CN109260475A - 一种抗非小细胞肺癌的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗非小细胞肺癌的药物组合物，它由表皮生长因子受体‑酪氨酸激酶抑制剂、COX2抑制剂和TOPK抑制剂组成，该药物组合物能降低非小细胞肺癌对表皮生长因子受体‑酪氨酸激酶抑制剂的耐药性，能显著抑制耐药细胞的生长和增殖，促进细胞凋亡，且具有明显的协同作用，可用于晚期肺癌患者的治疗。

Description

一种抗非小细胞肺癌的药物组合物
技术领域
本发明属于制药领域，涉及抗非小细胞肺癌的药物组合物，尤其是一种对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂耐药的抗非小细胞肺癌的药物组合物。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small-celllung cancer,NSCLC)患者约占肺癌总数的85％-90％。我国每年男性肺癌患者新增病例和死亡人数均位居各种肿瘤的首位；女性新增病例仅次于乳腺癌，死亡率同样位居首位。因为胸部常规体检(胸片或透视)对NSCLC的早期检出率极低，而高检出率胸部螺旋CT不是我国绝大多数人群常规体检项目，所以至少40％的NSCLC患者初诊时已处于中晚期，失去了手术机会。因此，肺癌的防治重点在于早期诊断(胸部螺旋CT体检的普及)和晚期治疗的突破。晚期NSCLC的标准治疗为含铂双药联合化疗，因其严重的毒副反应使其疗效进入瓶颈时期，而且化疗药物对晚期NSCLC患者的疗效不佳(5年生存率15％左右)。肺癌给患者本人及家庭带来巨大痛苦，给社会造成巨大损失，寻求新的有效肺癌治疗方法迫在眉睫。
自上世纪80年代来，随着分子生物学深入研究，肿瘤信号通路研究迅速发展，NSCLC中基因位点突变被人们发现，并初步理解了这些突变的意义，分子靶向治疗随之兴起并成为治疗晚期NSCLC最具前景的研究领域。表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor tyrosine kinase,EGFR)-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)：厄洛替尼(Erlotinib)和吉非替尼(Gefitinib)被广泛用于晚期NSCLC的治疗。然而，患者对EGFR-TKIs治疗后产生耐药一直困扰着TKI的临床应用。TKI耐药包括原发性(首次使用不敏感)和继发性耐药(初期疗效好，6-12个月左右发生耐药)，对于EGFR-TKIs耐药机制的探索已成为国内外研究的热点。酪氨酸激酶受体(RTK)家族成员——MET的扩增和过表达是TKI耐药机理之一，约占继发性耐药的20％，原发性耐药的5％。因此，在EGFR-TKI耐药机制的研究中，MET是研究的重点之一，具有重大的社会意义。在NSCLC中，MET的调控机制尚不完全清楚，MET介导的TKI耐药信号通路有待深入阐明。
我们研究小组一直致力于肿瘤发生、肿瘤相关激酶及其抑制剂研究。并取得部分研究成果，如：1)在结肠癌中，发现环氧合酶2(COX2)可以通过AP-1上调EGFR表达水平[1]；2)Resveratrol直接结合并抑制COX2，进而抑制结直肠癌的发生[2]；3)COX2通过TXA2，而非PGE2，促进乳腺癌的发生[3]；4)酪氨酸蛋白激酶Src可在Y74位点磷酸化激活TOPK，增强其稳定性进而促进结肠癌的发生[4]；5)发现临床常用抗酸FDA药物——泮托拉唑(Pantoprazole)是TOPK抑制剂，可抑制结肠癌发生和生长[5]；6)发现头孢拉定[6]和芍药醇[7]靶向抑制TOPK，抑制日光性皮炎；7)TOPK在高级别胶质瘤中高表达，是胶质瘤诊断和预后潜在肿瘤标志分子[8]。
TOPK，又名PBK，是一种新的肿瘤相关的丝-苏氨酸蛋白激酶[9,10]。研究表明TOPK在乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肺癌、白血病、胶质瘤等多种肿瘤细胞中高表达，表达量与肿瘤恶性程度、侵袭转移和预后密切相关，在肿瘤的临床诊断以及预后预测中发挥了重要作用[11-15]。
