的热变性温度。
使用重金属检测仪测定微纤维胶原中重金属含量。
经检测，所得微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量为50-80％，长度2-5mm的纤维含量为5-10％；比表面积大于10m2/g；热变性温度不低于57℃；重金属含量不大于10mg/kg，产品需满足上述所有要求才能作为生物医学材料。
此外，因实施例中在分步离子液体处理步骤中已经详述了离子液体种类的选择及浓度，故省去离子液体备料步骤。
实施例1
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份牛皮加入到5000份异丙醇中，震荡处理10h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500份水和0.2份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.0，搅拌处理30min，静置，每静置1小时需搅拌1-2min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4.5h，作为微纤维胶原的原料。
(2)分步离子液体处理
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为30％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用13h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为6mm的块状后，浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用11h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为3mm的块状后，浸没入质量浓度为70％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用8h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为25W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理7min，就停止超声波处理5min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量62.4％，长度2-5mm的纤维含量为9.0％；比表面积13.6m2/g；热变性温度58.7℃；重金属含量2.1mg/kg。
将制得冻干后海绵状的微纤维胶原溶以25μg/mL溶于0.5mol/L的醋酸溶液中作为样品，取15μL样品溶液滴至新鲜剥离的云母片上，室温下干燥48h，在20℃下，采用原子力显微镜对其进行观察，所得照片如图1所示。
实施例2
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份猪皮加入到5200份异丙醇中，震荡处理11h，时间到达后除去异丙醇，然后与1550份水和0.25份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.1，搅拌处理35min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3100份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4.5h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为70％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用11h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为5mm的块状后，浸没入质量浓度为50％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用9h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为2mm的块状后，浸没入质量浓度为30％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用9h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为25W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理6min，就停止超声波处理4min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
按重量份数计，将1份上述备用的离子液体处理所得与200份吐温80去垢剂混合，并于温度4-15℃下静置处理4h，静置时间到达后，用去离子水洗涤并离心取沉淀。
(3)后处理
将去垢剂处理后所得冻干处理，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量66.7％，长度2-5mm的纤维含量为7.8％；比表面积15.2m2/g；热变性温度58.9℃；重金属含量2.4mg/kg。
实施例3
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份羊皮加入到5400份异丙醇中，震荡处理12h，时间到达后除去异丙醇，然后与1540份水和0.22份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.0，搅拌处理35min，静置，每静置1小时需搅拌2min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4.5h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用8h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为5mm的块状后，浸没入质量浓度为65％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为3mm的块状后，浸没入质量浓度为80％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用11h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为15W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理8min，就停止超声波处理4min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量65.3％，长度2-5mm的纤维含量为8.1％；比表面积14.8m2/g；热变性温度58.3℃；重金属含量1.6mg/kg。
实施例4
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份牛皮加入到6000份异丙醇中，震荡处理10h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500份水和0.3份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.5，搅拌处理40min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3500份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用5h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为80％的1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用12h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为6mm的块状后，浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为3mm的块状后，浸没入质量浓度为20％的1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用8h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为25W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理7min，就停止超声波处理5min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量72.6％，长度2-5mm的纤维含量为6.3％；比表面积16.4m2/g；热变性温度57.8℃；重金属含量3.1mg/kg。
实施例5
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份牛皮加入到5500份异丙醇中，震荡处理10h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500份水和0.2份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.0，搅拌处理30min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为30％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为5mm的块状后，浸没入质量浓度为50％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用8h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为2.5mm的块状后，浸没入质量浓度为70％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用12h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为25W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理7min，就停止超声波处理5min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量67.4％，长度2-5mm的纤维含量为7.5％；比表面积15.5m2/g；热变性温度59.1℃；重金属含量2.5mg/kg。
实施例6
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份羊皮加入到5000份异丙醇中，震荡处理10h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500份水和0.23份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.0，搅拌处理30min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为70％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用16h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为6mm的块状后，浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用12h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为3mm的块状后，浸没入质量浓度为30％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为15W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理6min，就停止超声波处理4min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量75.8％，长度2-5mm的纤维含量为5.4％；比表面积17.1m2/g；热变性温度58.2℃；重金属含量3.4mg/kg。
对比例1