由于肺癌分子病理分型复杂，关于特异性COX2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)对于肺癌的防治作用的研究结论是矛盾的。Gulyas M等研究认为Celecoxib对于NSCLC化疗无协同作用[16]，而Randall H等则认为Celecoxib对NSCLC预防有显著作用[17]，Komaki R等认为Celecoxib对于NSCLC的放疗具有增敏作用[18]，Li N等认为COX2可以促进EGFR的突变，联用Gefitinib与Celecoxib对于LREA缺失突变细胞系更有效[19]。
基于相关文献阅读和自身研究工作基础上，我们开展了克服肺癌对TKI耐药的机理研究。因EGFR、MET和Scr均属于酪氨酸激酶受体家族，我们推测三者在功能和调控方面可能具有一定程度的相似性，即：1)COX2可以调控EGFR，也很可能调控MET的表达；2)Src可以磷酸化激活TOPK，c-Met同样可能磷酸化激活TOPK。如果这些调控机制在肺癌中存在，会为解决Gefitinib耐药提供新的廉价解决方案，即联合应用已在临床广泛应用的抑制COX2和TOPK活性的药物，即可绕过直接针对MET抑制解除肺癌细胞对TKI的耐药。虽然针对EGFR和cMet等靶标的新抑制剂已在国外上市，但是药物昂贵，治疗成本过高，在中国绝大多数患者不能负担治疗费用。而Celecoxib(Cox2抑制剂)和泮托拉唑(TOPK抑制剂)的治疗成本大大降低。因此，研究COX2-MET信号通路在Gefitinib耐药的作用有较大的经济价值及社会意义，既可阐明肺癌在TKI治疗过程中产生耐药的分子机制，也为临床如何解决TKI靶向治疗耐药预测和治疗难题和降低患者经济压力及延长生存期提供新思路。
参考文献：
1.Li H,Zhu F,Boardman LA，et al.Aspirin Prevents Colorectal Cancer byNormalizing EGFR Expression.EBioMedicine.2015,2(5):447-455.
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3.Li H,Lee MH,Liu KD,et al.Inhibiting breast cancer by targeting thethromboxane A2 pathway.NPJ Precision Oncology,2017,1(1):1-8.
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发明内容
本发明的目的是提供一种治疗非小细胞肺癌的药物组合物，通过将表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂、COX2抑制剂和TOPK抑制剂三药联用，克服靶向治疗非小细胞肺癌药物——表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂所产生的耐药，降低晚期肺癌患者治疗成本。
本发明是在以下研究的基础上实现的：
采用在肺癌TKI耐药研究中常用的细胞模型——HCC827(Gefitinib敏感)和HCC827GR(Gefitinibb耐受)进行体内外研究。
1.发现了COX2上调MET的表达，促进NSCLC对吉非替尼的耐药。
1)COX2在吉非替尼耐药肺癌细胞株高表达：通过Western blot方法检测发现COX2在HCC827GR细胞中高表达。
2)COX2、MET在EGFR敏感激活突变的NSCLC患者肿瘤组织中高表达：通过IHC检测了153例EGFR敏感激活突变NSCLC患者肿瘤组织及其癌旁组织中COX2、MET的表达，结果发现COX2、MET在EGFR敏感激活突变的肿瘤组织中的表达高于癌旁组织(P<0.001)。
3)在吉非替尼耐药的HCC827GR细胞中，沉默COX2，抑制了MET表达，进而抑制耐药细胞生长和促进耐药细胞凋亡：建立稳定COX2基因沉默HCC827GR细胞系，通过细胞生长实验及凋亡分子的检测证实沉默COX2恢复了耐药的HCC827GR对吉非替尼的敏感性。
4)在吉非替尼敏感的HCC827细胞中，过表达COX2，促进MET的表达，导致细胞克隆形成能力增强，对吉非替尼产生耐受：建立了稳定表达COX2的HCC827细胞系，通过细胞生长、软琼脂克隆形成实验及凋亡分子的检测证实过表达COX2促进了HCC827对吉非替尼耐药。
5)COX2-TXA2信号通路活化，激活AP-1，促进MET表达，导致HCC827GR细胞对吉非替尼耐药：首先，通过Elisa方法检测了HCC827和HCC827GR细胞培养上清中COX2的代谢产物水平，结果发现HCC827GR细胞合成的TXA2明显升高(P<0.001)；其次，稳定表达COX2的HCC827细胞，TXA2水平高于HCC827细胞，而HCC827GR细胞沉默COX2后，TXA2水平下降；最后，在HCC827GR细胞中，给予COX2抑制剂(Celecoxib)、TXA2受体拮抗剂(Seratrodast)和TXA2合酶抑制剂(Ozagrel)处理，发现抑制COX2-TXA2信号通路抑制了AP-1的活性，降低了MET的表达水平，而在HCC827细胞，给予TXA2受体激动剂(U46619)后，增强了AP-1活性，促进了MET表达。
2.发现了MET和TOPK正反馈调节并促进NSCLC对吉非替尼耐药。
1)TOPK及p-TOPK(Y74)在吉非替尼耐药肺癌细胞株高表达：通过Western blot方法检测我们发现TOPK及p-TOPK(Y74)在HCC827GR细胞中高表达，与MET表达变化趋势一致。
2)TOPK在EGFR敏感激活突变的NSCLC患者肿瘤组织中高表达，且与MET表达相关：采用IHC检测了153例EGFR敏感激活突变NSCLC患者肿瘤组织及其癌旁组织中TOPK和MET的表达，结果发现TOPK在EGFR敏感激活突变的NSCLC患者组织中的表达高于癌旁组织(P<0.001),并且TOPK的表达与MET的表达显著相关(P<0.0001)。
3)体外激酶实验发现MET直接磷酸化修饰TOPK且MET自身活性进一步增强。
4)体外激酶实验发现MET磷酸化TOPK的Y74位点：首先，运用NetPhos 2.0软件分析TOPK潜在酪氨酸磷酸化位点，合成相应肽段进行体外激酶实验(肽谱磷酸化筛选)，发现MET磷酸化TOPK的Y74位点；其次，表达制备TOPK Y74位点失活突变蛋白，进行体外激酶实验，通过p-TOPK(Y74)抗体进一步证实MET在Y74位点磷酸化TOPK。
5)体外激酶实验发现TOPK反馈磷酸化激活MET：以活性的MET为激酶，无活性的TOPK为底物进行体外激酶实验，采用p-Tyrosine抗体检测MET的酪氨酸磷酸化水平，结果发现MET的酪氨酸磷酸化增强，表明MET活性增强，提示MET被TOPK反馈激活。
6)体外肽谱磷酸化筛选分析发现TOPK磷酸化修饰MET的S990、S1152和T977三个位点：运用NetPhos 2.0软件分析MET潜在丝/苏氨酸磷酸化位点，合成相应肽段进行体外激酶实验，发现MET的S990、S1152及T977位点可被活性的TOPK磷酸化修饰。
7)免疫共沉淀证明TOPK可以与MET在细胞内相互作用:首先TOPK抗体与beads共孵育结合，然后与HCC827GR细胞裂解液共孵育，免疫印迹检测结果显示TOPK可与MET相结合。
8)细胞内证明MET与TOPK相互磷酸化激活：首先，构建野生型MET、突变型MET(S990A/S1152A/T977A)、野生型TOPK、突变型TOPK(Y74F)、shMET和shTOPK表达质粒。其次，MET和TOPK质粒共转染293T细胞，发现：(1)p-TOPK(Y74)的水平呈MET剂量依赖性升高；(2)p-MET(Y1234/1235)的水平呈TOPK剂量依赖性升高；(3)过表达突变的MET(S990A/S1152A/T977A)，p-TOPK(Y74)的水平降低；(4)过表达突变的TOPKY74F，p-MET(Y1234/1235)的水平降低。再次，在HCC827细胞中分别建立稳定表达野生型MET、突变型MET(S990A/S1152A/T977A)、野生型TOPK和突变型TOPK(Y74F)细胞系，发现：野生型TOPK激活内源性MET，而突变型TOPK不能；野生型MET激活内源性TOPK，而突变型MET不能。最后，在HCC827GR细胞中分别沉默MET和TOPK，发现：沉默MET，p-TOPK(Y74)水平下降；沉默TOPK，p-MET(Y1234/1235)水平降低，MET活性下降。
9)发现MET-TOPK正反馈调节通路活化促进NSCLC对吉非替尼耐药：首先，在在HCC827GR细胞中沉默TOPK，发现：吉非替尼耐药的HCC827GR细胞生长减慢，凋亡增加，对吉非替尼敏感，即沉默TOPK逆转HCC827GR耐药。其次，在HCC827细胞中过表达野生型TOPK，细胞克隆形成能力增强，凋亡降低，对吉非替尼产生了耐受；而过表达Y74F突变型TOPK细胞，对吉非替尼的敏感性不受影响。再次，在HCC827细胞中过表达野生型MET，抑制细胞凋亡，对吉非替尼不敏感；而过表达突变型MET(S990A/S1152A/T977A)细胞,对吉非替尼的敏感性不受影响。
进而，为验证组合物对HCC827GR细胞耐药性的影响以及对非小细胞肺癌的疗效，进行了以下试验。
1.组合物抗耐药肿瘤细胞试验