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份牛皮加入到5000份异丙醇中，震荡处理10h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500份水和0.2份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.5，搅拌处理40min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为25W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理7min，就停止超声波处理5min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量11.5％，长度2-5mm的纤维含量为43.7％；比表面积4.5m2/g；热变性温度58.4℃；重金属含量3.1mg/kg，因此不满足作为生物医学材料的条件。
对比例2
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份猪皮加入到5000份异丙醇中，震荡处理10h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500份水和0.2份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.0，搅拌处理30min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为95％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用8h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为6mm的块状后，浸没入质量浓度为90％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用9h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为3mm的块状后，浸没入质量浓度为85％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为25W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理7min，就停止超声波处理5min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量73.2％，长度2-5mm的纤维含量为6.0％；比表面积16.9m2/g；热变性温度48.8℃；重金属含量1.4mg/kg。所得微纤维胶原热变性温度过低，说明胶原已变性，不满足作为生物医学材料的条件。
对比例3
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份羊皮加入到6000份异丙醇中，震荡处理12h，时间到达后除去异丙醇，然后与1600份水和0.3份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.5，搅拌处理40min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用5h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为5％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用12h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为6mm的块状后，浸没入质量浓度为10％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用8h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为3mm的块状后，浸没入质量浓度为15％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为15W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理8min，就停止超声波处理5min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量13.7％，长度2-5mm的纤维含量为37.5％；比表面积4.9m2/g；热变性温度58.1℃；重金属含量3.2mg/kg，因此不满足作为生物医学材料的条件。
对比例4
(1)原料预处理
按重量份数计，将1000份牛皮加入到6000份异丙醇中，震荡处理12h，时间到达后除去异丙醇，然后与1600份水和0.3份DTM198酶混合，用Na2CO3调pH为9.5，搅拌处理40min，静置，每静置1小时需搅拌1min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用5h，作为微纤维胶原的原料。
(2)微纤维胶原的制备
将微纤维胶原的原料切碎为通径10mm的块状，浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用12h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为6mm的块状后，浸没入质量浓度为50％的1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用10h，作用时间到达后，离心处理取沉淀并洗涤，然后机械切割至通径为3mm的块状后，浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用8h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，在洗涤过程中伴随功率为15W超声波设备进行超声波处理，并每超声波处理8min，就停止超声波处理5min，重复4次，然后离心处理取沉淀并洗涤后备用。
(3)后处理
将分步离子液体处理所得冻干，并25kGy辐照灭菌，即得微纤维胶原。
经测定，所得微纤维胶原，长度1mm以下的纤维含量32.5％，长度2-5mm的纤维含量为21.6％；比表面积9.6m2/g；热变性温度57.8℃；重金属含量2.5mg/kg，因此不满足作为生物医学材料的条件。
Claims (10)
1.一种分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于制备步骤如下：
a.原料预处理：选择离体的哺乳动物真皮，并进行脱脂、脱毛处理，作为微纤维胶原的原料；
b.离子液体备料：选择配制至少3种质量浓度为5％-95％的离子液体，且所配制的任一离子液体的质量浓度与其它离子液体的质量浓度差绝对值不小于15％，其中离子液体选择纯品极性在ET(30)＝50-54kcal/mol范围内且熔点低于0℃的离子液体种类；
c.分步离子液体处理：按照离子液体极性从小到大或者从大到小的顺序，将微纤维胶原的原料依次分步放入上述顺序的离子液体中进行离子液体处理，其中每步离子液体处理分别为将微纤维胶原的原料或上一步离子液体处理所得中间产物浸没入该步所使用的离子液体中，于温度4-15℃下搅拌作用8-16h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤，作为下一步离子液体处理所使用的中间产物；最后一步离子液体处理为将上一步离子液体处理所得中间产物浸没入最后一步所使用的离子液体中，于温度4-15℃下搅拌作用8-16h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤后备用；
d.后处理：将分步离子液体处理所得进行包括冷冻干燥、灭菌的后处理，即得微纤维胶原。
2.根据权利要求1所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述原料预处理还包括在脱脂、脱毛处理后进行过氧化氢处理。
3.根据权利要求1所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述离子液体选择包括1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液、1-丁基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液、1-辛基-3甲基咪唑氯盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液、1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐溶液、1-丙基-3-甲基咪唑双亚胺盐溶液和1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐溶液中的一种或几种。
4.根据权利要求1-3任一项所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于所述原料预处理包括以下步骤：
按重量份数计，将1000份离体的哺乳动物真皮加入到5000-6000份异丙醇中，震荡处理10-12h，时间到达后除去异丙醇，然后与1500-1600份水和0.2-0.3份DTM198酶混合，用弱碱调pH至9.0-9.5，搅拌处理30-40min，静置，每静置1小时需搅拌1-2min，总计静置16h后过滤取固体产物，随后将固体产物加入到3000-3500份质量浓度为60g/L的过氧化氢中，作用4-5h。
5.根据权利要求1-3任一项所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述微纤维胶原的原料在浸没入离子液体前，是经过清净、以及处理为通径不大于10mm的块状。
6.根据权利要求5所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述分步离子液体处理中，随每步离子液体处理，还包括同时将每一步离子液体处理所得中间产物逐步处理减小体积，在进行最后一步离子液体处理前将上一步离子液体处理所得中间产物处理为通径2-3mm的块状。
7.根据权利要求6所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述离子液体备料为分别配制下述离子液体：质量浓度为70％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液，质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液，质量浓度为30％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液；
所述分步离子液体处理，为将微纤维胶原的原料先浸没入质量浓度为70％的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用15-16h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤；将洗涤所得浸没入质量浓度为50％的1-乙基-3-甲基咪唑二腈胺盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用12-13h，作用时间到达后，离心取沉淀并洗涤；然后将洗涤所得浸没入质量浓度为30％的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶液中，于温度4-15℃下搅拌作用9-10h，离心取沉淀并洗涤后备用。
8.根据权利要求7所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述离心取沉淀并洗涤，还包括在洗涤过程中伴随超声波处理。
9.根据权利要求8所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述超声波处理为采用功率为10-30w的超声波设备，并每超声波处理6-10min，就停止超声波处理4-7min，重复3-5次。
10.根据权利要求7所述分步利用离子液体的梯度极性制备微纤维胶原的方法，其特征在于：所述分步离子液体处理还包括将任一步离子液体处理所得加入去垢剂处理。
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