1)通过细胞生长实验(MTT assay)确定塞来昔布、泮托拉唑及吉非替尼以加入后80％HCC827GR细胞存活的浓度。
2)MTT实验：联用塞来昔布、泮托拉唑和吉非替尼抑制了耐药细胞HCC827GR的生长。
3)软琼脂克隆形成实验：联用塞来昔布、泮托拉唑和吉非替尼显著抑制耐药细胞HCC827GR的克隆形成(P<0.001)。
4)细胞凋亡分子检测：联用塞来昔布、泮托拉唑和吉非替尼显著激活PARP，促进耐药细胞的凋亡。
以上结果表明，组合物克服了HCC827GR细胞对吉非替尼的耐药，能显著抑制耐药细胞的生长和增殖，促进细胞凋亡，且具有明显的协同作用。
2.组合物抗非小细胞肺癌动物试验
在移植瘤动物模型体内联用塞来昔布、泮托拉唑和吉非替尼，抑制了肿瘤的生长，克服了吉非替尼耐药。
所述吉非替尼、塞来昔布、泮托拉唑的重量比为2-6：1-5：5-20。
根据本发明的一个实施例，所述吉非替尼、塞来昔布、泮托拉唑的较佳重量比为4：3：10。
但是，本发明的保护范围不局限于实施例，其中，吉非替尼可以用其它表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂如厄洛替尼、阿法替尼及奥西替尼等进行替换；塞来昔布可以用其它COX2抑制剂如罗非昔布(rofecoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、帕瑞考昔(parecoxib)、依托考昔(etoricoxib)及罗美昔布(lumiracoxib)等进行替换；泮托拉唑可以用其它TOPK抑制剂如艾普拉唑(ilaprazole)、头孢拉定(Cefradine)、HI-032、OTS514及OTS964等进行替换，根据本发明前期的机理研究和发现，能够推断出采用上述药物替换以后同样能达到与实施例相同或相似的抗癌效果。
本发明具有如下优点：
1)首次发现COX2-TXA2-AP1信号通路上调节MET表达，促进HCC827对吉非替尼耐药。
2)首次发现MET与TOPK正反馈调节，促进HCC827对吉非替尼耐药。
3)首次发现COX2-MET-TOPK信号通路活化促进NSCLC对吉非替尼的耐药。
4)首次证明联用塞来昔布(COX2抑制剂)、泮托拉唑(TOPK抑制剂)和吉非替尼(EGFR靶向药)逆转HCC827GR对吉非替尼耐药。基于COX2/MET/TOPK信号通路，联合应用FDA批准药物，老药新用，克服吉非替尼耐药问题，同时大大降低治疗成本。
5)首次提出COX2、MET及p-TOPK(Y74)的表达可作为预测NSCLC患者对吉非替尼耐药的生物标志物，并可作为联合应用塞来昔布、泮托拉唑及吉非替尼的用药指标。
附图说明
图1：吉非替尼的浓度对HCC827GR细胞存活率的影响。
图2：塞来昔布的浓度对HCC827GR细胞存活率的影响。
图3：泮托拉唑的浓度对HCC827GR细胞存活率的影响。
图4：组合物对HCC827GR细胞生长能力的影响。
图5：组合物对HCC827GR细胞克隆形成能力的影响。
图6：组合物对HCC827GR细胞Cleaved PARP表达水平的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1组合物克服HCC827GR细胞对吉非替尼的耐药
1)通过细胞生长实验(MTT assay)确定塞来昔布、泮托拉唑及吉非替尼以加入后80％HCC827GR细胞存活的浓度。
将HCC827GR细胞消化计数，接种5×103个细胞于96孔板，24h后分别加入不同浓度吉非替尼(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM)、塞来昔布(0μM，0.16μM，0.8μM，4μM，20μM,100μM)和泮托拉唑(0μM，100μM，200μM，400μM，600μM，800μM，现配现用)，加药后24h、48h、72h后，通过MTT实验分析细胞活力。以80％HCC827GR细胞存活率作为联合用药安全浓度，即塞来昔布20μM；吉非替尼1μM；泮托拉唑100μM(见图1-3)。
2)MTT发观察联用塞来昔布、泮托拉唑和吉非替尼后HCC827GR的生长能力。
接种5×103HCC827GR细胞到96孔板，根据上述1)的安全药物浓度用量，将其分为8组：对照组(Control)；单药组：G1(吉非替尼1μM)；C20(塞来昔布20μM)；P100(泮托拉唑100μM)；二药联用组：G+C(吉非替尼1μM+塞来昔布20μM)；G+P(吉非替尼1μM+泮托拉唑100μM)；C+P(塞来昔布20μM+泮托拉唑100μM)；三药联用组(G+C+P)：吉非替尼1μM+塞来昔布20μM+泮托拉唑100μM。分别给药后检测24h、48h、72h和96h细胞活力。结果显示：作用72h后三联用药组细胞存活率为40％，作用96h后存活率约为20％，较对照组明显降低(P<0.001)(见图4)。说明塞来昔布、吉非替尼以及泮托拉唑三药联用显著抑制耐药细胞HCC827GR的生长，逆转吉非替尼耐药。
3)软琼脂克隆形成实验观察联用塞来昔布、泮托拉唑和吉非替尼后HCC827GR的克隆形成能力。
实验分组同2)，进行软琼脂克隆形成实验，每组设三个复孔。先将各不同组药物与含有10％FBS的浓度为0.5％低熔点琼脂糖胶的BME(基本培养基，sigma公司)混合后加入六孔板，每孔3ml，待凝固后形成底胶；然后将HCC827GR细胞加入到混合有不同组药物的含有10％FBS的胶浓度为0.33％的BME中，充分混匀，均匀滴加在对应底胶上(8000个细胞/每孔/1ml)，胶凝固后置于37℃，5％CO2培养箱培养5-10天，拍照，统计细胞克隆数，比较各组差异。
结果显示：与对照组相比，三药联用组克隆数明显减少(P<0.001)(见图5)，表明三药联用抑制了耐药细胞的克隆形成。
4)细胞凋亡分子检测：联用塞来昔布、泮托拉唑和吉非替尼显著激活caspase3，促进耐药细胞的凋亡。
实验分组同2)，HCC827GR细胞加入药物24h后，提取蛋白，Western Blot方法检测检测Cleaved PARP的表达，结果显示三联用药组Cleaved PARP的水平明显高于其它各组(P<0.001)(见图6)，表明三药联用促进了耐药细胞HCC827GR凋亡。
实施例2组合物抑制动物模型肿瘤的生长
将3只接种了HCC827GR细胞的NCG小鼠随机等分为治疗组(2只)和对照组(1只)两组，其中治疗组以每周三次吉非替尼40mg/kg+塞来昔布30mg/kg+泮托拉唑100mg/kg联合腹腔注射给药，对照组只给予空白载体，每周称重；从第14天开始，每两天测量肿瘤大小，给药2周后将裸鼠处死，量取肿瘤组织，测量实验组和对照组肿瘤块。在各测量天数，和对照组相比，治疗组的肿瘤体积显著缩小，提示肿瘤生长受到明显抑制。在实验终点，治疗组肿瘤体积平均值为111.04±32.02mm3,对照组肿瘤体积平均值为285.37±87.71mm3，缩小了61.1％(见表1)。
表1组合物抑制移植瘤动物模型中肿瘤生长
**,P<0.01，***,P<0.005。

Claims (6)

1.一种抗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于由表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂、COX2抑制剂和TOPK抑制剂组成，该药物组合物能降低非小细胞肺癌对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。
2.如权利要求1所述的抗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于：所述表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂、COX2抑制剂、TOPK抑制剂的重量比为2-6：1-5：5-20。
3.如权利要求1所述的抗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于：所述表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂、COX2抑制剂、TOPK抑制剂的重量比为4：3：10。
4.如权利要求1-3任何一项所述的抗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于：所述表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼。
5.如权利要求1-3任何一项所述的抗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于：所述COX2抑制剂为塞来昔布。
6.如权利要求1-3任何一项所述的抗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于：所述TOPK抑制剂为泮托拉唑。
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